趙 桉,李欣芮,范小飄,高文文,尚佳萃,萬(wàn) 峰,孟祥晨

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué),乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

雙歧桿菌是生命早期最為重要的腸道優(yōu)勢(shì)菌群之一[1],具有促進(jìn)腸道發(fā)育[2]、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[3]、維持組織穩(wěn)態(tài)[4]、促進(jìn)新陳代謝等生理學(xué)功能[5]。由于嬰兒腸道發(fā)育完善程度影響了嬰兒食物消化、營(yíng)養(yǎng)吸收、免疫系統(tǒng)增強(qiáng)等生理學(xué)功能[2],因此雙歧桿菌促進(jìn)新生兒腸道發(fā)育成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

Che等[6]用人體內(nèi)的雙歧桿菌處理無(wú)菌豬,建立了HFA(Human flora-associated)豬模型,在菌株定植腸道后,空腸上皮絨毛長(zhǎng)度增長(zhǎng)、隱窩加深,影響腸道發(fā)育,但對(duì)其中起作用的菌體成分及作用機(jī)制很大程度上未知。目前已發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌的短鏈脂肪酸(SCFAs)[7]、乳酸[8]以及短雙歧桿菌的菌毛[9]可促進(jìn)新生兒腸道發(fā)育。其他菌體成分如脂磷壁酸(LTA)[10]、胞外多糖(EPS)[11]、蛋白質(zhì)[12]等物質(zhì)在完善嬰兒其他的腸道功能中起到了積極作用。其中的蛋白質(zhì)主要包括分布于菌體上的表面蛋白和菌體外的分泌蛋白,是雙歧桿菌與宿主相互作用和分子間交流的潛在介質(zhì),直接參與感知環(huán)境因素、促進(jìn)細(xì)菌定植、介導(dǎo)與腸粘膜相關(guān)免疫細(xì)胞的產(chǎn)生[13]。但是表面蛋白和分泌蛋白是否參與了腸上皮細(xì)胞的增殖,尚無(wú)研究報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)室篩選出一株對(duì)腸上皮細(xì)胞增殖促進(jìn)作用較好的菌株,探究其中的蛋白成分對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵基因與哺乳動(dòng)物腸上皮細(xì)胞增殖密切相關(guān)[14-15]。β-catenin、Cyclin D1、c-Myc 是細(xì)胞增殖正調(diào)控基因;Axin2、GSK-3β是細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控基因[16]。因此選取Wnt/β-catenin 信號(hào)通路正負(fù)調(diào)控基因,檢測(cè)其表達(dá)變化情況,可在mRNA水平上檢測(cè)雙歧桿菌分泌蛋白和表面蛋白對(duì)腸上皮細(xì)胞增殖的影響[17]。

與以往研究新生兒腸道發(fā)育問(wèn)題時(shí),常選用動(dòng)物腸細(xì)胞系或人腸癌細(xì)胞系不同,本試驗(yàn)直接選用妊娠23周人胎結(jié)腸上皮CCD841 CoN細(xì)胞作為受試細(xì)胞,從12株雙歧桿菌(3～6月齡健康嬰兒糞便分離鑒定[18])中篩選出1株對(duì)CCD841 CoN細(xì)胞增殖促進(jìn)作用最好的菌株,分析該菌株的表面蛋白和分泌蛋白的作用,初步探討雙歧桿菌對(duì)腸上皮細(xì)胞增殖影響的理論機(jī)制,為新生兒腸道發(fā)育以及腸道健康研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

12株雙歧桿菌(2株動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種:H6-7、H15-7;2株短雙歧桿菌:H9-3、H4-2;2株雙歧桿菌:H3-R2、H4-3;2株長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種:H10-1、H11-7;4株長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種:H4-1、H11-2、H16-3、H21-7) 分離于東北地區(qū)一月齡健康嬰兒(男嬰11人、女?huà)?0人)糞便,保藏于實(shí)驗(yàn)室;人胎結(jié)腸上皮CCD841 CoN細(xì)胞 北納生物;改良MRS(mMRS)培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基中添加0.05% L-半胱氨酸鹽酸鹽;高糖培養(yǎng)基DMEM 美國(guó)HyClone;胰蛋白酶 美國(guó)Sigma公司;胎牛血清 加拿大Wisent公司;0.25% Trypsin-EDTA 美國(guó)Gibco公司;與細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的產(chǎn)品 美國(guó)Corning公司;CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒 美國(guó)AbMole公司;細(xì)胞周期染色試劑盒 聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司;細(xì)菌總 RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR反應(yīng)試劑盒(SYBR Green) 天根公司;引物 吉林省庫(kù)美生物科技有限公司;其他試劑 國(guó)產(chǎn)生化分析純產(chǎn)品。

