李 恒,鄭曉燕,鄭麗麗,楊 旸,校 導(dǎo),艾斌凌,潘永貴,盛占武,*

(1.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,海南?？?570228;2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站,海南?？?570102;3.?？谑邢憬渡飳W(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南?？?570102)

油茶(Camelliaoleifera Abel)又名茶子樹(shù),屬于山茶(Camellia)科山茶屬山茶亞屬油茶組,是世界四大木本油料植物之一,主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域及以南地區(qū),是我國(guó)特有的食用油料樹(shù)種[1]。油茶籽餅粕作為油茶榨完油后的副產(chǎn)物,含有茶皂素、多糖、蛋白質(zhì)等多種功能成分,具有較高的利用價(jià)值[2]。茶皂素(Tea Saponin)又名茶皂甙,是存在于山茶科植物中的一類(lèi)齊墩果烷型三萜類(lèi)皂苷混合物[3],不僅具有天然的表面活性作用,還有抑菌、殺蟲(chóng)、抗癌等功效[4-7],可應(yīng)用于飼料、醫(yī)藥和日化等方面[8-10]。

蒸汽爆炸(SE)是目前公認(rèn)的處理農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物高效、清潔的技術(shù)之一,近年來(lái)在活性化合物提取中不斷創(chuàng)新[11]。蒸汽爆破技術(shù)的原理是將原料置于高溫高壓環(huán)境中,利用過(guò)熱飽和蒸汽對(duì)物料進(jìn)行處理,使原料孔隙中充滿(mǎn)蒸汽,然后瞬間釋放高壓,使原料孔隙中的飽和蒸汽急劇膨脹而發(fā)生爆破,原料細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被破壞而形成微孔,從而使小分子物質(zhì)從細(xì)胞中釋放出來(lái)[12]。魏錦錦等[13]運(yùn)用汽爆技術(shù)使得黃酮和綠原酸的得率從7.63和0.25 mg/g 顯著提高到了26.83 和1.22 mg/g;張棋等[14]運(yùn)用汽爆技術(shù)處理后總黃酮提取量是未經(jīng)預(yù)處理粉葛提取量的2.32倍;靳羽慧等[15]運(yùn)用汽爆技術(shù)預(yù)處理后豆渣中黃豆黃苷較汽爆前增高了17.75倍。基于汽爆的原理:采用汽爆預(yù)處理結(jié)合傳統(tǒng)提取方法勢(shì)必可以有效提高茶皂素的提取率,同時(shí)改變其理化性質(zhì)。然而,目前利用汽爆預(yù)處理提取皂苷的研究在國(guó)內(nèi)外還鮮有報(bào)道。

因此,本研究根據(jù)上述文獻(xiàn)報(bào)道和前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇汽爆壓力0.9～2.1 MPa和時(shí)間30～150 s處理油茶籽餅粕,探明不同預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)茶皂素提取率的影響,并分析汽爆前后對(duì)茶皂素理化性質(zhì)的影響,以期為汽爆技術(shù)在茶皂素提取方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油茶籽餅粕 海南新美特科技有限公司;65%茶皂素 上海綠葉生物科技有限公司;濃硫酸 廣州化學(xué)試劑廠(chǎng);香草醛 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙腈(色譜純) 美國(guó)天地公司;所有分離用有機(jī)溶劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

QBS-80汽爆試驗(yàn)臺(tái) 河南省鶴壁正道生物能源有限公司;Agilent 1100 & Esquire HCT液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,配有電噴霧離子源(ESI) 美國(guó)安捷倫公司 德國(guó)Bruker公司;JSM-7500F掃描電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社;UV-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 島津儀器有限公司;BZY-1自動(dòng)表面張力儀 上海衡平儀器儀表廠(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 汽爆預(yù)處理 將干燥的油茶籽餅粕放入蒸汽爆破物料腔內(nèi),分別于0、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1 MPa條件下處理60 s,選出最適壓力并相應(yīng)處理0、30、60、90、120、150 s,汽爆后收集物料,50 ℃烘干10 h后粉碎,過(guò)40目篩備用。

1.2.2 油茶籽餅粕的微觀(guān)結(jié)構(gòu) 取干燥樣品1 g粘在帶有導(dǎo)電膠帶的樣品臺(tái)上,用離子濺射方法噴金后,用掃描電鏡進(jìn)行觀(guān)測(cè)。

