隋君霞，隋京京，李 曉，姜忠玲，曹榮峰，豐艷妮，李華濤

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109)

在臨床治療中，犬的血型是輸血療法的決定因素，血型不合可能造成嚴(yán)重的溶血反應(yīng)，導(dǎo)致治療失敗或留下嚴(yán)重的后遺癥[1]。在犬的血型系統(tǒng)中，DEA1.1、DEA1.2表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫原性[2]，DEA1.1和DEA1.2的抗原-抗體反應(yīng)也是導(dǎo)致急性輸血性溶血的最主要因素[3]。因此在犬臨床輸血治療中，鑒定DEA1.1血型是非常有必要的。目前動物血型分型方法主要有試管法、卡片法和凝膠柱法[4]，這些方法都是基于紅細(xì)胞抗原和單克隆試劑或多克隆血清的血凝反應(yīng)原理實施的[5]。目前仍未發(fā)現(xiàn)一種能夠用于犬交叉配血檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)行的方法或是缺乏準(zhǔn)確性；或是價格昂貴、國內(nèi)尚未推廣；或是無法用于大批量血液樣本檢測[6]，因而亟需研發(fā)一種檢出率高、價格合理且能夠用于大批量血型篩查的新方法。在本試驗中，我們通過幾種醛化劑對犬DEA1.1抗原紅細(xì)胞進(jìn)行醛化固定，并進(jìn)一步研究醛化對血型抗原DEA1.1是否造成影響，并探索一種使犬DEA1.1血型抗原得以長期保存的方法。通過提取犬紅細(xì)胞膜，去除血紅蛋白成分，以特定血型的紅細(xì)胞膜為抗原建立間接ELISA方法用以寵物醫(yī)療中血型高通量檢測，降低因血型不合引起的輸血風(fēng)險。

1 材料

犬血液樣本來自廣州及周邊地區(qū)動物醫(yī)院、流浪犬收留中心及品種犬養(yǎng)殖基地，其中試驗用比格犬130只、本地犬28只，共計158個樣本。QuickVet?/RapidVet Canine DEA1.1 Blood Typing Test試劑盒，購自美國Dmslaboratories公司； HRP酶標(biāo)抗犬IgG二抗，購自BD公司；96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板或8孔酶標(biāo)板條為Breiner bio-one公司產(chǎn)品；脫脂奶粉、BSA、TMB，均購自北京Solarbio公司。

2 方法

2.1 犬DEA1.1血型鑒定 按照QuickVet?/RapidVet Canine DEA1.1 Blood Typing Test說明書對犬DEA1.1血型進(jìn)行檢測。檢測原理是當(dāng)紅細(xì)胞細(xì)胞膜上含有DEA1.1抗原時，會和鑒定卡上的DEA1.1單克隆抗體相結(jié)合而產(chǎn)生凝集反應(yīng)，被檢測的血樣為DEA1.1陽性，不產(chǎn)生凝集反應(yīng)則被檢測血樣為DEA1.1陰性。

2.2 犬DEA1.1血型抗原間接ELISA方法的建立 由于對DEA1.1抗原了解較少，目前還不能用真核或原核表達(dá)的情況下得到血型抗原，也不能拿到較純DEA1.1抗原，因此最初嘗試用DEA1.1抗原陰、陽性的犬紅細(xì)胞膜為抗原，進(jìn)行DEA1.1血型抗原間接ELISA方法的建立。

2.3 紅細(xì)胞膜制備 紅細(xì)胞的采集和洗滌：取2 mL 抗凝全血3 000 r/min離心20 min，紅細(xì)胞沉淀，棄上清和白細(xì)胞層。將紅細(xì)胞置于3倍量的預(yù)冷pH 7.4的等滲磷酸鹽緩沖液中，混勻，4 ℃5 000 r/min 離心15 min，除去上清及沉淀表層，重復(fù)洗滌3次。紅細(xì)胞膜洗滌：在洗凈的紅細(xì)胞中，按照1∶40的比例加入預(yù)冷的pH 7.4的低滲Tris緩沖液中，混勻，置于4 ℃冰箱中2 h，使之完全溶血。4 ℃ 9 000 r/min離心15 min，使紅細(xì)胞膜沉淀，重復(fù)洗滌，離心3～5次，最后獲得白色的紅細(xì)胞膜樣品。將最后1次離心所得到的紅細(xì)胞膜懸浮在2～4 mL pH 7.4的等滲磷酸鹽緩沖液中。記錄懸浮液的總體積。