厭氧培養(yǎng)箱 美國(guó)賽默飛公司;HF90型二氧化碳培養(yǎng)箱 力康發(fā)展有限公司;BA300型倒置顯微鏡 麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;Model 680型酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司;Cytomics FC 500流式細(xì)胞儀 美國(guó)Beckman Coulter公司;Step One Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 美國(guó)Applied Biosystem公司;核酸蛋白測(cè)定儀 美國(guó)Molecular Devices公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) CCD841 CoN細(xì)胞培養(yǎng)于添加10%胎牛血清的DMEM混合培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng),胰酶消化傳代。

1.2.2 雙歧桿菌活化及培養(yǎng) 12株供試菌株在試驗(yàn)前需進(jìn)行復(fù)蘇活化,3%接種于mMRS 液體培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng)16 h,連續(xù)傳2～3代以恢復(fù)菌種活力。平板菌落計(jì)數(shù)出活菌數(shù)量后,調(diào)整菌體濃度為3×107CFU/mL以備用。

1.2.3 雙歧桿菌的篩選

1.2.3.1 雙歧桿菌發(fā)酵上清液和破碎物的制備 發(fā)酵上清液的制備:取厭氧培養(yǎng)16 h后的菌液10 mL,8000 r/min 4 ℃離心5 min,收集上清液,調(diào)節(jié)pH7.2,過(guò)0.22 μm濾器除菌,-20 ℃保存[19]。

破碎物的制備:取厭氧培養(yǎng)16 h后的菌液10 mL,8000 r/min 4 ℃離心5 min收集菌體。用細(xì)胞培養(yǎng)洗滌2遍并將菌體懸于10 mL細(xì)胞培養(yǎng)基中。用超聲波細(xì)胞粉碎儀在500 W條件下,每處理10 s、間隔10 s,超聲15 min。在顯微鏡下觀察沒(méi)有完整菌體后,過(guò)0.22 μm濾器除菌,-20 ℃保存[20]。

1.2.3.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分組 發(fā)酵上清組:加入含10%(V/V)發(fā)酵上清的細(xì)胞培養(yǎng)基;陰性對(duì)照組:加入含10%(V/V) mMRS液體培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)基;陽(yáng)性對(duì)照組:加入含100 μg/mL小牛血清蛋白(BSA)[21]的細(xì)胞培養(yǎng)基;空白組:空孔加入細(xì)胞培養(yǎng)基。

破碎物組:加入含10%(V/V)破碎物的細(xì)胞培養(yǎng)基;陰性對(duì)照組:加入細(xì)胞培養(yǎng)基;陽(yáng)性對(duì)照組:加入含100 μg/mL BSA的細(xì)胞培養(yǎng)基;空白組:空孔加入細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.2.3.3 細(xì)胞增殖活性分析 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)采用CCK-8法[22]。調(diào)整CCD841 CoN細(xì)胞密度為3×104cell/mL,接種于96孔板,每孔100 μL,培養(yǎng)24 h貼壁待用。棄上清,分別加入12株雙歧桿菌的發(fā)酵上清組和破碎物組,及其陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照和空白組,每孔體積100 μL,設(shè)4個(gè)復(fù)孔,與細(xì)胞共作24 h。作用結(jié)束后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,37 ℃孵育2 h后振蕩混勻,在酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔光密度(OD)值,檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為450 nm。按下列公式計(jì)算細(xì)胞增殖活性。

細(xì)胞增殖活性(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(陰性組OD值-空白組OD值)×100

1.2.4 菌株H3-R2表面蛋白和分泌蛋白對(duì)CCD841 CoN細(xì)胞的增殖影響

1.2.4.1 雙歧桿菌H3-R2表面蛋白和分泌蛋白的制備 表面蛋白的制備:參照文獻(xiàn)[23]的方法并略做修改。取1 L于37 ℃厭氧培養(yǎng)16 h的雙歧桿菌H3-R2培養(yǎng)物,9000 r/min 4 ℃離心15 min收集沉淀,用PBS(pH7.2)洗滌2次。

