袁 芮， 張 超，2*， 蘇 彤， 楊立梅， 張學(xué)蘭，2， 孫秀梅，2

（1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 山東 濟(jì)南250355； 2. 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥炮制技術(shù)傳承基地， 山東 濟(jì)南250355）

香附為莎草科植物莎草Cyperus rotundus L. 的干燥根莖, 主要含有揮發(fā)油、 黃酮、 生物堿和三萜類[1-2]。 其炮制品中, 生品和醋制品是中醫(yī)臨床常用的炮制規(guī)格,醋制后增強(qiáng)了疏肝理氣、 止痛的作用, 其炮制作用的變化根源于香附醋制前后其中物質(zhì)基礎(chǔ)的變化。 現(xiàn)代研究比較了香附醋制前后α-香附酮[3-6]、 香附烯酮[4-6]、 圓柚酮[4-6]、 總黃酮[7]、 木犀草素[8]、 微量元素[9]等含有量的變化； 采用GC-MS 指紋圖譜表征出香附揮發(fā)油的種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)在醋制前后均發(fā)生了變化[10-11], 但這些變化是否對(duì)區(qū)分生、 醋香附飲片有重大意義, 能否作為兩者定性、 定量的指標(biāo), 還沒有進(jìn)展。 2015 年版 《中國(guó)藥典》 一部香附項(xiàng)下[12]亦收載有香附和醋香附2 種炮制品, 兩者定性和定量指標(biāo)基本相同, 只是浸出物和揮發(fā)油限量稍有差別。 可見, 生、 醋香附飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)還缺乏專屬性。 若要建立能反映炮制過程的香附和醋香附質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn), 可通過比較兩者的特征圖譜, 確定用于區(qū)分生、 醋飲片的特征峰, 從而更專屬、 更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)生、 醋飲片質(zhì)量。

本實(shí)驗(yàn)收集了不同飲片企業(yè)生產(chǎn)的香附和醋香附飲片,分別建立相應(yīng)的HPLC 特征圖譜, 借助主成分分析和偏最小二乘判別分析研究香附醋制對(duì)特征圖譜中色譜峰的影響,以進(jìn)一步明確對(duì)區(qū)分香附和醋香附有重大意義的色譜峰,并對(duì)該色譜峰歸屬進(jìn)行初步探討, 以期為完善香附和醋香附的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)體系提供依據(jù), 并為醋制類中藥飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供新思路。

1 材料

Agilent 1200 Series 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司）； KQ-250E 型醫(yī)用超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）； 電子分析天平（十萬分之一, 梅特勒-托利多儀器上海有限公司）； BJ-150 型高速多功能粉碎機(jī)（德清拜杰電器有限公司）。

α-香附酮對(duì)照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司, 批號(hào)151027, 含有量≥98%）； 香附烯酮對(duì)照品（成都瑞芬思生物科技有限公司, 批號(hào)X-069-170328, 含有量≥98%）； 5-羥甲基糠醛對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司, 批號(hào)MUST-17021202, 含有量≥98%）； 鎮(zhèn)江香醋（江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司, 固態(tài)發(fā)酵）； 德馨齋清香米醋（濟(jì)南德馨齋食品有限公司, 液態(tài)發(fā)酵）。 甲醇、 乙腈均為色譜純； 水為高純水； 其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品收集 共收集不同企業(yè)生產(chǎn)的香附飲片12 批、醋香附飲片13 批, 經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)張芳副教授鑒定均為莎草科植物莎草Cyperus rotundus L. 干燥根莖的炮制加工品, 信息見表1。

表1 樣品信息

2.2 供試品溶液制備 取飲片粉末（過3 號(hào)篩） 0.5 g,精密稱定, 置具塞錐形瓶中, 精密加入甲醇20 mL, 稱定質(zhì)量, 超聲處理30 min, 放冷, 再稱定質(zhì)量, 用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量, 搖勻, 濾過, 取續(xù)濾液, 即得。 精密量取0.5 mL米醋置5 mL 量瓶中, 用甲醇稀釋至刻度, 搖勻, 即得米醋供試品溶液。

