陳汝 冉昆 薛曉敏 王金政

摘要：以紅富士蘋果為試驗材料，在煙臺、威海、臨沂、泰安等山東蘋果主產(chǎn)區(qū)采集成熟健康的紅富士蘋果，采用稀釋分離法從蘋果樣品果面分離純化得到酵母菌株;依據(jù)核糖體26S D1/D2區(qū)核苷酸序列的比較結(jié)果，并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，得出酵母菌的分類地位，并對紅富士果實表面酵母菌的多樣性進行系統(tǒng)進化分析。結(jié)果表明，紅富士果實表面蘊含豐富的酵母菌資源，分離得到163株酵母菌菌株，經(jīng)鑒定屬于13屬20種;在分離得到的菌株中，子囊菌占優(yōu)勢，共分離到95株子囊菌酵母，屬于6屬10種，占酵母總數(shù)的58.3%;共分離得到53株擔(dān)子菌酵母，屬于6屬9種，占酵母總數(shù)的32.5%;其余15株酵母為普魯蘭短梗霉（Aureobasidium pullulans）等，占酵母總數(shù)的9.2%。由研究結(jié)果得出，紅富士果實表面酵母菌的優(yōu)勢屬為畢赤酵母屬（Pichia）（3種）、假絲酵母屬（Candida）（3種）、隱球酵母屬（Cryptococcus）（3種），占總酵母種數(shù)的45%。

關(guān)鍵詞：紅富士蘋果;酵母菌;多樣性;系統(tǒng)進化分析

中圖分類號： S182 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0134-05

蘋果（Malus domestica Borkh.）是山東省規(guī)模最大、競爭力最強的優(yōu)勢果品產(chǎn)業(yè)，其中晚熟蘋果品種紅富士占山東省栽培蘋果品種的70%。在蘋果生產(chǎn)過程中，其病蟲害防治問題在很大程度上制約著蘋果產(chǎn)業(yè)的優(yōu)質(zhì)、高效及可持續(xù)發(fā)展[1-2]。蘋果在生長期及貯藏期因病原菌侵染而造成果實腐爛，損失巨大。作為控制植物病害首選的化學(xué)殺菌劑，存在農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染及病原菌抗藥性等弊端[3-4]。酵母菌具有抗逆性強、耐貧瘠、繁殖快、不產(chǎn)生毒素等優(yōu)點，因而被廣泛用于植物病害生物防治研究中，具有巨大的應(yīng)用前景[5-7]。拮抗酵母菌[8]單獨或與水楊酸[9]、甜菜堿[10-11]、幾丁質(zhì)[12]及氯化鈣[13]等結(jié)合能有效抑制植物病害。

近年來的研究結(jié)果表明，果園生態(tài)環(huán)境中含有豐富的酵母菌資源，酵母菌在系統(tǒng)發(fā)育上呈現(xiàn)多樣性，直接的分離源包括水果表面、葉面及土壤[14-15]。Teixido等對“金色美味”蘋果園的微生物群落進行研究發(fā)現(xiàn)，其主要的微生物群為真菌[枝孢屬（Cladosporium）、鏈格孢屬（Alternaria）和酵母（yeasts）][16]。鮮食水果表面分布著大量酵母菌群，如假絲酵母屬（Candida）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）、克勒克酵母屬（Kloeckera）、克魯維酵母屬（Kluyveromyces）、畢赤酵母屬（Pichia）、紅酵母屬（Rhodotorula）、釀酒酵母屬（Saccharomyces）及接合酵母屬（Zygosaccharomyces）[17-18]。獲得高效拮抗酵母菌的首選方法是從與病原菌具有同一生境并且適應(yīng)能力強、能夠有效定殖的酵母菌中進行篩選[19-21]。蘋果園這個特定生態(tài)環(huán)境中富含大量酵母菌種資源[22]，從中挖掘出的酵母新菌種[23]有待進一步開發(fā)利用。本研究從山東省蘋果主產(chǎn)區(qū)采集的健康紅富士果實表面分離、鑒定并保藏酵母菌種，分析紅富士果實表面酵母菌的多樣性，可為蘋果生長期及貯藏期病害的生物防治提供菌種資源，對蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以紅富士蘋果為試驗材料，于2016年10月下旬在山東煙臺（棲霞、蓬萊、萊州、招遠）、威海（文登、榮成）、臨沂（蒙陰、沂水）、泰安（肥城、新泰）等山東蘋果主產(chǎn)區(qū)隨機挑選生長狀況及管理水平基本一致并且處于盛果期的紅富士蘋果園，分別采集成熟健康的紅富士蘋果，共采集紅富士蘋果樣品50份（每份包含15個蘋果，每個蘋果單獨用保鮮袋密封）。采后的蘋果用保鮮盒保存，運輸?shù)綄嶒炇液罅⒓催M行酵母菌的分離。

