王若誠,辛 瑜,張 梁

(江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無錫 214122)

抗生素的廣泛應(yīng)用拯救了無數(shù)生命,然而過度依賴抗生素導(dǎo)致藥物殘留與細(xì)菌耐藥性問題日益嚴(yán)重[1-2],傳統(tǒng)大分子抗生素開發(fā)逐漸停滯[3]。因此,尋找抗生素替代品成為社會(huì)發(fā)展與科技進(jìn)步的必要方向?？咕?antimicrobial peptide,AMPs)作為生物先天免疫的第一道重要防線[4-5]逐漸進(jìn)入大家的視野。作為小分子抗菌物質(zhì)[6],抗菌肽作用機(jī)制多樣[7],可以參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)[8],具有抗氧化[9]與降血壓[10]作用。

鱟是一種生活在海洋中的大型節(jié)肢動(dòng)物,從奧陶紀(jì)出現(xiàn)至今已有4億多年的歷史[11]。鱟素作為鱟血細(xì)胞中的陽離子抗菌肽[12],對(duì)細(xì)菌與真菌均具有抑菌活性[13-14]。此外,研究表明鱟素還可以抗病毒[15]、抑制腫瘤細(xì)胞增殖[16]和誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化[17]。鱟素Tachyplesin Ⅰ(TP1)由17個(gè)氨基酸殘基組成,兩個(gè)β-折疊通過β-轉(zhuǎn)角連接在一起,疏水的氨基酸殘基定位于平面一側(cè),分子中6個(gè)陽離子氨基酸殘基主要分布在分子的尾部[18]。Edwards利用氨基酸殘基修飾調(diào)節(jié)重組肽所帶電荷和疏水性,以評(píng)估鱟素及其類似物對(duì)于耐藥菌的抑菌活性[19];Woodbum等將RP557與鱟素抗菌肽共同使用,降低傷口感染風(fēng)險(xiǎn)[20];Vernen等研究發(fā)現(xiàn)鱟素與癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的結(jié)合能力,可以幫助化療藥物靶向針對(duì)癌細(xì)胞[21]。這些研究說明鱟素在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景與巨大經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前,抗菌肽主要通過生物提取、化學(xué)合成和基因工程3種方法獲取。從生物體內(nèi)分離純化抗菌肽,公眾接受度高但步驟繁瑣,產(chǎn)率較低。鱟作為珍貴的海洋生物,數(shù)量稀少,從鱟血細(xì)胞中直接提取不能滿足大量制備的需求[22]。而利用化學(xué)方法固相合成,產(chǎn)物純度可得到保障,但價(jià)格極其昂貴,無法滿足工業(yè)化應(yīng)用。利用基因工程技術(shù)來生產(chǎn)鱟素,能夠減少環(huán)境負(fù)擔(dān),大幅降低鱟素獲取成本[23],為鱟素的理論研究與工業(yè)化應(yīng)用創(chuàng)造良好環(huán)境。

本研究選用大腸桿菌作為宿主細(xì)胞,為降低目的抗菌肽對(duì)宿主菌的殺傷作用,將鱟素抗菌肽與硫氧還蛋白標(biāo)簽以可溶形式進(jìn)行融合表達(dá)。并對(duì)經(jīng)過蛋白純化和羥胺切割獲得的重組TP1蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和抑菌活性表征,為鱟素工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

質(zhì)粒pET-32a(+)、大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109、大腸桿菌BL21(DE3)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) 本實(shí)驗(yàn)室保藏;限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ/HindⅢ、預(yù)染蛋白Marker Page Ruler Prestained Protein Ladder 美國Thermo公司;T4DNA連接酶 大連Takara公司;2×TaqMaster Mix、2×PfuMaster Mix 杭州寶賽生物科技有限公司;質(zhì)粒DNA小量提取、DNA片段純化、DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司;氨芐青霉素(Ampicillin,Amp) 美國INALCO公司;異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG) 上海生工生物工程有限公司;蛋白胨、酵母提取物 英國OXOID公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

