艾 惠,孫軍峰,陳琳娜,李 樂,韓宗璽,劉勝旺
(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150069)
新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(NDV)感染禽類引起的一種急性、高度接觸性傳染病,呈世界性分布,嚴重危害家禽養(yǎng)殖業(yè),能夠造成嚴重的經(jīng)濟損失[1]。NDV遺傳進化的變化是一個逐步積累的過程,點突變是NDV變異的主要方式。病毒的不斷演化和變異是使NDV的毒力等生物學(xué)特性發(fā)生變化的一個重要的原因。血凝素-神經(jīng)氨酸酶(Hemagglutinin-neuraminidase,HN)蛋白是一種II型囊膜蛋白,是NDV的重要免疫原性蛋白和毒力影響因素。研究表明,HN蛋白中和表位(346~353)中的347位氨基酸殘基存在E-K的變異,并且含有這種變異的毒株抗原性與傳統(tǒng)毒株存在抗原性差異[2]。
N-鏈接的糖基化修飾作為一種最常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,病毒囊膜糖蛋白能夠利用細胞的這一功能進行修飾,并最終影響病毒蛋白的穩(wěn)定性、抗原性和生物學(xué)功能[3-4]。NDV的HN蛋白含有6個潛在的N-鏈接的糖基化修飾位點(119、341、433、481、508位和538位殘基),分別命名為G1、G2、G3、G4,G5和G6,其中前4個確實發(fā)生N-鏈接的糖基化修飾。據(jù)報道,HN蛋白跨膜區(qū)突變和N-糖基化缺失影響病毒的吸附、神經(jīng)氨酸酶活性和融合促進活性[5]。通過反向遺傳學(xué)技術(shù)拯救獲得了HN蛋白糖基化位點缺失的突變病毒,進一步研究表明,HN蛋白糖基化缺失能夠致使毒力降低[6]。
本研究分離到了1株NDV ck/CH/LHLJ170302,遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)其屬于class II類中的基因II型,與LaSota疫苗株親緣關(guān)系較近?;蚍肿犹卣鞣治霭l(fā)現(xiàn),ck/CH/LHLJ170302株HN蛋白中缺失了433位(G3)的糖基化修飾位點,為探究糖基化位點缺失對ck/CH/LHLJ170302生物學(xué)特性的影響,本研究比較分析了ck/CH/LHLJ170302株與LaSota株在生長特性、致病性和抗原性方面的差異,為NDV的遺傳變異提供參考數(shù)據(jù)。
1.1 主要試驗材料及實驗動物 LaSota疫苗株;黑龍江某養(yǎng)雞場中采集咽拭子樣品,分離出1株NDV毒株,命名為ck/CH/LHLJ170302。DF-1細胞由本實驗室傳代培養(yǎng);9~11日齡的SPF雞胚、SPF雞及雞紅細胞均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供。
1.2 主要試劑 體液病毒DNA/RNA小量提取試劑盒,購自Axygen公司;PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit、Gel Extraction Kit膠回收純化試劑盒,均購自美國OMEGA公司;pMD18-T載體、ExTaq?DNA Polymerase,均購自寶生物工程(大連)有限公司。
1.3 病毒的純化 根據(jù)文獻[7]中的方法步驟,用雞胚有限稀釋法純化病毒,純化的病毒-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.4 病毒RNA的提取、基因組的擴增及測序 利用體液病毒DNA/RNA小量提取試劑盒提取純化的ck/CH/LHLJ170302株病毒基因組RNA。利用文獻[7]中報道的NDV class II全基因組測序引物序列,用一步法RT-PCR試劑盒擴增ck/CH/LHLJ170302株基因組各片段?;厥諗U增后的片段并克隆至pMD18-T載體中,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞后挑取單個克隆進行菌液PCR鑒定。同一片段挑取多個陽性克隆,由哈爾濱睿博生物技術(shù)有限公司進行測序,取3個以上的相同測序結(jié)果作為每個目的片段的序列結(jié)果。
1.5 病毒基因分子特征分析 以LaSota疫苗株為參考,根據(jù)測序結(jié)果拼接獲得ck/CH/LHLJ170302株的全基因組序列,比較ck/CH/LHLJ170302株和LaSota株之間各基因的核苷酸、編碼的氨基酸的相似性以及F蛋白和HN蛋白的N-鏈接糖基化位點、半胱氨酸殘基及中和表位氨基酸的差異。