1.2 酵母菌株的分離與保藏

采用稀釋分離法從不同來源的成熟健康的蘋果果實表面分離純化得到酵母菌株[22]。稱取1 g蘋果果皮放入50 mL三角瓶中，加入10 mL液體富集培養(yǎng)基（含有10.0 g/L酵母浸粉、20.0 g/L蛋白胨、20.0 g/L葡萄糖、200 μg/mL氯霉素），搖勻，于25 ℃、150 r/min培養(yǎng)2 d后，稀釋涂酵母膏胨葡萄糖瓊脂（YPD）平板（含200 μg/mL氯霉素）。設(shè)5個蘋果為1次重復(fù)，共重復(fù)3次。將涂布均勻的YPD平板置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，根據(jù)菌落形態(tài)特點挑取大小、顏色、形態(tài)不同的菌落，純化后轉(zhuǎn)接至斜面。根據(jù)Yarrow的方法[24]對菌落質(zhì)地、顏色、邊緣和表面特征等進行形態(tài)學(xué)的初步歸類。將純化后的酵母菌活化后4 ℃短期保存，或置于20%甘油管中，于-80 ℃冰箱中保存待用。

1.3 酵母菌的鑒定

DNA的提取參照Makimura等的方法[25]進行。核糖體26S D1/D2區(qū)核苷酸序列擴增[26]的引物序列為NL1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′;NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′。25 μL PCR反應(yīng)體系：2.50 μL 10×PCR buffer（2.5 mmol/L，含Mg2+），2.00 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.50 μL NL1（10 μmol/L），0.50 μL NL4（10 μmol/L），0.75 μL DNA模板，0.25 μL（5 U/μL）Taq酶，18.50 μL滅菌水。PCR擴增反應(yīng)在BIO-RAD S1000TM PCR擴增儀上進行。PCR擴增程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 45 s，51 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán);72 ℃ 10 min，4 ℃ 保存。將PCR產(chǎn)物進行電泳檢測、回收純化后送至鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將所測菌株的26S D1/D2區(qū)核苷酸序列提交至GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），進行BLAST分析，與相關(guān)序列進行同源性比較，選取與試驗菌株親源關(guān)系較近的菌株，用Clustal X軟件進行多重序列比對[27]，用MEGA 5.1軟件中的鄰接法（neighbor-joining，簡稱N-J）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進行系統(tǒng)進化分析，自展檢驗重復(fù)1 000次[28]。用Bio-Dap計算各樣點酵母菌的Shannon多樣性指數(shù)[29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅富士蘋果果實表面酵母菌類群數(shù)量分布

由表1可知，從山東煙臺、威海、臨沂、泰安等盛果期蘋果園采集的成熟紅富士蘋果表面蘊含豐富的酵母菌資源，共分離得到163株酵母菌菌株。進一步結(jié)合表型特征的觀察和生理生化特性，在 GenBank 中通過數(shù)據(jù)比對確定酵母菌株的分類地位。結(jié)果表明，分離的酵母菌屬于短梗霉屬（Aureobasidium）、隱球酵母屬、假絲酵母屬、Dioszegia、地霉屬（Galactomyces）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、梅拉酵母屬（Meira）、梅奇酵母屬（Metschnikowia）、畢赤酵母屬、紅酵母屬、釀酒酵母屬、鎖擲酵母屬（Sporidiobolus）、擲孢酵母屬（Sporobolomyces）等13屬的20種。優(yōu)勢屬為畢赤酵母屬（3種）、假絲酵母屬（3種）、隱球酵母屬（3種），其種數(shù)共占酵母總種數(shù)的45%。

由表1還可以看出，從煙臺地區(qū)蘋果樣品表面共分離到63株酵母菌（11屬18種），從威海地區(qū)蘋果樣品表面共分離到40株酵母菌（10屬15種），從臨沂地區(qū)蘋果樣品表面共分離到28株酵母菌（12屬14種），從泰安地區(qū)蘋果樣品表面共分離到32株酵母菌（12屬14種）。其中，普魯蘭短梗霉（Aureobasidium pullulans）、金黃隱球酵母（Cryptococcus aureus）、橘假絲酵母（Candida quercitrusa）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）、黏紅酵母（Rhodotorula glutinis）及釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等8種的酵母菌在以上4個地區(qū)的蘋果樣品中均有分布。對以上4個地區(qū)蘋果樣品的酵母菌群落多樣性進行分析的結(jié)果表明，不同地區(qū)蘋果樣品上酵母菌的多樣性存在差異，其中煙臺地區(qū)蘋果樣品的酵母菌多樣性指數(shù)最高，為2.76。