1.2.3 茶皂素的提取及純化

1.2.3.1 茶皂素的提取 提取方法參考文獻(xiàn)[17],稱(chēng)取10 g脫脂茶籽粕置于500 mL錐形瓶中,按料液比為1∶20加入70%乙醇溶液,60 ℃水浴浸提2 h,提取兩次,將得到的兩次提取液合并備用。

1.2.3.2 茶皂素的純化 純化方法參考文獻(xiàn)[18],將上面提取的茶皂素溶液倒入分液漏斗,用正丁醇萃取3次。合并正丁醇層并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在溫度35 ℃,轉(zhuǎn)速70 r/min進(jìn)行濃縮,將濃縮液按照1∶5的比例倒入丙酮中,得到茶皂素沉淀置于50 ℃真空干燥箱內(nèi)烘10 h,稱(chēng)重后裝袋。所有處理3次重復(fù)。

1.2.4 茶皂素提取率的計(jì)算

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 取65%茶皂素0.1 g,用80%乙醇溶解,定容至50 mL,配成1.3 mg/mL茶皂素標(biāo)準(zhǔn)溶液,充分搖勻后備用。方法參考傅春玲等[16]方法。

取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液定容至7.0 mL,分別配成0.0929、0.1857、0.2786、0.3714、0.4643 mg/mL茶皂素標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0.5 mL稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL具塞試管中,加入0.5 mL 8%的香草醛溶液后,放置于冰水浴中,加入4 mL 77%的硫酸溶液,充分搖勻,60 ℃加熱15 min后冰水浴10 min,取出至室溫,以試劑空白為對(duì)照,在UV-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上550 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度(A)。以A為縱坐標(biāo),茶皂素質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程:y=0.9053x-0.0387,R2=0.99931。

1.2.4.2 茶皂素的測(cè)定及提取率的計(jì)算

式中:Y表示茶皂素的提取率,%;C表示樣品溶液的濃度,mg/mL;V表示樣品溶液的體積,mL;n表示樣品溶液稀釋倍數(shù);m表示茶籽粕的質(zhì)量,mg。

1.2.5 茶皂素表面活性測(cè)定 表面張力、起泡性、乳化性的測(cè)定均參考李迅[19]的方法。

1.2.5.1 表面張力測(cè)定 將1.2 MPa、60 s汽爆條件下提取的茶皂素和對(duì)照處理提取的茶皂素分別配制成濃度為0.005%、0.01%、0.03%、0.05%、0.1%、0.5%、1%的梯度溶液,用表面張力儀分別測(cè)定各個(gè)樣品梯度溶液的表面張力值。

1.2.5.2 起泡性的測(cè)定 將1.2 MPa、60 s汽爆條件下提取的茶皂素和未汽爆提取的茶皂素分別配制成濃度為0.01%、0.05%、0.1%、0.5%(W/V)的梯度溶液,從中吸取2 mL置于25 mL具塞試管中,上下振蕩30次,測(cè)量30 s和5 min時(shí)的起泡高度,分別記為A和B。A為起泡能力;B/A為泡沫穩(wěn)定性。

1.2.5.3 乳化性的測(cè)定 將1.2 MPa、60 s汽爆條件下提取的茶皂素和未汽爆提取的茶皂素分別配制成1%水溶液作為水相,正己烷作為脂相,分別吸取6 mL水相與脂相于20 mL玻璃瓶中,超聲混合2 min后,分別記錄0、30 min和24 h時(shí)乳化層厚度。

1.2.6 紅外光譜分析 茶皂素與溴化鉀1∶100混勻,研缽中研磨10 min,壓制成片,用傅葉變換紅外光譜儀,在500～4000 cm-1區(qū)間進(jìn)行掃描。

1.2.7 茶皂素單體定性分析鑒定 將汽爆處理提取純化得到的茶皂素用無(wú)水甲醇配成濃度1 mg/mL的溶液。使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行定性分析。

色譜條件為:進(jìn)樣量1 L,流動(dòng)相A相:99.9%水+0.01%甲酸,B相:甲醇,洗脫條件為:0～3 min,10% B～35% B,3～12 min,35% B～95% B,12～18 min,95% B。流速0.2 mL/min,柱溫30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)200～300 nm。