在菌體中加入50 mL 5 mol/L LiCl溶液,在37 ℃于搖床(200 r/min)中處理30 min。9000 r/min 4 ℃離心15 min收集上清,過(guò)0.22 μm濾膜,收集濾液裝入8000 Da截留分子量的透析袋,在去離子水中透析48 h(4 ℃)后真空冷凍干燥,-20 ℃保存。

分泌蛋白的制備:參照文獻(xiàn)[24]的方法并略做修改。取1 L于37 ℃厭氧培養(yǎng)16 h的雙歧桿菌H3-R2培養(yǎng)物,9000 r/min 4 ℃ 離心15 min收集上清液,過(guò)0.22 μm濾膜除去菌體。向上清中加入三氯乙酸溶液,調(diào)整終濃度為10%,4 ℃靜止2 h,9000 r/min離心20 min,收集沉淀,用冷丙酮洗滌2次,真空冷凍干燥,-20 ℃保存。

1.2.4.2 表面蛋白和分泌蛋白的SDS-PAGE電泳 SDS-PAGE:分別取1 mg表面蛋白和分泌蛋白粉末溶解于100 μL 1% SDS溶液中,加入等量的2×SDS-PAGE緩沖液,沸水浴10 min,取10 μL上樣,進(jìn)行SDS-PAGE電泳。SDS-PAGE凝膠:12%分離膠、5%濃縮膠。電泳電壓:分離膠120 V,濃縮膠80 V。用考馬斯亮藍(lán)R250對(duì)凝膠染色4 h后出現(xiàn)明顯條帶,甲醇/醋酸脫色液脫色6 h后背景變淺、條帶清晰。凝膠成像系統(tǒng)拍照分析電泳結(jié)果。

1.2.4.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分組 表面蛋白組和分泌蛋白組:加入含表面/分泌蛋白濃度為100、50、25、10、5、1 μg/mL的細(xì)胞培養(yǎng)基;陽(yáng)性對(duì)照組:加入含100 μg/mL BSA的細(xì)胞培養(yǎng)基;陰性對(duì)照組:加入細(xì)胞培養(yǎng)基;空白組:空孔加入細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.2.4.4 細(xì)胞增殖活性分析 調(diào)整CCD841 CoN細(xì)胞密度為3×104cell/mL,接種于96孔板,每孔100 μL,培養(yǎng)24 h貼壁待用。棄上清,加入表面蛋白組和分泌蛋白組,及其陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照和空白組,每孔體積100 μL,設(shè)4個(gè)復(fù)孔,與細(xì)胞共作12、24、48 h。作用結(jié)束后,測(cè)量細(xì)胞增殖活性同1.2.3.3。

1.2.4.5 細(xì)胞周期、熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)分組 表面蛋白組:加入含表面蛋白濃度為50 μg/mL的細(xì)胞培養(yǎng)基;分泌蛋白組:加入含分泌蛋白濃度為10 μg/mL的細(xì)胞培養(yǎng)基;對(duì)照組:加入細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.2.4.6 細(xì)胞周期檢測(cè) 調(diào)整CCD841 CoN細(xì)胞密度為2×105cell/mL,接種于6 cm培養(yǎng)皿,每孔4 mL,培養(yǎng)24 h后貼壁待用。棄上清,分別加入表面蛋白組、分泌蛋白組以及對(duì)照組與細(xì)胞共作24 h。用胰蛋白酶消化細(xì)胞,1000 r/min離心5 min 收集細(xì)胞,棄去上清。用PBS洗滌1次,1000 r/min離心5 min,棄去上清。加入1 mL碘化丙啶染色工作液和10 μL破膜劑,振蕩混勻后室溫避光孵育30 min,避免振動(dòng),上流式細(xì)胞儀檢測(cè)[25]。

1.2.4.7 熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)水平 收集1.2.4.6中表面蛋白組、分泌蛋白組以及對(duì)照組與CCD841 CoN細(xì)胞共作24 h后的細(xì)胞,用試劑盒提取細(xì)胞總RNA,核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度及純度,符合A260/A280=1.8～2.1后用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,反應(yīng)體系20 μL,反應(yīng)條件:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。