2.2 分離酵母菌株的系統(tǒng)進化分析

選擇有代表性的酵母菌株，將其基因序列提交GenBank，獲得登錄號（表1）后進行系統(tǒng)進化分析。

由圖1可以看出，從紅富士果實表面分離到的酵母菌主要分布于擔(dān)子菌（Basidiomycetous）、子囊菌（Ascomycetous）及類酵母（Yeast-like）等三大類中。在紅富士果實表面分離的酵母菌中，子囊菌酵母占優(yōu)勢，共分離到95株，占總酵母總數(shù)的58.3%，屬于6屬10種，分別為Candida gelsemii、間型假絲酵母（Candida intermedia）、橘假絲酵母、白地霉（Galactomyces geotrichum）、葡萄汁有孢漢遜酵母、美極梅奇酵母、卡里比克畢赤酵母（Pichia caribbica）、克魯維畢赤酵母、膜醭畢赤酵母（Pichia membranifaciens）、釀酒酵母;共分離到53株擔(dān)子菌酵母，占總酵母總數(shù)的32.5%，屬于6屬9種，分別為金黃隱球酵母、淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）、大隱球酵母（Cryptococcus magnus）、Dioszegia zsoltii、梅拉酵母（Meira argovae）、黏紅酵母、鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）、擲孢酵母（Sporobolomyces foliicola）、云南擲孢酵母（S. yunnanensis）;分離到普魯蘭短梗霉（Aureobasidium pullulans）等類酵母15株，占總酵母數(shù)的9.2%。

3 討論與結(jié)論

酵母菌在自然界廣泛存在，水果表面附著了具有代表性的酵母菌群，其他的分離源包括葉片、根系、土壤及海水[6，30]。紅富士果實表面含有大量酵母菌種資源，本研究從山東省蘋果主產(chǎn)區(qū)盛果期蘋果園采集的成熟紅富士蘋果表面分離得到163株酵母菌株，分別鑒定為短梗霉屬、隱球酵母屬、假絲酵母屬、Dioszegia、地霉屬、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、梅拉酵母屬、梅奇酵母屬、畢赤酵母屬、紅酵母屬、釀酒酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬等13屬的20種。其中，擲孢酵母屬、紅酵母屬及隱球酵母屬等屬的酵母菌同樣也能在巴西的蘋果上分離到[31]。同樣的，假絲酵母屬、隱球酵母屬、有孢漢遜酵母屬、梅奇酵母屬、畢赤酵母屬、紅酵母屬等屬的酵母菌在葡萄牙南部的鮮切蘋果上有大量分布[32]。

由于氣候、土壤和管理方式等不同，即使是同一品種上分布的酵母菌群組成也各不相同，優(yōu)勢菌

種的類型也不相同[33-34]，從有機蘋果園中分離到的酵母菌數(shù)量要高于從傳統(tǒng)蘋果園中分離到的數(shù)量[31]。在同一生境的不同位點，酵母菌群的分布也不完全一致[35]。山東省蘋果主產(chǎn)區(qū)不同地區(qū)紅富士果實表面的酵母菌群分布及多樣性指數(shù)存在差異，僅普魯蘭短梗霉、金黃隱球酵母、橘假絲酵母、葡萄汁有孢漢遜酵母、美極梅奇酵母、克魯維畢赤酵母、黏紅酵母及釀酒酵母等8種酵母菌在4個地區(qū)的樣品中均有分布。其中普魯蘭短梗霉、葡萄汁有孢漢遜酵母、美極梅奇酵母、黏紅酵母在意大利北部果園的紅富士和金帥果實表面也有分布[15]。不同地區(qū)的紅富士果園酵母菌種構(gòu)成存在明顯差異，但子囊菌酵母均占較大優(yōu)勢[22]。本研究從紅富士果實表面共分離得到6屬10種子囊菌酵母95株（占58.3%），共分離到6屬9種的擔(dān)子菌酵母53株（占32.5%），其余為普魯蘭短梗霉等類酵母15株（占9.2%）。由此可見，紅富士果實表面酵母菌中同樣是子囊菌酵母占優(yōu)勢。

酵母菌的拮抗機制主要有營養(yǎng)與空間競爭、直接寄生作用和誘發(fā)寄主抗病性等[6-7]。前人研究表明，卡里比克畢赤酵母、美極梅奇酵母、黏紅酵母等能有效抑制蘋果果實病害[6，10，36-37]。葡萄汁有孢漢遜酵母廣泛用于草莓[38-39]、葡萄[9]、橘子[40]等采后病害的生物防治。普魯蘭短梗霉主要的拮抗機制是產(chǎn)生胞外多糖（EPS）及水解酶等抑制病原菌[41]，還可通過營養(yǎng)和空間競爭有效抑制桃采后褐腐病的發(fā)生[42]。本研究同樣從蘋果果實表面獲得了以上有效拮抗植物病源菌的酵母菌種，為后期拮抗酵母菌的篩選提供了大量菌種資源，但酵母菌對蘋果病害的生防機制還有待于進一步研究。

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