質(zhì)譜條件為:離子源:ESI,正負(fù)離子同時(shí)掃描,質(zhì)量掃描范圍m/z 1000～1300,加熱模塊溫度250 ℃,CDL溫度200 ℃;霧化氣流速1.5 L/min,干燥氣流速10 L/min,檢測(cè)器電壓1.7 kV。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,用Origin 8.5軟件作圖,采用DPS的單因素方差分析對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行差異性檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 汽爆壓力對(duì)茶皂素提取率的影響

維持壓力時(shí)間為60 s,不同汽爆壓力下處理對(duì)茶皂素的提取率如圖1所示。在0～1.2 MPa壓力范圍內(nèi),隨著汽爆壓力升高,茶皂素的提取率由0 MPa的21.8%增加到1.2 MPa時(shí)的30.4%,之后降低到2.1 MPa的23.1%,汽爆壓力為1.2 MPa時(shí)茶皂素提取率與其它處理組相比差異顯著(P<0.05)。這可能是由于茶皂素主要分布在餅粕細(xì)胞內(nèi),汽爆處理過(guò)程中介質(zhì)和內(nèi)部的蒸汽釋放出強(qiáng)大的沖擊波,破壞了植物多孔介質(zhì)的基質(zhì)結(jié)構(gòu),致使茶皂素等成分溶解和擴(kuò)散[20]。當(dāng)蒸汽爆破壓強(qiáng)過(guò)高時(shí),茶皂素得率反而會(huì)下降,這可能與過(guò)高的溫度和壓強(qiáng)使得蛋白質(zhì)與羰基化合物發(fā)生了美拉德反應(yīng),最終生成棕色甚至是棕黑色的大分子物質(zhì)[21]。從茶皂素提取率和節(jié)能方面考慮,汽爆壓力選擇1.2 MPa較為合理。

圖1 汽爆壓力對(duì)茶皂素提取率的影響

2.2 汽爆時(shí)間對(duì)茶皂素提取率的影響

汽爆處理時(shí)間是影響茶皂素提取率的另一個(gè)重要因素,圖2表明隨著汽爆時(shí)間的延長(zhǎng),茶皂素提取率由0 s時(shí)的21.7%增加到60 s時(shí)的31.2%,在汽爆時(shí)間為60 s時(shí)達(dá)到最高,隨著汽爆時(shí)間的延長(zhǎng),提取率降低到150 s時(shí)的26.7%,60 s時(shí)的提取率與其它處理組(除30、90 s外)相比差異顯著(P<0.05)。汽爆過(guò)程是先加壓使蒸汽進(jìn)入生物質(zhì)的纖維組織和細(xì)胞內(nèi),然后在短時(shí)內(nèi)(0.00875 s)迅速釋放壓力[22]。因此,汽爆處理的時(shí)間太短,物料在高溫高壓的環(huán)境下反應(yīng)不夠充分,餅粕的細(xì)胞結(jié)構(gòu)沒(méi)有被完全破壞,茶皂素?zé)o法有效地釋放出來(lái);作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則茶皂素可能發(fā)生水解反應(yīng)而降解[23]。從節(jié)能的角度看汽爆時(shí)間選擇60 s更合適,在此條件下茶皂素的提取率為31.2%,汽爆法可以提高茶皂素的提取率,與Sui等[24]研究結(jié)果一致。汽爆法提取的茶皂素得率高于微波輔助提取法的12.38%[25],乙醇-超聲波結(jié)合法的18.54%[26],可廣泛用于茶皂素的提取?？梢?jiàn),汽爆預(yù)處理提高了茶皂素的提取率。

