劉 暢,徐 悅,單承鶯,朱昌玲,趙 飛,張煥仕,*

(1.南京野生植物綜合利用研究院,江蘇南京 211100;2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇南京 210023)

芫荽(CoriandrumsativumL.)俗稱香菜,屬一年或兩年生的傘形科草本,是一種藥食兩用的香料植物。芫荽性溫味辛入肺脾經(jīng),營養(yǎng)成分豐富、保健功能強,含有多種對人體有益的活性物質(zhì),具有抗氧化、抗菌、降血糖、抗炎癥等功能,還有報道稱其具解毒的效果[1-2]。近年來,香辛食品植物的抗氧化活性得到了廣泛的關(guān)注和研究,其中芫荽的抗氧化功能更是成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點[3-5]。目前,芫荽的抗氧化研究大多注重以體外清除自由基活性能力為主[6-7],體內(nèi)實驗還鮮見報道,不利于多方位了解芫荽的生物學(xué)功能和潛在開發(fā)價值。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)簡稱線蟲,屬于線蟲動物門小干線蟲屬,是一種體積小、易飼養(yǎng)且操作簡便的模式生物,其神經(jīng)、消化、生殖系統(tǒng)與哺乳動物具有高度同源性[8-10],受到了遺傳學(xué)、藥理學(xué)、發(fā)育學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等眾多生物領(lǐng)域研究者的高度重視,被廣泛應(yīng)用于生物實驗的前期探索過程中,是一種可用于物質(zhì)性質(zhì)評價和機制探究的經(jīng)濟便捷的模式生物[11-12]。

百草枯(Paraquat,PQ),化學(xué)名為1,1′-二甲基4-4′-聯(lián)吡啶二氯化物,是一種劇毒的非選擇接觸性季銨類除草劑。PQ毒性損害機制主要包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、核轉(zhuǎn)錄因子過度表達、凋亡等,其中氧化應(yīng)激反應(yīng)在PQ中毒機體損傷中發(fā)揮主要作用。PQ作為電子受體可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生大量活性氧(Reactive oxygen species,ROS),造成細胞膜脂質(zhì)過氧化,產(chǎn)生氧化損傷,破壞機體自身氧化物及細胞內(nèi)防御系統(tǒng)狀態(tài)平衡[13-14]。因此,本研究用百草枯作為自由基引發(fā)劑來探討秀麗隱桿線蟲在氧化脅迫后,芫荽提取物對生物體的抗氧化作用。

在秀麗隱桿線蟲中,胰島素/IGF-1(IIS)信號通路是一條進化上保守的內(nèi)分泌通路,能夠調(diào)節(jié)各種生物的壽命并讓生物在受迫的條件下存活,其中daf-2和daf-16是該信號通路中的兩個關(guān)鍵基因[15]。daf-2是哺乳動物胰島素/IGF受體的同源物,daf-16是FOXO轉(zhuǎn)錄因子同系物。激活的daf-2會與INS-7和AGE-1/PI3K/AKT相互作用,從而削弱了daf-16的轉(zhuǎn)錄活性。daf-2缺失株會抑制IIS信號通路,促進daf-16的轉(zhuǎn)錄水平,從而上調(diào)一系列基因的表達,促進滯育期的形成,延長壽命、促進代謝、提高應(yīng)激反應(yīng)、天然免疫能力等,daf-2活力的下降可以延長線蟲的壽命達一倍[16]。IIS與哺乳動物中的胰島素信號通路有著高度的相似性,利用秀麗線蟲研究該通路在調(diào)節(jié)碳水化合物代謝以及衰老的機制成為近年來科學(xué)家們關(guān)注的熱點。

本文通過探究芫荽不同部位水提物處理后的秀麗隱桿線蟲體內(nèi)活性氧水平、急性氧損傷的保護作用來評價芫荽的體內(nèi)抗氧化活性,同時還從基因水平上初步探究芫荽不同部位水提物抗氧化作用發(fā)生機制,以期進一步為芫荽的抗氧化活性研究和開發(fā)其價值提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芫荽成熟后期的籽實和莖葉 江蘇南京高淳地區(qū),經(jīng)南京野生植物綜合利用研究院肖正春教授鑒定為傘形科芫荽屬CoriandrumsativumL.;N2野生型秀麗隱桿線蟲、OP50(尿嘧啶滲漏突變型)大腸桿菌 由東南大學(xué)惠贈;百草枯 美國Sigma公司;ROS活性氧測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;總RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、SYBR Premix EX Taq(Tli RnaseH Plus)試劑盒 Takara試劑有限公司;其余試劑 均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

