陳 瓊,董華夏,戴小芳,劉 萍,晏 濤,酈 娟

(武漢食品化妝品檢驗(yàn)所,湖北武漢 430012)

我國(guó)是世界上第一大的畜禽肉消費(fèi)國(guó)[1],畜禽肉中的致病菌污染嚴(yán)重威脅著我國(guó)食品安全[2-3],其中,金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)已成為生鮮畜禽肉中食源性致病菌的重大隱患[4-5]。

肉類食物因含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分,可以滿足金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)需求,使其產(chǎn)生腸毒素,這也是金黃色葡萄球菌引起食物中毒的主要原因[6]。金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)一般按國(guó)標(biāo)GB 4789.10-2016[7]進(jìn)行傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn),但是傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)由于檢驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng),操作繁瑣,在實(shí)際操作中存在一定的限制[8]?，F(xiàn)代分子生物學(xué)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)由其操作簡(jiǎn)單、快速,被廣泛的應(yīng)用于食品安全檢測(cè)[9-10]。由于Bst DNA 聚合酶的使用使環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)實(shí)現(xiàn)了在恒溫條件(60～65 ℃)下的快速擴(kuò)增,并在1 h內(nèi)完成檢驗(yàn)且無(wú)需復(fù)雜的儀器設(shè)備[11-12]。當(dāng)前,基于LAMP法的金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)方法研究已成為熱門[13-14]。但是,由于PCR技術(shù)無(wú)法區(qū)分死菌和活菌,從而使反應(yīng)結(jié)果容易出現(xiàn)假陽(yáng)性[15],經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),疊氮溴化丙啶(propidium monoazide,PMA)在一定光照條件下可以與死菌DNA結(jié)合且不影響活菌DNA的擴(kuò)增[16-17],因此在樣品處理階段添加一步PMA處理可有效抑制死菌的擴(kuò)增,提高結(jié)果準(zhǔn)確率[18-19]。同時(shí)在LAMP反應(yīng)中添加熒光指示劑羥基萘酚藍(lán)(hydroxynaphthol blue,HNB),可使反應(yīng)結(jié)果直接通過(guò)顏色來(lái)判斷[20-22]。

本研究建立的PMA-HNB-LAMP聯(lián)用技術(shù)可成功應(yīng)用于畜禽肉中金黃色葡萄球菌活菌的快速檢測(cè),實(shí)現(xiàn)了檢驗(yàn)技術(shù)的高效快速準(zhǔn)確,具有一定的推廣價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

火腿腸(3份)、市售冷凍畜禽肉產(chǎn)品(共50份,豬肉10份、牛肉8份、羊肉7份、雞肉10份、鴨肉8份、鵝肉7份);實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)菌株及其他菌株,見(jiàn)表1 均購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心或美國(guó)典型菌種保藏中心等;樣品分離菌株,見(jiàn)表2 為本實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)分離獲得;7.5%氯化鈉肉湯、Baird-Parker瓊脂、血瓊脂平板、腦心浸出液肉湯(BHI) 北京陸橋技術(shù)股份有限公司;革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌鑒定卡、革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡 生物梅里埃美國(guó)股份有限公司;TIANGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、DEAOU細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒;金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)試劑盒 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

表1 實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)菌株

表2 樣品分離菌株

X-30冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司;PL601-L電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HH.S21-8-S數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;CFX96 TOUCH熒光定量PCR儀 美國(guó)伯樂(lè)公司;VITEK2 compact system全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng) 美國(guó)Biomerieux公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌可視化HNB-LAMP檢測(cè)方法的建立

1.2.1.1 DNA提取 標(biāo)準(zhǔn)菌株及分離菌株DNA提取:使用TIANGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)按說(shuō)明書方法提取細(xì)菌DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