用RT-PCR試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR,反應(yīng)體系25 μL,反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 min,95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,95 ℃延伸15 s,共40個(gè)循環(huán),60～95 ℃記錄熔解曲線,引物序列設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。在熒光定量PCR儀器上進(jìn)行反應(yīng),并記錄樣本循環(huán)閾值(Ct值)。以2-ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算基因表達(dá)量的變化。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù),結(jié)果以Means±SD表示。采用Origin 8.0軟件繪圖及擬合處理。運(yùn)用SPSS 23.0軟件,單因素方差分析以及Duncan多重比較分析,P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙歧桿菌對(duì)CCD841 CoN細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用

2.1.1 雙歧桿菌發(fā)酵上清的作用 細(xì)胞增殖活性百分比可以表示細(xì)胞增殖作用的強(qiáng)弱,其值大于100% 時(shí)表示有增殖促進(jìn)作用。12株菌中有7株菌(H4-1、H21-7、H6-7、H3-R2、H4-3、H10-1、H11-7)的發(fā)酵上清對(duì)CCD841 CoN細(xì)胞有增殖促進(jìn)作用(圖1)。與陰性對(duì)照組相比,添加菌株H4-1、H21-7、H6-7、H3-R2、H4-3、H10-1、H11-7的發(fā)酵上清液與細(xì)胞共作24 h的細(xì)胞增殖活性分別為:134%、102%、123%、137%、111%、114%、102%。并且添加菌株H4-1、H3-R2的發(fā)酵上清液與細(xì)胞共作24 h的增殖促進(jìn)效果均顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。

圖1 12株雙歧桿菌的發(fā)酵上清液對(duì)CCD841 CoN細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用

2.1.2 雙歧桿菌破碎物的增殖作用 12株菌中有7株菌(H21-7、H6-7、H15-7、H3-R2、H4-3、H9-3、H4-2)的細(xì)胞破碎物對(duì)CCD841 CoN細(xì)胞有增殖促進(jìn)作用(圖2)。與陰性對(duì)照組相比,添加菌株H21-7、H6-7、H15-7、H3-R2、H9-3、H4-2的破碎物與細(xì)胞共作24 h的細(xì)胞增殖活性分別為:124%、120%、140%、153%、110%、122%、157%。并且添加菌株H15-7、H3-R2、H4-2的破碎物與細(xì)胞共作24 h的增殖促進(jìn)效果均顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。

圖2 12株雙歧桿菌的破碎物對(duì)CCD841 CoN細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用

在12株雙歧桿菌中,只有菌株H3-R2的發(fā)酵上清液(圖1)和細(xì)胞破碎物(圖2)均對(duì)CCD841 CoN細(xì)胞有增殖促進(jìn)作用且顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05),具有潛在研究?jī)r(jià)值。

菌株H3-R2的發(fā)酵上清中存在著蛋白質(zhì)[26]、多糖[27]等物質(zhì),破碎物中存在著蛋白質(zhì)[28]、多糖[29]、脂磷壁酸[10]等物質(zhì)。由于這些物質(zhì)的存在,可能介導(dǎo)了CCD841 CoN細(xì)胞的增殖。已有研究發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌GG蛋白產(chǎn)物能夠促進(jìn)新生小鼠腸道的功能性成熟,包括腸道上皮細(xì)胞增殖、分化及緊密連接蛋白形成等[30]。為了了解雙歧桿菌H3-R2的表面蛋白和分泌蛋白是否對(duì)腸上皮細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用,本文提取了這兩種蛋白進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 雙歧桿菌H3-R2表面蛋白和分泌蛋白的鑒定

表面蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析后(圖3),分子量在大約43 kDa的蛋白質(zhì)得到極大的富集,是提取物中的主要蛋白質(zhì)種類(lèi)。已知表面蛋白分子量范圍25～71 kDa[31],并且與嗜酸乳桿菌表面蛋白相對(duì)分子質(zhì)量多在41～49 kDa之間相接近[32]。說(shuō)明本試驗(yàn)采取的LiCl提取法可提取到雙歧桿菌H3-R2的表面蛋白。

