趙昊，全莉，于佳俊，張曉蒙，馬文瑞，武運(yùn)*，薛潔*

1(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830052)2(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015) 3(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)

新疆地區(qū)自古以來(lái)就是我國(guó)主要葡萄及葡萄酒產(chǎn)地，具備得天獨(dú)厚的資源優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，隨著新疆葡萄種植面積和葡萄酒企業(yè)數(shù)量的不斷增多，新疆葡萄酒產(chǎn)業(yè)得到了極大的發(fā)展，并逐漸成為新疆地區(qū)的經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)[1-2]。隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)水平的提升，食品質(zhì)量安全問(wèn)題愈發(fā)嚴(yán)峻，這也制約著葡萄酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3-4]。

眾多真菌毒素中，赭曲霉毒素因其強(qiáng)烈的生物毒性和潛在的致病性而備受關(guān)注，其毒性?xún)H次于黃曲霉毒素[5-6]。赭曲霉毒素是霉菌中某些曲霉屬和青霉屬菌種產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，包括具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的A，B，C，D(α)4種化合物。同時(shí)具有基因毒性、神經(jīng)毒性、致畸性、免疫毒性和胚胎毒性等[7-9]。赭曲霉毒素A具有熱穩(wěn)定性，即使在250 ℃高溫加工下，也只能去除一小部分赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)，無(wú)法完全降解[10]。OTA對(duì)葡萄酒的污染會(huì)影響整個(gè)葡萄酒市場(chǎng)，對(duì)OTA的控制是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。

經(jīng)過(guò)大量研究證實(shí)，OTA廣泛存在于谷物、水果、咖啡和葡萄酒中[11-14]。葡萄是易受OTA來(lái)源菌污染的農(nóng)產(chǎn)品之一[15]，OTA來(lái)源菌的污染、生長(zhǎng)、產(chǎn)毒是葡萄酒中存在OTA殘留的根本原因。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于新疆釀酒葡萄OTA來(lái)源菌分離篩選的相關(guān)文獻(xiàn)不多。本研究以新疆四大產(chǎn)區(qū)(焉耆盆地、吐哈盆地、天山北麓、伊犁河谷)釀酒葡萄和根系土壤為樣品，進(jìn)行OTA來(lái)源菌的篩選及分離，并對(duì)其產(chǎn)毒條件進(jìn)行探究，為構(gòu)建葡萄酒OTA污染的預(yù)警機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

葡萄樣品：赤霞珠和霞多麗，采自新疆四大產(chǎn)區(qū)(焉耆盆地、吐哈盆地、伊犁河谷、天山北麓)的健康和損傷葡萄。

土壤樣品：葡萄園區(qū)根系土壤，采集新疆四大產(chǎn)區(qū)酒莊葡萄種植園區(qū)的葡萄根系土壤。

酵母膏胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YPD)液體培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrase agar,PDA)培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基。

霉菌DNA提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；霉菌通用引物(ITS 1和ITS 4),上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；瓊脂糖，Biowest Agarose；Gold View，Sigma；改良式血球計(jì)數(shù)板，上?；茖?shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BX51熒光顯微鏡，OLYMPUS中國(guó)有限公司；電泳儀，北京六一儀器廠；LRH-250生化培養(yǎng)箱，上海恒科儀器有限公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀，上海天能科技有限公司；PHS-3CpH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHZ-B全溫振蕩器，太倉(cāng)市豪威實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；BioSpec-nano核酸蛋白檢測(cè)儀，德國(guó)Eppendorf公司；紫外成像系統(tǒng)、PCR儀，Bio-Rad。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集

葡萄樣品：用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精擦拭手套后，均勻、隨機(jī)地于該品種種植區(qū)東、南、西、北、中5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)取正常釀酒葡萄和落敗釀酒葡萄各1.0 kg，放置于無(wú)菌的密封袋中，制作標(biāo)簽記錄樣品采集時(shí)間、地點(diǎn)、葡萄品種。

土壤樣品：用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精擦拭鐵釬，均勻、隨機(jī)地挖取葡萄園區(qū)葡萄藤根部20 cm土壤，放置于無(wú)菌密封袋，制作采樣標(biāo)簽記錄樣品采集時(shí)間、地點(diǎn)。

1.3.2 霉菌的分離純化

土壤樣品：稱(chēng)取1 g土壤加入99 mL無(wú)菌生理鹽水中，以180 r/min在28 ℃下振蕩24 h，后續(xù)步驟參考雷紀(jì)峰[16]的方法。

1.3.3 熒光紫外法初步篩選疑似產(chǎn)OTA霉菌

將分離純化好的霉菌轉(zhuǎn)接到察氏培養(yǎng)基上，倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，在460 nm紫外燈照射下，以不接種的相應(yīng)平板作對(duì)照，觀察平板上是否能夠產(chǎn)熒光。