檢測(cè)樣品增菌液DNA提取:檢測(cè)樣品按照GB 4789.10-2016[7]進(jìn)行增菌培養(yǎng),使用DEAOU細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒按說(shuō)明書方法提取細(xì)菌DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 LAMP擴(kuò)增體系的建立 參照SN/T 2754.1-2011《出口食品中致病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)方法 第1部分:金黃色葡萄球菌》設(shè)計(jì)引物和反應(yīng)體系[23],反應(yīng)體系見(jiàn)表3。反應(yīng)條件設(shè)置為:63 ℃反應(yīng)45 min。

表3 金黃色葡萄球菌LAMP擴(kuò)增體系

1.2.1.3 HNB濃度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 制備濃度為106CFU/mL金黃色葡萄球菌活菌菌懸液,提取DNA。在建立的反應(yīng)體系中加入終濃度為240、210、180、150、120、90、60、30 μmol/L的羥基萘酚藍(lán),通過(guò)肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果。

1.2.2 HNB-LAMP法的特異性和靈敏度分析

1.2.2.1 靈敏度分析 標(biāo)準(zhǔn)菌株靈敏度分析:將金黃色葡萄球菌菌株接種到BHI增菌液中,(36±1) ℃培養(yǎng)12 h,用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋,得到濃度為10～106CFU/mL的活菌菌懸液,每個(gè)稀釋度分別吸取1 mL以0.3、0.3、0.4 mL接種量分別接種到三塊Baird-Parker平板進(jìn)行計(jì)數(shù)[7]。同時(shí),按照1.2.1.1提取DNA,并按前文所建立的金黃色葡萄球菌可視化HNB-LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè),進(jìn)行靈敏度分析。

基質(zhì)靈敏度分析:取火腿腸25 g(按照GB 4789.10-2016[7]檢測(cè)為未污染目標(biāo)菌樣品)加入到225 mL無(wú)菌生理鹽水中,均質(zhì)。分別取1 mL梯度稀釋純菌液加入到9 mL樣品勻漿里,混勻,同時(shí)進(jìn)行計(jì)數(shù)以確定實(shí)際濃度。得到濃度為10～108CFU/mL的樣品勻液,抽提DNA作為模板,按照前文建立的金黃色葡萄球菌可視化HNB-LAMP反應(yīng)體系,進(jìn)行靈敏度分析。

1.2.2.2 特異性分析 將表1和表2的菌株進(jìn)行培養(yǎng),按1.2.1提取各菌株的DNA,按照前文建立的金黃色葡萄球菌可視化HNB-LAMP反應(yīng)體系,進(jìn)行特異性分析。

1.2.3 HNB-LAMP法與其他檢測(cè)方法的比較 選取以鈣黃綠素-LAMP為檢驗(yàn)原理的某金黃色葡萄球菌檢測(cè)試劑盒,比較其與本研究確定的HNB-LAMP法的標(biāo)準(zhǔn)菌株靈敏度和基質(zhì)靈敏度。

1.2.4 HNB-LAMP法檢測(cè)實(shí)際樣品 隨機(jī)選取15份冷凍畜肉和15份冷凍禽肉,在45 ℃以下不超過(guò)15 min解凍[7],分別稱取25 g加入盛有225 mL 7.5% 氯化鈉肉湯的無(wú)菌均質(zhì)袋中,均質(zhì)1～2 min,于(36±1) ℃培養(yǎng)18～24 h。將培養(yǎng)后的增菌液一分為二,一組參考國(guó)標(biāo)法GB 4789.10-2016[7]進(jìn)行定性檢測(cè),一組經(jīng)HNB-LAMP法檢測(cè),比較兩組最終的檢測(cè)結(jié)果。

1.2.5 PMA處理的優(yōu)化

1.2.5.1 不抑制活菌擴(kuò)增的最高PMA濃度 吸取平板計(jì)數(shù)定量為104～107CFU/mL的菌懸液0.5 mL,加入不同量的PMA工作液,充分混勻,室溫避光孵育5 min,鹵素?zé)粝缕毓?5 min[24],按1.2.1.1提取DNA進(jìn)行qPCR反應(yīng)。