2.3 對(duì)照品溶液制備 分別取α-香附酮、 香附烯酮、 5-羥甲基糠醛對(duì)照品適量, 精密稱定, 加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為44、 48、 12 μg/mL 的對(duì)照品溶液。 分別精密量取3 種對(duì)照品溶液適量, 置同一量瓶中, 用甲醇稀釋至刻度, 搖勻, 即得混合對(duì)照品溶液。

2.4 色譜條件 Intersil ODS-3 C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm, 5 μm）； 流動(dòng)相甲醇（A） -水（B）, 梯度洗脫（0～5 min, 35% ～54%A； 5～80 min, 54% ～94%A）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫25 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm； 進(jìn)樣量20 μL。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取1 號(hào)供試品溶液, 在“2.4” 項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次, 以11 號(hào)峰為參照, 測(cè)得各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)積分面積基本一致, RSD 均小于3.0%, 表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1 號(hào)供試品溶液, 在“2.4” 項(xiàng)色譜條件下, 分別于0、 4、 8、 12、 16、 24 h 進(jìn)樣, 以11 號(hào)峰為參照, 測(cè)得各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)積分面積基本一致, RSD 均小于3.0%, 表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品6 份, 精密稱定, 按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“2.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣, 測(cè)得各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)積分面積的RSD 均小于3.0%, 表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 特征圖譜建立 取12 批香附飲片和13 批醋香附飲片的供試品溶液, 在“2.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣, 將數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A 版處理, 色譜圖見圖1, 與對(duì)照?qǐng)D譜之間的相似度依次為0.972、 0.986、0.990、 0.985、 0.961、 0.955、 0.980、 0.955、 0.987、0.955、 0.941、 0.926； 13 批醋香附飲片色譜圖見圖2, 與對(duì)照?qǐng)D譜之間的相似度依次為0.985、 0.982、 0.967、0.980、 0.936、 0.948、 0.958、 0.908、 0.969、 0.941、0.905、 0.963、 0.945。 特征峰見圖3, 其中, 峰1 為醋香附的特有峰, 其余11 個(gè)峰為共有峰。

圖1 12 批香附飲片HPLC 色譜圖

圖2 13 批醋香附飲片HPLC 色譜圖

2.7 多元統(tǒng)計(jì)分析 為研究香附醋炙對(duì)特征圖譜中色譜峰的影響, 固定香附的產(chǎn)地和來源, 選取使用同一批香附藥材自制的5 批香附飲片（A1～A5） 和5 批醋香附飲片（B1～B5） 進(jìn)行特征圖譜研究, 統(tǒng)計(jì)10 個(gè)樣本中各自1～12 號(hào)色譜峰的積分面積, 并進(jìn)行量化處理[13], 以消除取樣量差異和水分含有量差異造成的影響, 結(jié)果見表2。 將量化后的峰面積數(shù)據(jù)保存為EXCEL 格式, 導(dǎo)入SIMCA-P （version 13.0） 軟件中進(jìn)行主成分分析, 見圖4。 可見, 10 個(gè)樣本被明顯地分為2 類, 模型參數(shù)為R2X=0.663, Q2=0.706,來自于同一炮制類型的同一飲片形式被聚為了相同一類。表明醋炙對(duì)香附特征圖譜中化學(xué)成分的總體特征產(chǎn)生了顯著影響。

采用偏最小二乘判別分析對(duì)樣本進(jìn)行分類研究, 模型參數(shù)為R2X=0.626, R2Y=0.910, Q2=0.803, 變量對(duì)分類的重要程度可以由VIP 值的大小來衡量, VIP 值越大, 對(duì)應(yīng)變量對(duì)分類的貢獻(xiàn)就越大, 變量VIP 圖見圖5, 選擇VIP值大于1.2 對(duì)應(yīng)的色譜峰作為對(duì)分類具有重要意義的變量。峰1、 11、 6、 3 的變化對(duì)香附醋制前后飲片的區(qū)分有重大貢獻(xiàn), 其中, 峰1 為醋香附的特有峰, 對(duì)區(qū)分生、 醋香附飲片的貢獻(xiàn)最大, 可作為醋香附的專屬性特征標(biāo)識(shí)。 醋炙后, 峰11、 6 的變化呈下降趨勢(shì), 峰3 的變化呈增加趨勢(shì),可作為生醋香附的差異性特征標(biāo)識(shí)。