1.3.4 ELISA法確定OTA來(lái)源菌

挑選出能產(chǎn)綠色或者黃綠色熒光的霉菌接種到察氏培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d，加15 mL甲醇并用封口膜封住平皿，來(lái)回晃動(dòng)平皿5 min，放置于遮光環(huán)境下浸提3 h。用0.22 μm濾膜過(guò)濾提取液，提取整個(gè)平板的毒素，用酶聯(lián)免疫(enzyme-linked immunoassay,ELISA)試劑盒法測(cè)霉菌浸提液OTA含量，確定OTA來(lái)源菌株，具體步驟參照全莉等[17]的方法。

1.3.5 OTA來(lái)源菌的形態(tài)觀察

將分離純化的菌株滴落于載玻片上，在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，進(jìn)行初步鑒定。

1.3.6 OTA來(lái)源菌ITS rDNA序列鑒定

1.3.6.1 DNA提取

用霉菌DNA提取試劑盒對(duì)分離純化的霉菌DNA進(jìn)行提取，提取步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.6.2 ITS rDNA PCR擴(kuò)增

具體步驟參照耿曉杰等[18]的方法，并通過(guò)DNA濃度檢測(cè)和瓊脂糖凝膠電泳確定DNA濃度及ITS區(qū)域(400～800 bp)是否獲得了目的片段。

1.3.6.3 序列分析

將PCR引物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)中進(jìn)行BLAST對(duì)比分析，通過(guò)與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行同源性比對(duì)確定待測(cè)菌株種屬。

1.3.7 OTA來(lái)源菌接種至釀酒葡萄方法

1.3.7.1 OTA來(lái)源菌懸液的制備

具體步驟參照彭婭萍[19]的方法，最終稀釋菌懸液孢子至106、107、108個(gè)/mL備用，每個(gè)試驗(yàn)處理做3個(gè)重復(fù)。

1.3.7.2 OTA來(lái)源菌的接種

取200 g無(wú)損傷、大小均勻的整串釀酒葡萄置于體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇中1 min，浸泡后用無(wú)菌水清洗2～3次，待葡萄表面干燥后接種。

將干燥后的釀酒葡萄，用一次性注射器在每個(gè)洗凈、干燥的釀酒葡萄表面穿刺2～3個(gè)針孔，刺入深度2 mm，針孔直徑約0.5 mm，為損傷釀酒葡萄。

分別將200 g洗凈、干燥釀酒葡萄和損傷釀酒葡萄浸泡濃度為106、107、108個(gè)/mL的炭黑曲霉菌懸浮液中，浸泡5 min后移出至250 mL的燒杯中，用封口膜密封，每天取樣觀察葡萄感染情況，檢測(cè)炭黑曲霉產(chǎn)OTA情況。

1.3.8 OTA來(lái)源菌產(chǎn)OTA條件的研究

選取產(chǎn)OTA量較高的菌株進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.8.1 溫度對(duì)OTA來(lái)源菌產(chǎn)OTA的影響

將接種量為107個(gè)/mL的無(wú)損釀酒葡萄放置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，控制相對(duì)濕度為75%，光照條件為光暗交替，溫度設(shè)為18、28、38 ℃。每隔24 h，連續(xù)7 d 測(cè)OTA含量。

1.3.8.2 相對(duì)濕度對(duì)OTA來(lái)源菌產(chǎn)OTA的影響

將接種量為107個(gè)/mL的無(wú)損釀酒葡萄放置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，控制溫度為28 ℃，光照條件為光暗交替，相對(duì)濕度設(shè)為65%、75%、85%。在培養(yǎng)后每隔24 h，連續(xù)7 d測(cè)OTA含量。

1.3.8.3 接種量對(duì)OTA來(lái)源菌產(chǎn)OTA的影響

分別將接種量為106、107、108個(gè)/mL的無(wú)損釀酒葡萄置放于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，控制溫度為28 ℃，光照條件為光暗交替，相對(duì)濕度設(shè)為75%。在培養(yǎng)后每隔24 h，連續(xù)7 d 測(cè)OTA含量。

1.3.8.4 光照條件對(duì)OTA來(lái)源菌產(chǎn)OTA的影響

將接種量為107個(gè)/mL的無(wú)損釀酒葡萄放置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，控制溫度28 ℃，相對(duì)濕度設(shè)為75%，光照條件設(shè)為光照、光暗交替、避光。在培養(yǎng)后每隔24 h，連續(xù)7 d 測(cè)OTA含量。

1.3.8.5 葡萄有無(wú)損傷對(duì)OTA來(lái)源菌產(chǎn)OTA的影響

分別將接種量為107個(gè)/mL的無(wú)損釀酒葡萄和損傷釀酒葡萄放置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，控制溫度為28 ℃，光照條件為光暗交替，相對(duì)濕度設(shè)為75%。在培養(yǎng)后每隔24 h，連續(xù)7 d 測(cè)OTA含量。

1.3.8.6 樣品OTA測(cè)量方法

每次取釀酒葡萄10 g于10 mL離心管中，用滅菌過(guò)的玻璃棒進(jìn)行破碎處理，離心后采用ELISA試劑盒法參照1.3.4小節(jié)的方法測(cè)OTA含量。

1.4數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理運(yùn)用Excel 2018、Origin 8.5及SPSS 19.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉菌分離情況