1.2.5.2 完全抑制死菌擴(kuò)增的最低PMA濃度 選擇平板計(jì)數(shù)定量為105～106CFU/mL的菌懸液,100 ℃煮沸10 min[17],吸取1 mL菌液以0.3、0.3、0.4 mL接種量分別接種三塊Baird-Parker平板,(36±1) ℃培養(yǎng)24～48 h,以確認(rèn)金黃色葡萄球菌被完全滅活。吸取0.5 mL死菌菌懸液,加入不同量的PMA工作液,充分混勻,室溫避光孵育5 min,鹵素?zé)粝缕毓?5 min,按1.2.1.1提取DNA進(jìn)行qPCR反應(yīng)。

1.2.6 PMA-HNB-LAMP檢測(cè)人工污染金黃色葡萄球菌的陽(yáng)性樣品 人工污染2個(gè)火腿腸樣品(按照GB 4789.10-2016[7]檢測(cè)為未污染目標(biāo)菌樣品),污染濃度約為105CFU/mL金黃色葡萄球菌活菌和死菌。利用傳統(tǒng)微生物方法、HNB-LAMP法和PMA-HNB-LAMP法進(jìn)行檢測(cè)。HNB-LAMP法和PMA-HNB-LAMP法直接取樣品勻液進(jìn)行后續(xù)檢測(cè),傳統(tǒng)微生物方法將樣品勻液作為7.5% NaCl肉湯增菌液進(jìn)行后續(xù)檢驗(yàn)。

1.2.7 PMA-HNB-LAMP檢測(cè)實(shí)際樣品 隨機(jī)選取10份冷凍畜肉和10份冷凍禽肉,在45 ℃以下不超過(guò)15 min解凍[7],分別稱取25 g加入盛有225 mL 7.5%氯化鈉肉湯的無(wú)菌均質(zhì)袋中,均質(zhì)1～2 min,于(36±1) ℃培養(yǎng)18～24 h。將培養(yǎng)后的增菌液一分為二,一組參考國(guó)標(biāo)法GB 4789.10-2016[7]進(jìn)行定性檢測(cè),一組經(jīng)HNB-LAMP法和PMA-HNB-LAMP法檢測(cè),比較三種方法的檢測(cè)結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本文PCR反應(yīng)的原始數(shù)據(jù)均由Bio-Rad CFX Manager處理后導(dǎo)出,然后采用EXCEL 2010版進(jìn)行線性擬合和繪圖,并采用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌可視化HNB-LAMP法的建立

2.1.1 HNB濃度的選擇 實(shí)驗(yàn)表明,向LAMP實(shí)驗(yàn)體系中添加HNB,可以使反應(yīng)結(jié)果通過(guò)簡(jiǎn)單的顏色變化直觀的反映出來(lái),即陽(yáng)性為天藍(lán)色,陰性為紫羅蘭色[21]。在本研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng)添加的HNB濃度在150～240 μmol/L范圍內(nèi)時(shí),陰性和陽(yáng)性結(jié)果差異明顯,結(jié)果見(jiàn)圖1。為保證建立的HNB-LAMP法具有高檢出率,本實(shí)驗(yàn)選取210 μmol/L濃度的HNB添加到LAMP反應(yīng)體系中。

圖1 LAMP反應(yīng)體系中添加不同濃度的HNB的顯色結(jié)果

2.1.2 HNB-LAMP法的靈敏度分析

2.1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株的靈敏度分析 金黃色葡萄球菌HNB-LAMP法的靈敏度分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4,由表4可知,本研究建立的HNB-LAMP法的菌株靈敏度為104CFU/mL。

表4 HNB-LAMP法的標(biāo)準(zhǔn)菌株靈敏度分析結(jié)果

2.1.2.2 人工污染樣品基質(zhì)的靈敏度分析 用HNB-LAMP法檢測(cè)人工污染金黃色葡萄球菌活菌的樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)樣品-菌混合液中金黃色葡萄球菌活菌的濃度為105～108CFU/mL時(shí),反應(yīng)結(jié)果呈陽(yáng)性,見(jiàn)表5。由表5可知,建立的HNB-LAMP法的樣品基質(zhì)靈敏度為105CFU/mL。