S100D型PCR儀、Chemi Doc凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司;DYY-6C 核酸電泳儀 北京六一儀器廠;Pico17高速離心機(jī) 美國Thermo Fisher Scientific公司;MLS-3750型全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋 日本SANYO公司;HYL-C 型組合式搖床 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;UV-3200型紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;Sonic VCX-750型超聲波細(xì)胞破碎儀 南京新辰生物科技有限公司;SCG蛋白純化系統(tǒng) 蘇州賽譜儀器有限公司;MALDI SYNAPT MS超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Waters公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 目的基因的獲得 參考NCBI數(shù)據(jù)庫中鱟素抗菌肽Tachyplesin Ⅰ(TP1)的全長cDNA序列(GenBank登錄號(hào):P14213.2),根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性對(duì)編碼其成熟肽進(jìn)行密碼子優(yōu)化,交由上海生工生物工程有限公司合成。將TP1基因序列克隆在pUC57質(zhì)粒上,命名為pUC57-TP1。以質(zhì)粒pUC57-TP1為模板,設(shè)計(jì)正向引物F1:5′-CGGGATCC AACGGCAAATGGTGCTTTCGCG-3′,反向引物R1:5′-CCAAGCTTTCATTAGCCGTTGCGGCA GCGGCGATA-3′,下劃線依次BamH Ⅰ、羥胺切割位點(diǎn)和HindⅢ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。利用PfuDNA高保真聚合酶擴(kuò)增TP1基因片段。

1.2.2 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物純化后使用BamH I與Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)過純化后與同樣雙酶切純化后的pET-32a片段按摩爾比(5∶1)用 T4DNA連接酶16 ℃連接過夜,連接產(chǎn)物即pET-32a-TP1。表達(dá)設(shè)計(jì)框架為:TrxA+羥胺切割位點(diǎn)(aacggc)+TP1目的抗菌肽。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞并過夜培養(yǎng),挑取菌落為模板,以F1和R1為引物,通過菌落PCR與酶切驗(yàn)證目的片段是否連接到目的載體上,將篩選得到的陽性轉(zhuǎn)化子送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.3 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將鑒定正確的pET32a-TP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中,在含有100 μg/mL氨芐的LB培養(yǎng)基中,分別在37、30、25 ℃下,200 r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期時(shí)(OD600=0.6),加入終濃度1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),發(fā)酵結(jié)束后12000 r/min,4 ℃離心10 min收集菌體重懸于磷酸鹽緩沖液中,洗滌3次在冰浴中進(jìn)行超聲破碎,功率為400 W,共15 min(工作1 s,間隔2 s)。然后在4 ℃下12000 r/min離心20 min,分別收集上清與沉淀,通過15% SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況。

1.2.4 目的蛋白純化 將誘導(dǎo)后離心收集的菌體經(jīng)PBS緩沖液洗滌2次,超聲破碎后離心收集上清,將樣品通過HisTrap FF親和層析凝膠柱進(jìn)行純化。進(jìn)樣前,利用50 mL平衡緩沖液(500 mmol/L NaCl、20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L 咪唑,pH7.4)平衡柱子。進(jìn)樣后,用5～10倍體積的洗脫緩沖液(500 mmol/L NaCl、20 mmol/L Na2HPO4、500 mmol/L咪唑,pH7.4)洗脫,收集洗脫峰的洗脫液。

1.2.5 羥胺切割與產(chǎn)物質(zhì)譜鑒定 將1.2.4中收集到的洗脫液注入透析袋中,用磷酸鹽緩沖液(pH7.4)透析過夜以除去高濃度咪唑。透析后樣品12000 r/min離心20 min收集得到的上清液凍干后,加入羥胺切割液(200 mmol/L Tris,2 mol/L鹽酸羥胺,pH9.0)中,在45 ℃條件下反應(yīng)4 h[24]。切割獲得的產(chǎn)物利用透析袋進(jìn)行脫鹽處理。然后將樣品利用冷凍干燥儀進(jìn)行濃縮。使用LC-MS TOF超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)濃縮樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè),以鑒定切割產(chǎn)物成分。

色譜條件:液相系統(tǒng):Waters ACQUITY UPLC;色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1×150 mm,1.7 μm);柱溫:45 ℃;流動(dòng)相A:乙腈;流動(dòng)相B:0.1%甲酸;流速0.30 mL/min;總分析時(shí)間15.00 min;進(jìn)樣體積:5.0 μL。