2.4 間接ELISA方法操作程序 細(xì)胞膜包被液摸索：分別選用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)、0.05 mol/L包被液(pH 9.6的碳酸鹽緩沖液)、0.5%PVA包被紅細(xì)胞膜到酶標(biāo)板上，每孔加100 μL包被液，4 ℃ 過夜，用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)振搖洗滌酶標(biāo)板3次，每次5 min。細(xì)胞膜固定劑摸索：分別選擇甲醛、多聚甲醛、戊二醛固定犬紅細(xì)胞，用間接抗球蛋白試驗檢測對犬血型DEA1.1的抗原性影響；根據(jù)結(jié)果選擇最佳固定劑，設(shè)置濃度梯度為0.02%、0.03%、0.06%、0.13%、0.25%和0.50%固定犬紅細(xì)胞膜，按50 μL/孔加入到酶標(biāo)板中。37 ℃作用2 h。 用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)振搖洗滌酶標(biāo)板3次，每次5 min。封閉：分別加入5%的脫脂奶粉、1%的BSA、0.1%的BSA，200 μL/孔，置37 ℃溫箱2 h，取出后甩掉液體，用PBS充分洗滌。加血清：用封閉液按1∶200稀釋犬抗DEA1.1抗血清和陰性血清，加入到反應(yīng)板中，100 μL/孔，每份樣品再重復(fù)1孔，同時設(shè)定陽性對照孔、陰性對照孔和空白對照孔，置37 ℃溫箱作用一定時間，取出后甩掉液體，用PBS充分洗滌。加酶標(biāo)二抗：將酶標(biāo)二抗用封閉液按1∶200稀釋，加入到反應(yīng)板中，100 μL/孔，置37 ℃溫箱作用一定時間，取出后甩掉液體，用PBS充分洗滌。加底物溶液：取現(xiàn)配制的TMB-H2O2底物溶液、TMB顯色液100 μL/孔，加入到反應(yīng)板中，置37 ℃溫箱作用一定時間。加終止液：取出反應(yīng)板，加入終止液2 mol/L H2SO4，100 μL/孔，終止顯色反應(yīng)。酶標(biāo)儀測定：用酶標(biāo)儀在單波長處測定每孔內(nèi)物質(zhì)的OD490 nm值。

結(jié)果判定：在對照成立的情況下，判定檢測血清樣品的陰陽性。通過對每次反應(yīng)的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計算反應(yīng)的P/N值，以P/N值最大的反應(yīng)條件作為間接ELISA最佳反應(yīng)條件的判定依據(jù)。P/N值計算方法：P/N值=(陽性對照孔OD490 nm平均值-空白對照孔OD490 nm均值)/(陰性對照孔OD490 nm均值-空白對照孔OD490 nm均值)。

2.5 間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化 將提取的紅細(xì)胞膜用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)按照2倍倍比稀釋，每孔加30 μL于酶標(biāo)板，添加1%戊二醛PBS 2 μL， 使終濃度為0.062 5%。37 ℃包被2 h，根據(jù)檢測結(jié)果，確定最佳抗原包被濃度。以最適的抗原濃度和最佳抗原包被條件包被酶標(biāo)板，分成4組進(jìn)行。第1組用5%脫脂乳封閉；第2組用1%脫脂乳封閉；第3組用5% BSA封閉；第4組用1% BSA封閉。按照間接ELISA程序測定OD450 nm值，比較P/N值，以確定最佳封閉液。隨機(jī)收集健康犬血清56份，分別稀釋至最佳濃度，用已建立間接ELISA方法檢測，每份血清重復(fù)2孔，DEA1.1陰性、陽性血清作為對照。測定OD450 nm值并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。加入血清稀釋液之后，分別在室溫(26 ℃)和37 ℃作用30、60、90、120、150 min后測定其OD450nm值，確定血清最佳反應(yīng)時間。加入新配制的TMB底物溶液，100 μL/孔，于室溫反應(yīng)10、15、20、25、30 min，用2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，以P/N值最大為判定標(biāo)準(zhǔn)。