表5 HNB-LAMP法的樣品基質(zhì)靈敏度分析結(jié)果

2.1.2.3 HNB-LAMP法與其他檢測(cè)方法的靈敏度比較 挑選以鈣黃綠素-LAMP法為檢驗(yàn)原理的某金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)試劑盒,以濃度為10～106CFU/mL的金黃色葡萄球菌活菌DNA作為模板,按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知,市售的某金黃色葡萄球菌檢測(cè)試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)菌株靈敏度為104CFU/mL。本研究建立的HNB-LAMP法與市售的成品試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)菌株靈敏度相同。

表6 市售的某金黃色葡萄球菌檢測(cè)試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)菌株靈敏度分析結(jié)果

在用上述市售的金黃色葡萄球菌檢測(cè)試劑盒檢測(cè)人工污染金黃色葡萄球菌的樣品基質(zhì)實(shí)驗(yàn)中,可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)金黃色葡萄球菌的濃度為106～108CFU/mL時(shí),反應(yīng)結(jié)果呈陽(yáng)性,結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可知,市售的某金黃色葡萄球菌檢測(cè)試劑盒的樣品基質(zhì)靈敏度為106CFU/mL。本研究建立的HNB-LAMP法的樣品基質(zhì)靈敏度略優(yōu)于市售的成品試劑盒的樣品基質(zhì)靈敏度。

表7 市售的某金黃色葡萄球菌檢測(cè)試劑盒的樣品基質(zhì)靈敏度分析結(jié)果

2.1.3 HNB-LAMP法的特異性分析 利用建立的金黃色葡萄球菌可視化HNB-LAMP法,按照1.2.2.2進(jìn)行特異性分析,結(jié)果見(jiàn)表8。由表8可知,建立的HNB-LAMP法特異性好,金黃色葡萄球菌均被檢出,其他非金黃色葡萄球菌均未被檢出。

表8 HNB-LAMP法的特異性分析結(jié)果

2.1.4 HNB-LAMP法檢測(cè)實(shí)際樣品 利用傳統(tǒng)微生物檢法GB 4789.10-2016[7]檢測(cè)30份實(shí)際冷凍畜禽肉樣品時(shí),發(fā)現(xiàn)3個(gè)樣品結(jié)果呈陽(yáng)性;用建立的HNB-LAMP法檢測(cè)實(shí)際樣品時(shí),有12個(gè)樣品結(jié)果呈陽(yáng)性,其中包括傳統(tǒng)微生物法檢測(cè)出的3個(gè)陽(yáng)性樣品。這表明,HNB-LAMP法雖然大大縮短了檢測(cè)時(shí)間,但同時(shí)由于其無(wú)法區(qū)分死菌和活菌而出現(xiàn)了假陽(yáng)性結(jié)果。

2.2.1 不抑制活菌擴(kuò)增的最高PMA濃度 用不同濃度的PMA處理104～107CFU/mL的金黃色葡萄球菌活菌時(shí),發(fā)現(xiàn)各濃度的金黃色葡萄球菌活菌經(jīng)10 μg/mL的PMA處理后Ct值均無(wú)明顯變化,結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知,不抑制活菌擴(kuò)增的最高PMA濃度可以確定為10 μg/mL。

圖2 不同濃度PMA處理對(duì)活菌擴(kuò)增的影響結(jié)果

2.2.2 完全抑制死菌擴(kuò)增的最低PMA濃度 當(dāng)以不同濃度PMA處理濃度為104～107CFU/mL的金黃色葡萄球菌死菌時(shí),PMA濃度為10 μg/mL可以完全抑制104、105CFU/mL的死菌DNA擴(kuò)增,結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖2、圖3最終確定金黃葡萄球菌的PMA處理濃度為10 μg/mL,在該濃度條件下,既可以完全抑制不高于105CFU/mL的死菌DNA擴(kuò)增,又不影響不低于104CFU/mL的活菌DNA擴(kuò)增。