FW-100高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;JCS-600型電子天平 凱豐集團有限公司;T6紫外/可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮儀器廠;循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州天瑞儀器有限公司;奧林巴斯顯微鏡(Olympus_BX41) 奧林巴斯(中國)有限公司;HCB-1300V潔凈工作臺 青島海爾特種電器有限公司;JW-2017HR高速冷凍離心機 安徽嘉文儀器裝備有限公司;SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;MG96+PCR儀 杭州朗基科學(xué)儀器有限公司;Biosens SC810凝膠成像系統(tǒng) 上海山富科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 芫荽提取物制備 提取方法參考文獻[17-18],芫荽籽和莖葉洗凈,置于常溫中自然晾干。粉碎芫荽籽和莖葉后過40目篩,分別以蒸餾水煮籽粉末和莖葉,料液比為1∶10 g/mL,煮沸水提3 h,過濾后得濾液,再經(jīng)減壓濃縮、干燥得各自水提物浸膏。以蒸餾水復(fù)配得水提液備用。

1.2.2 NGM培養(yǎng)基的配制 在975 mL蒸餾水中分別加入3 g氯化鈉、2.5 g多聚蛋白胨和17 g瓊脂粉,高壓蒸汽滅菌,取出后放置于超凈工作臺中,向溶液中分別加入1 mL 1 mol/L氯化鈣溶液、1 mL 1 mol/L硫酸鎂溶液以及25 mL 0.1 mol/L磷酸鉀溶液,混勻,待溶液冷卻至50 ℃時再加入1 mL 5 mg/L膽固醇,搖晃均勻后倒入無菌培養(yǎng)皿中,備用。

1.2.3 秀麗隱桿線蟲同步化處理 同步化方法參考文獻[19],以LB液體培養(yǎng)基活化OP50大腸桿菌,然后將108CFU/mL菌液以1/2培養(yǎng)皿半徑于培養(yǎng)基中心處涂布畫圓,在超凈工作臺內(nèi)自然風干后使用。正常培養(yǎng)的線蟲在成蟲后通過顯微鏡觀察可見其體內(nèi)的蟲卵,當一塊培養(yǎng)基上大多數(shù)線蟲體內(nèi)有蟲卵時可進行同步化。用M9緩沖液將線蟲沖洗收集至無菌EP管中,待蟲體沉降至管底時加入緩沖液反復(fù)洗滌至溶液無明顯渾濁,去上清,再加入1 mL裂解液(1 mol/L NaOH與2.5%(V/V)NaClO等比混合,現(xiàn)配現(xiàn)用),立即混勻,上下倒顛5 min后4000 r/min離心1 min,留沉淀,加入M9緩沖液,再離心,重復(fù)3次,最后把沉淀移至新的NGM培養(yǎng)基上,20 ℃培養(yǎng)48 h后得L4期線蟲。

1.2.4 秀麗隱桿線蟲暴露方法 分別制備芫荽籽和莖葉水提物溶液,設(shè)置濃度為0.1、1、10 mg/mL。取同步化后L4期成蟲分別以不同濃度的兩種水提物溶液處理線蟲24 h后,分別將其以M9緩沖液沖洗收集在無菌EP管中,反復(fù)洗滌直至上清液無渾濁。

1.2.5 體內(nèi)ROS活性氧水平 取同步化并暴露過的線蟲,按照ROS活性氧試劑盒操作說明配試劑、處理線蟲4 h后,用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察線蟲體內(nèi)產(chǎn)生的熒光強度,并拍照記錄,激發(fā)波長488 nm,測量波長510 nm。

1.2.6 百草枯急性氧損傷實驗 不同濃度芫荽水提物暴露后的線蟲去除上清液,放入96孔板中每孔10條,分別加入40 μL 100 mmol/L百草枯溶液,20 ℃環(huán)境下處理6 h后計數(shù)每孔中存活著的線蟲個數(shù),各濃度三個平行,實驗重復(fù)三次,計算存活率,取平均值[20]。

存活率(%)=存活條數(shù)/總條數(shù)×100

1.2.7 逆轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR

1.2.7.1 引物設(shè)計 參照Wormbase上線蟲胰島素信號通路上的基因序列,使用Primer軟件設(shè)計了actin-1、daf-2和daf-16三個基因的引物特異性序列,其中actin-1為管家基因。daf-2作為胰島素受體同源物定位于細胞膜上,是線蟲中表達胰島素受體家族的唯一成員,與細胞胞外類似胰島素配體結(jié)合后,會使得一系列信號級聯(lián)反應(yīng)在細胞內(nèi)發(fā)生,最終通過磷酸化daf-16達到抑制其進入細胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能,從而延長動物的壽命。引物序列具體見表1。