2.6 間接ELISA重復(fù)性試驗驗證 穩(wěn)定性和重復(fù)性：紅細(xì)胞膜在-20 ℃長時間保存，反復(fù)凍融20次，固定于ELISA板4 ℃保存后進(jìn)行檢測。板內(nèi)重復(fù)試驗：用同一塊酶標(biāo)板加入不同的樣本，包括陽性樣本4份，陰性樣本2份，陽性對照和陰性對照各1份。陽性和陰性樣本各做6個重復(fù)。用建立的ELISA檢測方法測定，計算同一樣本的變異系數(shù)，以檢驗板內(nèi)樣品的重復(fù)性。板間重復(fù)性試驗：取不同時間包被的6個酶標(biāo)板重復(fù)檢測上述4份陽性樣品和2份陰性樣本，并設(shè)陽性和陰性對照，用建立的ELISA方法進(jìn)行檢測，計算同樣本的變異系數(shù)，以檢驗板間檢測樣品的重復(fù)性。對比試驗(特異性)：與間接抗球蛋白試驗相比，觀察2種方法的特異性。提取158只犬紅細(xì)胞膜用DEA1.1抗血清進(jìn)行細(xì)胞抗原檢測。用其中1份DEA1.1抗原陽性的細(xì)胞膜對158份犬血清進(jìn)行DEA1.1抗體檢測，觀察ELISA方法的特異性。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞膜包被液及固定劑的摸索 用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)、0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)和0.5%PVA包被。ELISA結(jié)果顯示，所有的孔OD值均很低，并且陰陽性紅細(xì)胞膜對比沒有明顯差別。認(rèn)為常用的ELISA包被液不能把完整或大塊的紅細(xì)胞膜包被到酶標(biāo)板上。用甲醛、多聚甲醛和戊二醛固定紅細(xì)胞后，間接抗球蛋白試驗檢測結(jié)果顯示，幾種固定劑并不影響犬血型DEA1.1的抗原性，但發(fā)現(xiàn)長時間保存后，甲醛和多聚甲醛會使紅細(xì)胞溶血。戊二醛增加紅細(xì)胞的粘性，并能使整個紅細(xì)胞固定到酶標(biāo)板上。選擇戊二醛作為固定劑固定包被紅細(xì)胞膜，進(jìn)行ELISA檢測。結(jié)果顯示，戊二醛可以很好的把整個的紅細(xì)胞膜固定到酶標(biāo)板上。并且不影響犬血型DEA1.1的抗原性。陰陽性血清檢測結(jié)果P/N值隨戊二醛濃度變化而變化(如表1和圖1)。0.06%和0.13%最接近，P/N>2，但是結(jié)果所得數(shù)據(jù)離散度較大，同一樣本重復(fù)性不好。

表1 P/N值隨戊二醛濃度變化Table 1 P/N value affected by concentration of glutaraldehyde

圖1 P/N值隨戊二醛濃度變化Fig.1 P/N value affected by concentration of glutaraldehyde

3.2 抗原包被濃度和陽性血清稀釋度的確定 將提取的紅細(xì)胞膜用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)按照2倍倍比稀釋，結(jié)果如表2和圖2所示，抗原濃度在4～8 μg時， P/N值最大。認(rèn)為最佳抗原包被量為4～8 μg/孔。 血清在800倍稀釋時P/N值小于2。被檢血清稀釋400倍時能檢出。與間接抗球蛋白試驗相比，比抗球蛋白結(jié)果試驗靈敏2倍以上(表3和圖3)。

表2 抗原包被濃度的優(yōu)化Table 2 Optimize the concentration of antigen-coated

圖2 抗原包被量的優(yōu)化Fig.2 Optimize the concentration of antigen-coated

圖3 間接ELISA方法靈敏度測定Fig.3 Sensitivity measurement of ELISA

表3 間接ELISA方法靈敏度測定Table 3 Sensitivity measurement of ELISA

3.3 封閉液的確定 以最適的抗原濃度和最佳抗原包被條件包被酶標(biāo)板，分別用4種不同的封閉液進(jìn)行封閉，結(jié)果反映，4種封閉液之間沒有明顯的差異，用5%的脫脂奶粉封閉液封閉特異性結(jié)合最低，所以選擇5%的脫脂奶粉作為封閉液。

3.4 血清反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度的確定 如表4和圖4結(jié)果所示，37 ℃反應(yīng)90 min時P/N值可以達(dá)到最高值，26 ℃反應(yīng)120 min時才可以達(dá)到最大值，進(jìn)入平臺期。37 ℃為反應(yīng)的最佳溫度。37 ℃反應(yīng)90 min時P/N值基本達(dá)到最大，之后的P/N變化不大。本試驗優(yōu)化的結(jié)果是反應(yīng)溫度為37 ℃，反應(yīng)時間為90 min。