2.8 特征峰定性 根據(jù)相同物質(zhì)在同一色譜條件下具有相近保留時(shí)間的特性, 與對(duì)照品比對(duì)初步確認(rèn)其中的峰1 為5-羥甲基糠醛, 峰8 為香附烯酮, 峰11 為α-香附酮, 見圖3。 實(shí)驗(yàn)還對(duì)5-羥甲基糠醛的來源進(jìn)行了初步探討, 發(fā)現(xiàn)醋香附飲片中的5-羥甲基糠醛來源于米醋, 不論是固態(tài)發(fā)酵醋還是液態(tài)發(fā)酵醋均含有5-羥甲基糠醛, 結(jié)果見圖6。

圖3 香附和醋香附飲片的特征峰

表2 特征峰積分面積量化處理后的數(shù)值

圖4 香附和醋香附飲片主成分分析圖

3 討論

采用HPLC 對(duì)不同廠家的香附飲片和醋香附飲片進(jìn)行分析, 建立HPLC 特征圖譜, 且特征圖譜穩(wěn)定性好, 能夠全面反映香附和醋香附的化學(xué)輪廓, 可作為區(qū)別于其他類中藥飲片的依據(jù)。

圖5 偏最小二乘判別分析VIP 得分圖

圖6 5-羥甲基糠醛HPLC 色譜圖

借助SIMCA-P 13.0 軟件研究香附醋制對(duì)HPLC 特征圖譜中色譜峰的影響, 以闡述香附飲片醋制后化學(xué)成分的變化, 找出能反映香附和醋香附個(gè)性特征的色譜峰或化學(xué)物質(zhì)。 主成分分析結(jié)果表明香附和醋香附的HPLC 特征圖譜差異顯著； 偏最小二乘判別分析結(jié)果確定醋香附的特有峰（峰1） 是對(duì)區(qū)分生、 醋香附飲片有重大意義的變量, 可作為生、 醋香附飲片專屬性識(shí)別的關(guān)鍵指標(biāo), 歸屬確認(rèn)峰1為5-羥甲基糠醛, 研究證實(shí)固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵醋中均含有5-羥甲基糠醛, 與文獻(xiàn)[14-15] 報(bào)道一致, 所以初步判斷5-羥甲基糠醛來源于炮制輔料米醋。 可見, 醋香附飲片中的特有峰5-羥甲基糠醛是因醋制而產(chǎn)生的。 偏最小二乘判別分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)醋炙后峰11、 6、 3 的量變對(duì)區(qū)分生、 醋香附飲片亦有重大意義, 歸屬確認(rèn)峰11 為α-香附酮, 5 批自制香附飲片α-香附酮峰面積量化處理后的數(shù)值為（1 245.7±29.5）, 醋香附中α-香附酮峰面積量化處理后的數(shù)值為（1 105.9±44.9, 經(jīng)SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)醋炙前后α-香附酮的峰面積量化數(shù)值進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn), 發(fā)現(xiàn)醋炙后α-香附酮含有量顯著降低（P＜0.01）。 可見, α-香附酮含有量變化對(duì)區(qū)分生、 醋香附飲片有重大意義, α-香附酮的量變可作為生、 醋香附飲片的差異性特征標(biāo)識(shí), 擬在生、 醋香附飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加α-香附酮的含有量測(cè)定項(xiàng), 且醋香附中α-香附酮的質(zhì)控含有量應(yīng)低于生香附。

本研究所建立的HPLC 特征圖譜可用于香附和醋香附的質(zhì)量評(píng)價(jià)和鑒別, 并提高了其專屬性和準(zhǔn)確性, 以期為醋制類中藥飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)和真?zhèn)舞b別提供借鑒。