表1 實時定量PCR引物序列

1.2.7.2 總RNA提取 按照試劑盒說明稱取1.2.4暴露處理后的10 mg/mL秀麗隱桿線蟲若干,以M9緩沖液處理后的線蟲為空白對照,提取的總RNA以RNase Free蒸餾水溶解,提取的RNA純度和濃度根據(jù)OD260/280比值判斷。

1.2.7.3 cDNA合成及實時定量PCR 取1.2.7.2實驗所得總RNA提取液,按照試劑盒說明在超凈工作臺中進行冰上操作,所需用具均需要經(jīng)過滅菌處理。cDNA合成具體反應(yīng)體系如表2,實時定量PCR反應(yīng)體系具體如表3,基因最終表達結(jié)果以目標基因與管家基因的比值來表示。反轉(zhuǎn)錄和實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)的程序設(shè)計為:按照12.5 μL中625 ng總RNA,40 mol/L逆轉(zhuǎn)錄引物,4000 mol/L Tris-HCl,6000 mol/L KCl,240 mol/L MgCl2,800 mol/L二硫蘇糖醇,20 U RNA酶抑制劑和100 U逆轉(zhuǎn)錄酶混合,在25 ℃孵育5 min和42 ℃孵育60 min后,逆轉(zhuǎn)錄酶滅活70 ℃ 15 min,-20 ℃保存?zhèn)溆?。按照cDNA 1 μL,SYBR Green I Master Mix 8 μL,SYBR Green I Master Plus 2 μL,forward primer 1.2 μL,reserse primer 1.2 μL,H2O 6.6 μL的構(gòu)成配成20 μL體系,ABI 7500實時PCR儀上94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃ 30 s,特定溫度退火30 s,72 ℃延伸30 s并采集熒光信號,共進行40個循環(huán)。以比較域值法測定目的基因相對表達水平,以內(nèi)參(act-1)做均一化處理,實驗組和對照組的ΔCt=Ct目的-Ct內(nèi)參,表示目的基因相當于內(nèi)參表達的比例;ΔΔCt=ΔCt暴露組-ΔCt對照組,以2-ΔΔCt±S.D可反映劑量組與對照組目的基因表達的差異(倍數(shù))。

表2 cDNA反應(yīng)體系

表3 實時定量PCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

熒光強度分析使用Image J圖像軟件,實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件處理并進行統(tǒng)計學(xué)方差分析,顯著水平0.05與0.01代表統(tǒng)計分析上的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS水平

ROS與各種疾病,包括急性中毒、心血管疾病、炎癥、各種病毒性損傷、藥物性組織損傷、高血壓等的病理過程以及衰老的生理變化密切相關(guān)。過量的ROS會破壞機體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的平衡狀態(tài),導(dǎo)致組織細胞脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)損傷、DNA斷裂等,需要使用抗氧化劑和自由基清除劑來減輕或阻止機體損傷。DCFH-DA(2,7-dichlorofuorescin diacetate)是迄今最常用、最靈敏的細胞內(nèi)活性氧檢測探針。進入細胞后DCFH-DA被酯酶水解為DCFH,活性氧會將其氧化為DCF,這是一種不能透過細胞膜的強綠色熒光物質(zhì),其熒光強度與細胞內(nèi)活性氧水平呈正比。

如圖1所示,與空白對照組相比,經(jīng)過不同濃度的芫荽籽水提物處理后線蟲體內(nèi)熒光強度呈現(xiàn)明顯減弱,說明線蟲體內(nèi)活性氧水平下降。隨著芫荽籽水提物濃度的逐漸增大,線蟲體內(nèi)熒光強度不斷下降,當濃度達到10 mg/mL時,熒光強度最暗,說明芫荽籽的水提物能夠有效的降低秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS水平。

圖1 芫荽籽水提物對線蟲體內(nèi)活性氧水平的影響

芫荽莖葉水提物對線蟲的作用結(jié)果如圖2,與對照相比,莖葉水提物處理后的線蟲體內(nèi)熒光強度也發(fā)生明顯減弱的趨勢,隨著濃度增加,熒光強度逐漸減弱,最大濃度10 mg/mL處理時熒光強度最弱,由此可以說明芫荽莖葉水提物也有降低線蟲體內(nèi)ROS活性氧水平的作用。