1.6 病毒的遺傳進化分析 從GenBank中下載19株NDV代表性毒株的F基因編碼序列作為參考序列,構(gòu)建F基因系統(tǒng)進化樹。
1.7 病毒的生長動力學(xué)特性及致病指數(shù)測定 根據(jù)文獻[7]中的方法,測定ck/CH/LHLJ170302株和LaSota株的雞胚半數(shù)感染量(EID50),以100 EID50的劑量接種9日齡SPF雞胚,不同時間點收取尿囊液測定病毒滴度,用GraphPad Prism 5軟件繪制生長動力學(xué)曲線。根據(jù)世界動物衛(wèi)生組織(OIE)致病指數(shù)測定標準,測定LaSota株與ck/CH/LHLJ170302 株的雞胚死亡平均時間(Mean death time,MDT)和1日齡SPF雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)(Intracerebral pathogenicity index,ICPI)。
1.8 病毒抗血清的制備 將4周齡的SPF雞隨機分為2組并飼養(yǎng)于負壓隔離器中,每組5只;將LaSota株和ck/CH/LHLJ170302株按106EID50的量通過點眼和滴鼻的方式分別進行免疫接種,0.2 mL/只。首次免疫2周后,以同樣劑量通過靜脈注射途徑加強免疫。加強免疫14 d后,撲殺采血,分離血清,將血清置于56 ℃滅活30 min,分裝后,于-70 ℃ 保存待用。
1.9 病毒抗原相關(guān)性分析 用純化的病毒和制備的血清在DF-1細胞中進行交叉中和試驗以研究ck/CH/LHLJ170302株與LaSota株的抗原性差異,按Archetti方法計算抗原差異系數(shù)R[8]。判斷標準:R<0.5,表明病毒之間的抗原有較大差異;0.5≤R≤0.67,表明病毒之間的抗原差異較小;0.67≤R≤1.5,表明病毒之間抗原沒有差異。
2.1 遺傳進化及病毒基因序列分析 測序拼接結(jié)果顯示,ck/CH/LHLJ170302株基因組全長為15 186nt?;蚪M結(jié)構(gòu)特征與class II類NDV毒株一致。F基因遺傳進化分析結(jié)果表明,ck/CH/LHLJ170302株屬于class II類基因II型病毒,且ck/CH/LHLJ170302 與class II中基因II型LaSota疫苗株親緣關(guān)系最近(圖1),進一步比較分析了ck/CH/LHLJ170302株與基因II型LaSota疫苗株各基因編碼區(qū)的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列,結(jié)果顯示,ck/CH/LHLJ170302株與LaSota株的各基因之間均具有較高的核苷酸和氨基酸一致性(表1)。
圖1 Class II 類 NDV 的 F 基因遺傳進化分析Fig.1 The phylogenetic tree of class II NDV strains based on the F gene
2.2F基因序列分析 ck/CH/LHLJ170302株F基因開放閱讀框(ORF)長度為1 662 bp,編碼553個氨基酸,包含13個半胱氨酸和6個潛在的糖基化位點,均與LaSota株一致。ck/CH/LHLJ170302株F蛋白裂解位點處氨基酸為112G-R-Q-G-R-L117,具有NDV弱毒株的典型特征(表2)。F蛋白中和抗原表位分析發(fā)現(xiàn),ck/CH/LHLJ170302株中和抗原表位的氨基酸與LaSota株中和抗原表位的氨基酸一致。另外,與LaSota株相比,二者F蛋白氨基酸的同源性為99.6%(表1)。上述結(jié)果表明,ck/CH/LHLJ170302株與LaSota株的F基因分子特征無明顯差異。
表1 ck/CH/LHLJ170302與LaSota各基因編碼區(qū)相似性比較Table 1 Comparison of similarity between coding regions of each gene of ck/CH/LHLJ170302 and LaSota (%)
表2 ck/CH/LHLJ170302病毒株與LaSota疫苗株的生物學(xué)特性比較Table 2 Comparison of biological characteristics of ck/CH/LHLJ170302 virus strain and LaSota vaccine strain
2.3HN基因序列分析 ck/CH/LHLJ170302株HN基因ORF全長為1 734 bp,編碼577個氨基酸,含有12個半胱氨酸殘基,與LaSota株一致。但ck/CH/LHLJ170302株的HN基因僅含有5個潛在的糖基化修飾位點,與LaSota株相比,缺失了433位(G3)的糖基化修飾位點。另外,ck/CH/LHLJ170302株HN蛋白中抗原位點的氨基酸序列與LaSota的氨基酸序列沒有差異。