表4 優(yōu)化血清反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度Table 4 Optimization of serum reaction time and temperature

圖4 優(yōu)化血清反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度Fig.4 Optimization of serum reaction time and temperature

3.5 穩(wěn)定性和重復(fù)性 -20 ℃長時間保存并不影響檢測結(jié)果。反復(fù)凍融20次也不影響檢測結(jié)果。固定在ELISA板4 ℃保存后發(fā)現(xiàn)2個月內(nèi)不影響檢測結(jié)果。說明犬血型DEA1.1抗原具有很高的穩(wěn)定性，可以長期保存抗原，替換掉試劑紅細(xì)胞。應(yīng)用建立的間接ELISA方法對血清樣品進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)試驗，結(jié)果顯示，陽性血清仍為陽性，陰性血清仍為陰性結(jié)果，說明間接ELSIA具有較好的重復(fù)性。

3.6 對比試驗(特異性) 結(jié)果顯示，2種方法相比，提取158只犬紅細(xì)胞膜用DEA1.1抗血清進(jìn)行細(xì)胞抗原檢測和抗體檢測結(jié)果與間接抗球蛋白試驗結(jié)果符合率為100%，具有相同的特異性。

4 討論

目前，在獸醫(yī)臨床上缺乏準(zhǔn)確、簡便和便宜的犬血型鑒定試劑。由于紅細(xì)胞常規(guī)保存方法較短，針對多種不同血型的紅細(xì)胞又很難收集并應(yīng)用到免疫血清和單克隆抗體的篩選。本試驗根據(jù)國際現(xiàn)有的多克隆抗血清和犬DEA1.1血型檢測卡，對廣州地區(qū)本地犬和試驗用比格犬就行篩查。并以此為基礎(chǔ)選擇DEA1.1血型強(qiáng)陽性和陰性的犬作為試驗動物。

研究證明，通過特殊酶如菠蘿蛋白酶處理紅細(xì)胞增加DEA1.1血型檢出率，并通過抗球蛋白對照確認(rèn)DEA1.1血型抗原位點存在于紅細(xì)胞膜蛋白上[7]。醛化劑的醛基可以和紅細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)的氨基交聯(lián)形成羧甲基，能使紅細(xì)胞蛋白分子之間形成交聯(lián)，影響蛋白構(gòu)型使之保持固有的形態(tài)結(jié)構(gòu)[8]。有文獻(xiàn)報道用干燥固定的方法[9]，或甲醛固定的方法固定紅細(xì)胞到96孔板中[10]，建立的ELISA方法可以用于抗體的檢測。但是在本試驗預(yù)試驗進(jìn)行了驗證，由于紅細(xì)胞內(nèi)部存在血紅蛋白，具有過氧化物酶的作用。會引起底物TMB發(fā)生顯色反應(yīng)，因此基本不能使用。為了解決犬DEA1.1抗原長期保存的問題，本試驗探索了多種固定劑對犬紅細(xì)胞進(jìn)行固定，最終發(fā)現(xiàn)戊二醛具有很高的固定作用，并且不會破壞犬DEA1.1血型抗原活性。因此，戊二醛固定紅細(xì)胞可以在HA試驗代替新鮮的紅血細(xì)胞。同時，它為制備DEA1.1單克隆抗體提供了基礎(chǔ)。

本試驗對已有的紅細(xì)胞抗體ELISA檢測法[11]做了進(jìn)一步的改進(jìn)，提取紅細(xì)胞膜的目的是為了去除紅細(xì)胞內(nèi)部的血紅蛋白，降低對反應(yīng)底物TMB的影響。經(jīng)探索發(fā)現(xiàn)，戊二醛能把紅細(xì)胞膜牢固的固定到96孔板底部。從而提高了蛋白量差異較大的難題。雖然解決了很大的問題，在結(jié)果判定過程中，發(fā)現(xiàn)陰陽性結(jié)合檢測所得到的P/N值差異很小，不像其他文獻(xiàn)報道的ELISA方法[12]，很明顯的判斷出陰陽性的差別。對于此方法，本試驗雖然做了改進(jìn)，也能很穩(wěn)定的檢測出陰陽性，但是其靈敏度并不是特別高。本試驗為研制犬DEA1.1血型單克隆抗體打基礎(chǔ)，建立了犬DEA1.1血型抗原間接ELISA方法，可以對犬DEA1.1血型抗體進(jìn)行高通量檢測。