質(zhì)譜條件:質(zhì)譜系統(tǒng):Waters SYNAPT MS檢測(cè)儀;軟件:Waters Masslynx V4.1質(zhì)譜工作站;離子源:ESI電離源;電離模式:ESI+;掃描m/z范圍:20～2000;毛細(xì)管電壓:3.5 kV;錐孔電壓:20 V;離子源溫度:100 ℃;脫溶劑氣溫度:400 ℃;脫溶劑氣流量:700 L/h;錐孔氣流量:50 L/h。

1.2.6 重組TP-1的抑菌活性檢測(cè) 用瓊脂孔擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)對(duì)重組表達(dá)的鱟素抗菌肽TP1檢測(cè)抑菌活性。將金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌分別培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(OD600=0.4～0.6),利用滅菌后的PBS溶液,將菌液濃度稀釋至5×105CFU/mL。將無菌LB固體培養(yǎng)基冷卻至50 ℃,按照1%的比例接種指示菌,混勻后傾注平板。等平板凝固后用打孔器進(jìn)行打孔,分別標(biāo)記數(shù)字1、2、3、4、5。1號(hào)孔加入化學(xué)合成的TP1(40 mg/L),2號(hào)孔加入Trxa-TP1融合蛋白(40 mg/L),3號(hào)孔切割后的TP1重組蛋白(40 mg/L),4號(hào)孔加入10 mg/mL氨芐青霉素,5號(hào)孔加入滅菌后的PBS溶液。每孔上樣50 μL液體,37 ℃靜置培養(yǎng)過夜,觀察抑菌圈情況。

最小抑菌濃度的測(cè)定:將處于對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌稀釋至104～105CFU/mL,取1 mL菌液和10 μl不同濃度的重組TP1加入到EP管中,以PBS緩沖液作陰性對(duì)照,37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)3 h,測(cè)菌液的OD600,以吸光度值無變化處所對(duì)應(yīng)的TP1濃度為最小抑菌濃度(MIC)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究中涉及的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容均重復(fù)3次;應(yīng)用Waters Masslynx V4.1軟件分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)與Adobe Illustrator CC2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的抗菌肽TP1基因獲得

TP1基因的開放閱讀框編碼的氨基酸序列為KWCFRVCYRGICYRRCR,該基因編碼的抗菌肽長度為17個(gè)氨基酸殘基。以重組質(zhì)粒pUC57-TP1為模板,通過PCR擴(kuò)增獲得目的基因,其凝膠電泳結(jié)果如圖1所示,在3%瓊脂糖凝膠電泳上可以看到大小約為80 bp的清晰條帶,與目的片段大小一致。

圖1 TP1基因的克隆

2.2 鱟素TP1原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

對(duì)構(gòu)建的pET32a-TP1表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,雙酶切后出現(xiàn)兩條特異性條帶,其中小片段與TP1大小一致,另一條帶與雙酶切后的pET-32a大小相同,結(jié)果如圖2所示,表明基因TP1已經(jīng)成功連接到pET-32a載體上。提取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞,篩選獲得重組菌。由于目的抗菌肽TP1對(duì)于宿主大腸桿菌可能存在一定的殺傷作用,為提高目的抗菌肽的產(chǎn)量,利用TrxA蛋白融合標(biāo)簽與目的抗菌肽融合表達(dá),以此降低TP1的毒性,保護(hù)宿主菌生長。后期再通過羥胺裂解液分離TrxA蛋白與目的抗菌肽,釋放TP1的抑菌活性。

圖2 pET32a-TP1重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

2.3 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

結(jié)果如圖2顯示,在37 ℃培養(yǎng)條件下的菌體破碎上清中,20 kDa左右處有明顯特異表達(dá)的蛋白條帶,與預(yù)期的TrxA-TP1融合蛋白的大小基本一致,表明融合蛋白成功表達(dá)并以可溶形式存在。

2.4 融合蛋白TrxA-TP1的純化

收集菌體超聲破碎后的上清,使用HisTrap FF柱進(jìn)行分離純化。將洗脫緩沖液洗脫后獲得后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè),結(jié)果如圖3所示,進(jìn)樣流出部分無目的蛋白析出,說明目的蛋白與鎳柱有效結(jié)合;當(dāng)洗脫液中咪唑濃度為100 mmol/L時(shí),剩余雜蛋白充分洗脫;當(dāng)洗脫液中咪唑濃度為200 mmol/L時(shí),大量目的蛋白析出,SDS-PAGE分析顯示為單一條帶,大小約為20 kDa。結(jié)果表明利用鎳柱純化后能夠獲得純度較高的TrxA-TP1融合蛋白。