2.4 病毒的滴度及致病指數(shù)測定 ck/CH/LHLJ170302株和LaSota株的病毒滴度測定結(jié)果表明,二者的血凝(HA)滴度和EID50之間沒有顯著差異。毒力指標測定結(jié)果(MDT和ICPI)表明,ck/CH/LHLJ170302株符合NDV弱毒株的標準,與LaSota相比,ck/CH/LHLJ170302和ICPI值有所降低,但ck/CH/LHLJ170302的MDT則提前了近20 h(表2)。
2.5 病毒的生長動力學(xué) 將ck/CH/LHLJ170302株和LaSota株接種SPF雞胚,測定病毒的生長動力學(xué)曲線。結(jié)果表明,2株病毒均在接種雞胚96 h后達到最高生長滴度,但ck/CH/LHLJ170302株在24 h、48 h和72 h病毒滴度均顯著高于LaSota株(P<0.05)(圖2)。
圖2 ck/CH/LHLJ170302病毒株與LaSota疫苗株在SPF雞胚中的生長動力學(xué)曲線Fig.2 Growth kinetics curve of ck/CH/LHLJ170302 strain and LaSota vaccine strain in SPF chicken embryo注: 與LaSota組比較,*:P<0.05Note: Compare with LaSota,*:P<0.05
2.6 抗原相關(guān)性分析 制備ck/CH/LHLJ170302株和LaSota株的血清后,在DF-1細胞中進行交叉中和試驗以評價二者的抗原相關(guān)性。結(jié)果顯示,ck/CH/LHLJ170302與LaSota的抗原差異系數(shù)值R為1,表明ck/CH/LHLJ170302與LaSota沒有明顯的抗原差異。
NDV在家禽中持續(xù)存在和流行以及由于點突變的積累而產(chǎn)生的變異病毒持續(xù)威脅著家禽養(yǎng)殖業(yè),近年來,由于HN抗原位點變異而產(chǎn)生的NDV抗原變異毒株逐漸增多。此外,NDV HN蛋白中N-鏈接的糖基化位點對于維持HN蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和抗原性具有重要作用[9]。
在先前的研究中,相關(guān)研究者利用反向遺傳系統(tǒng)獲得了缺失HN蛋白4個糖基化位點(G1、G2、G3和G4)以及同時缺失G1和G2兩個糖基化位點的突變病毒,進一步研究發(fā)現(xiàn),所有糖基化位點缺失的突變病毒的IVPI值與ICPI值均低于親本病毒,說明糖基化位點缺失致使毒力降低,尤其G4的缺失和G1、G2的聯(lián)合缺失能夠顯著降低NDV的致病性。并且,上述突變病毒與親本病毒的生長曲線結(jié)果表明,突變病毒(rG1、rG2和rG3)在感染后32 h和40 h的滴度明顯高于親本病毒[6]。本研究對ck/CH/LHLJ170302株進行了F基因遺傳進化分析與各基因分子特征分析,結(jié)果表明,ck/CH/LHLJ170302株屬于class Ⅱ類基因Ⅱ型,與LaSota疫苗株的親緣關(guān)系較近,并且發(fā)現(xiàn)ck/CH/LHLJ170302株的HN蛋白中天然缺失了433位的糖基化修飾位點(G3)。通過病毒的MDT和ICPI這兩項致病指數(shù)衡量了ck/CH/LHLJ170302株的毒力,結(jié)果表明,ck/CH/LHLJ170302株的MDT為79.2 h,相較于LaSota株的MDT,提前了大約20 h。ck/CH/LHLJ170302株的ICPI為0.175,較LaSota株的ICPI值略微有所降低,上述結(jié)果可以表明,ck/CH/LHLJ170302為緩發(fā)型弱毒株。另外,生長動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn),ck/CH/LHLJ170302株的生長速度要高于LaSota株。ck/CH/LHLJ170302株與LaSota株在毒力和生長特性上的差異是否是由于ck/CH/LHLJ170302株HN蛋白中糖基化修飾位點的缺失造成的需要進一步探究。此外,鑒于ck/CH/LHLJ170302株的生長速度高于LaSota株,推測ck/CH/LHLJ170302株可能是LaSota株在雞群中長期存在并適應(yīng)形成的突變毒株,這需要進一步的證實。
本研究發(fā)現(xiàn)了HN蛋白糖基化位點天然缺失的NDV,并且其生物學(xué)特性發(fā)生了一定程度的變化,表明需要加強對NDV的流行病學(xué)監(jiān)測和研究,為我國NDV的遺傳變異防控提供參考數(shù)據(jù)。