圖3 10 μg/mL PMA處理不同濃度金黃色葡萄球菌死菌的DNA擴(kuò)增結(jié)果

2.3 PMA-HNB-LAMP法檢測(cè)人工污染金黃色葡萄球菌樣品的檢測(cè)結(jié)果

采用PMA-HNB-LAMP法、HNB-LAMP法、傳統(tǒng)微生物法(GB 4789.10-2016)三種方法檢測(cè)人工污染金黃色葡萄球菌的樣品的檢測(cè)結(jié)果如表9所示。由表9可知,本研究建立的PMA-HNB-LAMP法與傳統(tǒng)微生物法的檢測(cè)結(jié)果一致,而HNB-LAMP法在檢測(cè)時(shí)由于無(wú)法區(qū)分死菌和活菌而出現(xiàn)了假陽(yáng)性結(jié)果。

表9 采用三種方法檢測(cè)人工污染金黃色葡萄球菌樣品的檢測(cè)結(jié)果

2.4 PMA-HNB-LAMP法檢測(cè)實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果

10份冷凍畜肉和10份冷凍禽肉同時(shí)經(jīng)國(guó)標(biāo)法GB 4789.10-2016、HNB-LAMP法和PMA-HNB-LAMP法檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果如表10所示。由表10可知,20份樣品經(jīng)三種方法檢測(cè)確認(rèn)為陽(yáng)性的樣品個(gè)數(shù)依次為6個(gè)、5個(gè)、5個(gè);檢出率分別為30%、25%、25%。

表10 采用三種方法對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

為實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)畜禽肉中的金黃色葡萄球菌活菌的污染情況,本研究建立了一套儀器設(shè)備要求簡(jiǎn)單、耗費(fèi)低、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可視化的金黃色葡萄球菌PMA-HNB-LAMP法,該方法既解決了傳統(tǒng)微生物法操作繁瑣、檢驗(yàn)周期長(zhǎng)、生化鑒定復(fù)雜的問(wèn)題,又在檢驗(yàn)過(guò)程中有效的避免了可能由死菌DNA擴(kuò)增造成的假陽(yáng)性結(jié)果。建立的金黃色葡萄球菌PMA-HNB-LAMP檢測(cè)方法特異性強(qiáng),其純菌液靈敏度為104CFU/mL,樣品基質(zhì)靈敏度為105CFU/mL,根據(jù)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration,FDA)和國(guó)外一些學(xué)者的研究[25-27],均將金黃色葡萄球菌的最小產(chǎn)毒濃度定為105CFU/g,即在該濃度下可產(chǎn)生1.0 μg腸毒素而引起食物中毒,本研究建立的金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)方法在現(xiàn)有的檢出限下,可用于快速檢測(cè)出含有高于最小產(chǎn)毒濃度金黃色葡萄球菌活菌的高風(fēng)險(xiǎn)致病樣品。同時(shí),靈敏度不高也是該法面臨的實(shí)際問(wèn)題,需要在今后研究中對(duì)方法進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化改進(jìn)。將建立的金黃色葡萄球菌可視化PMA-HNB-LAMP法應(yīng)用于檢測(cè)實(shí)際樣品時(shí),發(fā)現(xiàn)其陽(yáng)性樣品檢出率略低于傳統(tǒng)微生物法GB 4789.10-2016[7]的檢出率,但是無(wú)假陰性結(jié)果的出現(xiàn),推其原因可能是購(gòu)買的冷凍生畜禽肉中存在某些抑制LAMP擴(kuò)增的因素,具體原因及解決方法有待進(jìn)一步研究。該法除了用于畜禽肉的檢測(cè)外,還可以應(yīng)用到其他種類的食品檢測(cè)中,具有很廣的應(yīng)用前景。