圖3 表層蛋白電泳圖

分泌蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析后(圖4),分子量在大約34 kDa和45 kDa。這與Bifidobacterium longum FNCC2705分泌蛋白相對(duì)分子質(zhì)量在20～60 kDa分布均勻相接近[33]。說(shuō)明本試驗(yàn)采取的三氯乙酸沉淀法可提取到雙歧桿菌H3-R2的分泌蛋白。

圖4 分泌蛋白電泳圖

2.3 雙歧桿菌H3-R2對(duì)CCD841 CoN細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用

2.3.1 表面蛋白的作用 菌株H3-R2表面蛋白對(duì)CCD841 CoN細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用受蛋白添加濃度和培養(yǎng)時(shí)間影響(圖5)。添加表面蛋白與CCD841 CoN細(xì)胞共作12 h時(shí),與陰性對(duì)照組比細(xì)胞活性最大增加至114%;蛋白濃度為50 μg/mL組對(duì)細(xì)胞有最大增殖促進(jìn)作用,且顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組(12 h)(P<0.05)。添加表面蛋白與CCD841 CoN細(xì)胞共作24 h時(shí),與陰性對(duì)照組比細(xì)胞活性增加113%～145%;蛋白濃度為50 μg/mL組對(duì)細(xì)胞有最大增殖促進(jìn)作用,且顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組(24 h)(P<0.05)。添加表面蛋白與CCD841 CoN細(xì)胞共作48 h時(shí),與陰性對(duì)照組比細(xì)胞活性增加110%～136%;蛋白濃度為25 μg/mL組對(duì)細(xì)胞有最大增殖促進(jìn)作用,且顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組(48 h)(P<0.05)。

圖5 菌株H3-R2的表面蛋白對(duì)CCD841 CoN細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用

添加表面蛋白濃度50 μg/mL與細(xì)胞共作24 h的細(xì)胞增殖促進(jìn)作用,高于蛋白濃度50 μg/mL與細(xì)胞共作12 h和蛋白濃度25 μg/mL與細(xì)胞共作48 h(P<0.05),是表面蛋白對(duì)細(xì)胞增殖促進(jìn)作用的最佳條件。

2.3.2 分泌蛋白的作用 菌株H3-R2分泌蛋白對(duì)CCD841 CoN細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用受蛋白添加濃度和培養(yǎng)時(shí)間影響(圖6)。添加分泌蛋白與CCD841 CoN細(xì)胞共作12 h時(shí),與陰性對(duì)照組比細(xì)胞活性增加102%～110%;蛋白濃度為10 μg/mL組對(duì)細(xì)胞有最大增殖促進(jìn)作用,且顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組(12 h)(P<0.05)。添加分泌蛋白與CCD841 CoN細(xì)胞共作24 h時(shí),與陰性對(duì)照組比細(xì)胞活性增加111%～128%;蛋白濃度為10 μg/mL組對(duì)細(xì)胞有最大增殖促進(jìn)作用,且與陽(yáng)性對(duì)照組(24 h)無(wú)顯著性差異(P<0.05)。添加表面蛋白與CCD841 CoN細(xì)胞共作48 h時(shí),與陰性對(duì)照組比細(xì)胞活性增加104%～121%;蛋白濃度為5 μg/mL組對(duì)細(xì)胞有最大增殖促進(jìn)作用,且與陽(yáng)性對(duì)照組(48 h)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

圖6 菌株H3-R2的分泌蛋白對(duì)CCD841 CoN細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用

添加分泌蛋白濃度10 μg/mL與細(xì)胞共作24 h的細(xì)胞增殖促進(jìn)作用,高于蛋白濃度10 μg/mL與細(xì)胞共作12 h和蛋白濃度5 μg/mL與細(xì)胞共作48 h,是分泌蛋白對(duì)細(xì)胞增殖促進(jìn)作用的最佳條件。

綜上所述,選取添加菌株H3-R2表面蛋白50 μg/mL為表面蛋白組,分泌蛋白濃度10 μg/mL為分泌蛋白組,與CCD841 CoN細(xì)胞共作24 h后,進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)以及增殖相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)。