圖2 汽爆時(shí)間對(duì)茶皂素提取率的影響

2.3 汽爆處理對(duì)茶皂素表面張力的影響

茶皂素的滲透、潤(rùn)濕、乳化、去污、分散和增溶等作用都是基于其表面活性[27]。表面張力和臨界膠束濃度通常被用來(lái)評(píng)價(jià)表面活性劑的表面活性,表面活性能力與活性劑的使用濃度有關(guān)[19]。由圖3可知,汽爆和對(duì)照提取的茶皂素水溶液的表面張力值隨著濃度的增加有一個(gè)明顯的下降過(guò)程,并且最終趨于穩(wěn)定,汽爆組的表面張力為47.63 m/Nm,對(duì)照組的表面張力為48.07 m/Nm。汽爆提取的茶皂素臨界膠束濃度值在0.1%左右,對(duì)照組在0.5%左右,汽爆提取茶皂素臨界膠束濃度值顯著低于對(duì)照組(P<0.05),說(shuō)明汽爆提取的茶皂素表面活性比對(duì)照組高,這可能與汽爆處理提高了茶皂素得率有關(guān)。

圖3 汽爆處理對(duì)茶皂素表面張力的影響

2.4 汽爆處理對(duì)茶皂素起泡性的影響

起泡性能也是茶皂素表面活性的一個(gè)重要指標(biāo)[28]。由圖4可知,靜置30 s時(shí)汽爆和對(duì)照組茶皂素起泡高度均隨濃度的升高而增加,分別由0.28、0.53 cm增加到5.7、5.4 cm,兩組相比差異不顯著(P>0.05)。研究表明,5 min時(shí)茶皂素泡沫高度與30 s時(shí)泡沫高度的比值可以衡量泡沫的穩(wěn)定性[28]。由圖5結(jié)果可知,隨著茶皂素濃度的增加,汽爆處理組的比值由77%增加到97%,對(duì)照組的比值由83%增加到97%,相比之下汽爆處理組比值增加幅度較大。汽爆處理提取的茶皂素起泡穩(wěn)定性比對(duì)照組低,可能是汽爆處理過(guò)程中對(duì)茶皂素的結(jié)構(gòu)造成了影響,部分茶皂素水解所致[19]。當(dāng)穩(wěn)定性比值超過(guò)50%即可定義為相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)[29]。從圖5結(jié)果可以看出,盡管汽爆處理提取的茶皂素起泡能力比未汽爆處理的低,但依然具有較好的泡沫穩(wěn)定性。

圖4 不同處理對(duì)茶皂素起泡性的影響

圖5 不同處理對(duì)茶皂素泡沫穩(wěn)定性的影響

2.5 汽爆處理對(duì)茶皂素乳化性的影響

乳化劑是對(duì)乳狀液的穩(wěn)定性起重要作用[30]。茶皂素與其他天然乳化劑相比,可在較低的濃度下形成細(xì)小油滴,并在多種環(huán)境條件下保持穩(wěn)定[31]。由圖6可知,對(duì)照組乳化層在30 min后高度由1.23 cm降到1 cm,而汽爆組乳化層高度由1.33 cm降到1.26 cm,二者相比差異不顯著(P>0.05),但汽爆組變化相對(duì)較小。乳化層高度變化越小說(shuō)明汽爆處理的樣品乳化能力越強(qiáng),乳化層高度保持時(shí)間的長(zhǎng)短可衡量乳化穩(wěn)定性,時(shí)間越長(zhǎng)穩(wěn)定性越好[30]。24 h后汽爆組乳化層高度降到0.6 cm,對(duì)照組降到0.47 cm,二者差異不顯著(P>0.05)。因此,汽爆處理對(duì)茶皂素的乳化性影響較小。

圖6 不同處理對(duì)茶皂素乳化性的影響

2.6 掃描電鏡分析

如圖7所示,汽爆處理的油茶籽餅粕結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相比發(fā)生了明顯變化。從圖7A可以看到未經(jīng)處理的油茶籽餅粕結(jié)構(gòu)較為完整,表面相對(duì)光滑,組織結(jié)構(gòu)比較致密。而經(jīng)過(guò)汽爆處理后(圖7B)的油茶籽表面層次增加,表面質(zhì)地疏松,具有很多孔隙立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),呈現(xiàn)一定的蜂窩狀,相對(duì)表面積增大,有利于茶皂素的釋放。汽爆處理為瞬時(shí)高溫高壓過(guò)程,可以在極短時(shí)間內(nèi)有效地破壞細(xì)胞內(nèi)部組織和細(xì)胞壁,從而在細(xì)胞表面形成孔隙,有利于茶皂素的提取。這與汽爆能夠破壞米糠細(xì)胞壁屏障,增加米糠蛋白的釋放[32],破壞香菇細(xì)胞壁,使香菇體內(nèi)的多糖、總糖、蛋白質(zhì)均有所增加的結(jié)論是一致的[33]。