圖2 芫荽莖葉水提物對線蟲活性氧水平的影響

2.2 PQ對秀麗隱桿線蟲存活率的影響

氧化應(yīng)激是PQ損傷的主要機制,通過體外運用具有抗氧化作用的芫荽水提物可明顯減輕PQ誘導(dǎo)的氧化損傷。由圖3可知,對照組線蟲經(jīng)PQ損傷6 h后存活率為57.78%±1.92%,而經(jīng)0.1、1、10 mg/mL的芫荽籽水提物處理后,線蟲的存活率均極顯著增加(P<0.01),分別為71.11%±1.92%、86.67%±3.33%和87.78%±6.94%,且隨著處理濃度的增加,秀麗隱桿線蟲的存活率呈正相關(guān)增長趨勢。

圖3 不同濃度芫荽籽水提物對百草枯誘導(dǎo)線蟲存活率的影響

芫荽莖葉水提物處理后的線蟲見圖4,在濃度為0.1 mg/mL時存活率與對照組差異不顯著,當濃度為1、10 mg/mL時存活率出現(xiàn)顯著上升(P<0.05),存活率最大達到78.89%±5.09%。由此可見,芫荽籽和莖葉水提物在PQ損傷中均能夠發(fā)揮保護作用,其中芫荽籽水提物效果更佳,在較低濃度下(0.1 mg/mL)就能起防護功效。

圖4 不同濃度芫荽莖葉水提物對百草枯誘導(dǎo)線蟲存活率的影響

2.3 秀麗隱桿線蟲體內(nèi)胰島素信號途徑抗氧化基因的表達

秀麗隱桿線蟲生理指標的影響與胰島素/IGF-1(IIS)信號通路密切相關(guān)[21-22],IIS信號通路的減弱會導(dǎo)致線蟲壽命的延長、天然免疫系統(tǒng)和氧化應(yīng)激能力的增強,這些表型的適應(yīng)依賴于daf-16的激活,該轉(zhuǎn)錄因子促進了一系列與線蟲生長發(fā)育相關(guān)基因的表達[23-25]。實驗選用10 mg/mL芫荽水提物處理后的線蟲探究基因daf-2和daf-16是否發(fā)揮作用。

由圖5可知,經(jīng)過10 mg/mL芫荽籽和莖葉水提物處理后,線蟲中daf-2基因表達水平均極顯著降低(P<0.01),線蟲體內(nèi)氧化衰老有關(guān)的IIS信號通路daf-2表達下調(diào),會調(diào)控daf-16基因表達表達量升高,與本實驗結(jié)果趨勢相吻合。因此,初步推測芫荽水提物在線蟲體內(nèi)表現(xiàn)出的抗氧化效果可能是daf-2和daf-16基因相互作用的結(jié)果。

圖5 芫荽水提物對胰島素信號通路目標基因表達的影響

3 討論與結(jié)論

本文以秀麗隱桿線蟲為模型探究芫荽兩種不同部位水提物的體內(nèi)抗氧化作用。正常的生理狀態(tài)下,生物體內(nèi)ROS處于產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡,適量的ROS不會對機體造成損傷,但過多的ROS就會對機體代謝產(chǎn)生干擾,引起各種慢性疾病和衰老[26]。芫荽水提物可以顯著減少線蟲體內(nèi)ROS的積累,具有良好的體內(nèi)抗氧化活性。PQ引起線蟲體內(nèi)急性氧化應(yīng)激結(jié)果表明,經(jīng)過芫荽水提物前處理的線蟲在PQ環(huán)境下的生存率明顯高于空白對照組,提高秀麗隱桿線蟲的壽命。已有報道表明芫荽提取物具有良好的體外抗氧化效果[18],本文通過體內(nèi)抗氧化生理實驗也取得了一致的結(jié)論,由此充分證實芫荽能夠有效抵御氧化傷害。

基因daf-2和daf-16在線蟲胰島素信號途徑起著至關(guān)重要地位,對線蟲的抗衰老和延長壽命發(fā)揮著關(guān)鍵作用[27]。Libina等[28]發(fā)現(xiàn)胰島素蛋白既可以使daf-16-生殖細胞缺陷型線蟲的壽命恢復(fù)到正常水平,同時還能大幅度提升daf-16-胰島素途徑線蟲突變株的壽命長度,實驗表明抑制daf-2或激活daf-16,從而平衡和調(diào)整下游基因的表達來延緩線蟲體內(nèi)衰老的速率。本實驗探究10 mg/L芫荽水提物處理后,發(fā)現(xiàn)線蟲胰島素信號途徑中daf-2表達量的下降促進了daf-16基因表達量的顯著提高,可推測芫荽籽和成熟莖葉水提物對線蟲的抗氧化保護作用與這兩種基因的調(diào)控表達密切相關(guān),具體作用機制還需要進一步深入研究。