圖3 TrxA-TP1融合蛋白的SDS-PAGE分析

2.5 融合蛋白的切割與質(zhì)譜鑒定

將純化后的TrxA-TP1融合蛋白進(jìn)行羥胺切割,經(jīng)過除鹽與濃縮處理后利用LC-MS TOF對(duì)切割產(chǎn)物進(jìn)行分析。結(jié)果如圖4所示,切割產(chǎn)物分子質(zhì)量為2330.55 u,與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。根據(jù)上述結(jié)果以及SDS-PAGE分析,表明了重組菌BL21-pET32a-TP1能夠成功表達(dá)TrxA-TP1融合蛋白,且可以利用羥胺切割的方法將TrxA蛋白與目的抗菌肽TP1分開,從而能夠獲得單一的TP1重組蛋白。

圖4 純化后的融合蛋白TrxA-TP1的SDS-PAGE分析

2.6 重組TP1的抑菌活性檢測(cè)

為了檢測(cè)羥胺切割后重組TP1的抗菌活性,以氨芐青霉素為陽性對(duì)照,滅菌后的PBS溶液為陰性對(duì)照,使用金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌作為實(shí)驗(yàn)菌,利用瓊脂糖孔擴(kuò)散法對(duì)獲得的重組TP1蛋白的抗菌活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖5所示,通過對(duì)抑菌圈大小與透明程度進(jìn)行比較,表明TrxA-TP1融合蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌均不具有抑菌活性,而切割后獲得的重組蛋白TP1對(duì)這兩種菌均具有抑菌活性。由此表明了TP1蛋白與TrxA蛋白融合表達(dá)后,利用羥胺切割可以獲得具有抗菌活性的單一TP1重組蛋白。通過液體抑制測(cè)定法確定了重組TP1對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別為6和10 mg/L。

圖5 重組TP1的質(zhì)譜分析

圖6 重組TP1的抑菌效果檢測(cè)

3 討論與結(jié)論

本研究成功利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)鱟素TP1進(jìn)行了高效表達(dá)。在菌體破碎液上清中,檢測(cè)到重組融合蛋白的條帶大小約為20 kDa,表明TrxA-TP1融合蛋白在大腸桿菌中以可溶形式進(jìn)行了融合表達(dá)。融合蛋白經(jīng)過鎳柱純化,能夠獲得條帶較為單一的融合蛋白,純化后的樣品利用羥胺裂解液進(jìn)行切割后,質(zhì)譜分析證明了羥胺切割后能夠成功的將TrxA蛋白標(biāo)簽與鱟素TP1抗菌肽分開,從而獲得單一的TP1抗菌肽。后期抑菌活性實(shí)驗(yàn)表明,融合蛋白TrxA-TP1對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌沒有明顯的殺傷作用,而裂解后獲得的單一的重組TP1單體蛋白對(duì)這兩種菌均具有明顯抑菌活性。

迄今為止,已有許多研究人員在不同宿主中成功表達(dá)抗菌肽[25]。大腸桿菌作為目前應(yīng)用最為廣泛的表達(dá)系統(tǒng)[26],具有在短時(shí)間內(nèi)表達(dá)水平高和成本低廉等優(yōu)點(diǎn),非常適用于規(guī)?；a(chǎn),有望使抗菌肽成為幫助人類抵御疾病的新型藥物。許多利用大腸桿菌重組表達(dá)的抗菌肽,如擬穴青蟹抗菌肽[27]與PlnF抗菌肽[28]都以包涵體形式存在。然而包涵體后續(xù)處理繁瑣且復(fù)性后目的蛋白可能喪失活性[29]。本文選取TrxA蛋白標(biāo)簽與鱟素TP1抗菌肽進(jìn)行融合表達(dá),不僅促進(jìn)融合蛋白的可溶性表達(dá),更降低了重組TP1對(duì)于宿主大腸桿菌的殺傷作用,提高了融合蛋白的表達(dá)量,為鱟素抗菌肽的大規(guī)模生產(chǎn)與其他抗菌肽的重組表達(dá)提供了一定理論依據(jù)。