圖7 油茶籽餅粕結(jié)構(gòu)掃描電子顯微鏡圖

2.7 FTIR分析

汽爆處理和對(duì)照組樣品的FTIR結(jié)果如圖8所示,在3000～2700 cm-1附近為飽和C-H的伸縮振動(dòng)峰,在1750～1600 cm-1附近為C=O的伸縮振動(dòng)峰,在1460 cm-1處為-CH-的反對(duì)稱(chēng)變形振動(dòng)峰;1262 cm-1處為C-O-H的面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰,在1077和1046 cm-1處為C-O-C的伸縮振動(dòng)峰?？梢?jiàn),兩組樣品與已報(bào)道茶皂素的主要特征峰一致[28,34],只是汽爆組在2854 cm-1(C-H對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰)、1710 cm-1(C=O的伸縮振動(dòng)峰)、1174 cm-1(C-O-C的伸縮振動(dòng)峰)和 838 cm-1(C-H面外彎曲振動(dòng))處吸收峰有所增強(qiáng),這可能與部分茶皂素單體在汽爆過(guò)程中發(fā)生水解有關(guān)[19]。

圖8 不同處理茶皂素的紅外光譜圖

2.8 茶皂素的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析結(jié)果

預(yù)實(shí)驗(yàn)表明茶皂素在陰離子模式下峰形清晰,由此選擇陰離子模式便于后續(xù)分析。利用液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)提取的茶皂素化學(xué)組成進(jìn)行定性分析,結(jié)果如圖9所示。從9B圖中可以看出茶皂素主要有三個(gè)離子峰,將三個(gè)離子峰定位在液相圖9A時(shí),剛好有三個(gè)吸收峰即1、2、3,可推測(cè)出茶皂素中有三個(gè)單體。1、2、3三個(gè)組分的質(zhì)譜圖分別為圖9C、D、E。從陰離子質(zhì)譜圖中可知,組分1的[M-H]-為1097.2138,可知分子量為1097,推測(cè)其分子式可能為C54H82O23,與Morikawa等[35]結(jié)果對(duì)比,推測(cè)組分1可能為茶皂素E13。組分2的[M-H]-為1231.5456,可知分子量為1231,推測(cè)其分子式可能為C59H91O26,與Fu等[36]研究結(jié)果一致,皂素2可能為油茶皂苷D5。組分3的[M-H]-為1189.5455,可知分子量為1189,推測(cè)其分子式可能為C57H89O26,由Morikawa等[37]和Yoshikawa等[38]的研究結(jié)果可知,皂素3可能為茶皂素B5或C1。由于本研究未做核磁共振分析,茶皂素精確結(jié)構(gòu)有待于下一步研究確定。

圖9 茶皂素化學(xué)組成的液質(zhì)聯(lián)用儀分析結(jié)果

3 結(jié)論

汽爆預(yù)處理明顯提高了油茶籽餅粕中茶皂素的提取率和表面活性,降低了茶皂素的表面張力和起泡性,汽爆處理對(duì)茶皂素乳化性影響較小。掃描電鏡結(jié)果表明,汽爆處理使茶籽粕的表面變得粗糙疏松,油茶籽餅粕微觀(guān)結(jié)構(gòu)遭到破壞,有利于茶皂素從細(xì)胞中釋放出來(lái),進(jìn)而縮短了茶皂素的提取時(shí)間,提高了茶皂素的得率。FTIR結(jié)果表明,汽爆處理的茶皂素部分峰形出現(xiàn)了增強(qiáng)現(xiàn)象,表明汽爆處理對(duì)茶皂素結(jié)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生影響。液質(zhì)結(jié)果顯示,茶皂素含有3種單體,對(duì)比已報(bào)道數(shù)據(jù)推測(cè)其可能是茶皂素E13、油茶皂苷D5、茶皂素B5或茶皂素C1。因此,汽爆預(yù)處理油茶籽粕可明顯提高茶皂素的提取率,改變茶皂素的部分理化性質(zhì)。