2.4 雙歧桿菌H3-R2表面蛋白和分泌蛋白對(duì)CCD841 CoN細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞的周期循環(huán)速度決定了細(xì)胞的增殖速度[34]。因此可以猜測(cè),細(xì)胞添加表面蛋白或分泌蛋白后,細(xì)胞周期循環(huán)加速進(jìn)而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖。為證實(shí)這一觀點(diǎn),本文采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面蛋白和分泌蛋白對(duì)CCD841 CoN細(xì)胞周期循環(huán)的影響。

流式細(xì)胞術(shù)分析所示,第一個(gè)紅色峰為G0/G1期,第二個(gè)紅色峰代表G2/M期,兩峰之間的斜線填充部分為S期(圖7)。對(duì)照組、表面蛋白組和分泌蛋白組與CCD841 CoN細(xì)胞共作24 h后,各個(gè)細(xì)胞周期發(fā)生變化(圖8)。對(duì)照組的周期分布是G0/G1期為56.29%,S期為23.37%,G2/M期為20.34%;表面蛋白組的周期分布是G0/G1期為48.24%,S期為30.38%,G2/M期為21.38%;分泌蛋白組的周期分布是G0/G1期為53.10%,S期為25.56%,G2/M期為21.34%。與對(duì)照組相比,表面蛋白組的G0/G1期細(xì)胞比例下降了14.30%,S期細(xì)胞比例上升了30.00%;與對(duì)照組相比,分泌蛋白組的G0/G1期細(xì)胞比例下降了5.67%,S期細(xì)胞比例上升了9.37%。上述結(jié)果表明,菌株H3-R2的表面蛋白和分泌蛋白

圖7 表面蛋白和分泌蛋白對(duì)CCD841 CoN細(xì)胞周期分布的影響

圖8 表面蛋白和分泌蛋白細(xì)胞對(duì)各個(gè)細(xì)胞周期所占的百分比的影響

2.5 雙歧桿菌H3-R2表面蛋白和分泌蛋白對(duì)增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響

Lee等[8]的研究表明,給小鼠喂食雙歧桿菌和乳桿菌等乳酸產(chǎn)生菌,可顯著促進(jìn)腸上皮的腸道干細(xì)胞、潘氏細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的增殖。乳酸作用于潘氏細(xì)胞和腸基質(zhì)細(xì)胞上的G蛋白偶聯(lián)受體Gpr81,影響β-catenin、c-Myc、Cyclin D1、Axin2和GSK-3β等相關(guān)基因的表達(dá),刺激腸道細(xì)胞的增殖。

增殖相關(guān)基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2,與對(duì)照組相比,表面蛋白組和分泌蛋白組與CCD841 CoN細(xì)胞共作用24 h后,胞內(nèi)β-catenin、c-Myc和Cyclin D1基因的表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.05),Axin2、GSK-3β基因的表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)。該結(jié)果表明,在表面蛋白或分泌蛋白的作用下,抑制了降解β-catenin復(fù)合物(Axin1/2、GSK-3β等蛋白形成)的激活,β-catenin 可在細(xì)胞內(nèi)蓄積并向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移,起始轉(zhuǎn)錄c-Myc、CyclinD1等靶基因,促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移。其中CyclinD1與細(xì)胞周期直接相關(guān)[35],高表達(dá)時(shí)表明加快細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期,從而促進(jìn)細(xì)胞增殖,這與上述細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果相一致。因此可以從轉(zhuǎn)錄組水平驗(yàn)證了細(xì)胞增殖結(jié)果。

表2 表面蛋白和分泌蛋白的添加對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從12株嬰兒源雙歧桿菌中篩選出雙歧桿菌H3-R2,其發(fā)酵上清液和破碎物均對(duì)CCD841 CoN細(xì)胞有較好的增殖促進(jìn)作用,表明該菌株具有促進(jìn)新生兒腸道發(fā)育功能的潛在研究?jī)r(jià)值。菌株H3-R2的表面蛋白和分泌蛋白成分對(duì)細(xì)胞增殖有一定的積極作用,可加速細(xì)胞周期循環(huán),并在轉(zhuǎn)錄組水平上調(diào)節(jié)增殖相關(guān)基因變化。本文初步探討了雙歧桿菌H3-R2對(duì)人胎結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖促進(jìn)作用及機(jī)制,但對(duì)蛋白成分的作用程度和具體的蛋白組分仍不清楚,有待進(jìn)一步研究。