采用PDA 培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基對(duì)葡萄及根系土壤中的真菌進(jìn)行分離。在葡萄果實(shí)中分離到25個(gè)單個(gè)菌落真菌，在葡萄根系土壤中分離到5個(gè)單個(gè)菌落，說(shuō)明葡萄果實(shí)更易被有害菌污染。將分離出霉菌接種至PDA培養(yǎng)基進(jìn)行二次分離純化，通過(guò)鏡檢排除酵母菌，最終收集12株不同形態(tài)的霉菌，圖1為部分霉菌分離純化后的形態(tài)。

圖1 部分霉菌的菌落形態(tài)圖Fig.1 Colony morphology of partial molds

2.2 OTA來(lái)源菌的篩選及形態(tài)觀察

通過(guò)熒光紫外法初篩，12株霉菌中有3株產(chǎn)熒光，占25.0%。將3株產(chǎn)熒光的霉菌單點(diǎn)接種至胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d，提取整個(gè)培養(yǎng)基毒素，用ELISA試劑盒檢測(cè)提取液OTA含量，1株確定為假陽(yáng)性，其余2株產(chǎn)OTA，標(biāo)號(hào)為M2和M7，OTA產(chǎn)量如表1所示。

圖2為M2和M7在顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)，2株霉菌的細(xì)胞形態(tài)有典型的帚狀分支，分生孢子梗做二三次分支，分生孢子鏈呈分散柱狀，具有典型的曲霉細(xì)胞形態(tài)，呈黃褐色、黑色，中心呈青黃色或紅褐色，邊緣白色，質(zhì)地絲狀、絮狀較緊實(shí)，菌株邊緣有較多氣生菌絲，反面土黃色，菌落大小約40 mm。這與OTA來(lái)源菌主要以青霉和曲霉屬為主的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致，雷紀(jì)鋒等[6]從寧波地區(qū)的農(nóng)莊葡萄中篩選出了8株OTA來(lái)源菌，包括5株青霉和3株曲霉；彭婭萍等[9]從江蘇鎮(zhèn)江市句容葡萄園的葡萄、土壤及枝葉中篩選出3株OTA來(lái)源菌，為青霉和曲霉。

表1 產(chǎn)熒光菌株生成OTA的含量Table 1 OTA concent produced by fluoresce strains

a-菌株M2;b-菌株M7圖2 兩株OTA來(lái)源菌細(xì)胞形態(tài)圖Fig.2 Cell morphology of two OTA-derived strains

2.3 霉菌ITS rDNA序列鑒定

2.3.1 霉菌ITS rDNA區(qū)域擴(kuò)增結(jié)果

以O(shè)TA來(lái)源菌DNA為模板，對(duì)ITS區(qū)域特異性擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳后在凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖3所示。2株OTA來(lái)源菌特異性片段擴(kuò)增結(jié)果良好，條帶清晰且唯一，分子量約為600 bp，符合DNA測(cè)序要求，可以送至生物公司測(cè)序。

1-對(duì)照;2-Marker圖3 兩株OTA來(lái)源菌ITS rDNA擴(kuò)增瓊脂糖 凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of two strains of OTA ITS rDNA amplified by agarose gel electrophoresis

2.3.2 BLAST比對(duì)結(jié)果

OTA來(lái)源菌測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)，結(jié)果如表2所示。霉菌M2和M7分別為黑曲霉Aspergillusniger和炭黑曲霉Aspergilluscarbonarius，與菌株形態(tài)觀察結(jié)果基本一致。

表2 OTA來(lái)源菌測(cè)序結(jié)果比對(duì)Table 2 Comparison of sequencing results of OTA- derived bacteria

2.4 不同溫度條件下炭黑曲霉感染釀酒葡萄產(chǎn)OTA情況

不同溫度條件下，炭黑曲霉感染赤霞珠、霞多麗葡萄產(chǎn)OTA情況如圖4所示。

a-赤霞珠葡萄；b-霞多麗葡萄圖4 不同溫度炭黑曲霉感染赤霞珠葡萄和 霞多麗葡萄OTA含量的變化Fig.4 Changes of OTA content in Cabernet Sauvignon and Chardonnay grape infected by A.carbonarius at different temperatures

由圖4-a可知，不同溫度條件下，感染炭黑曲霉的赤霞珠葡萄OTA含量明顯高于未感染的對(duì)照組；28、38 ℃條件下，感染炭黑曲霉的赤霞珠葡萄在第3～6天產(chǎn)OTA能力較強(qiáng)，在第4天產(chǎn)OTA量達(dá)到峰值，分別為1.82和1.64 μg/L，產(chǎn)OTA能力呈先上升后快速降低的趨勢(shì)；18 ℃條件下，感染炭黑曲霉的赤霞珠葡萄產(chǎn)OTA能力較為均衡，平均含量為0.78 μg/L，說(shuō)明18 ℃時(shí)炭黑曲霉菌株的產(chǎn)OTA能力低于28和38 ℃；18 ℃時(shí)，被感染的赤霞珠OTA產(chǎn)量明顯較低，這可能與低溫條件不適宜霉菌生長(zhǎng)代謝有關(guān)；由圖4-b可知，不同溫度條件下，感染炭黑曲霉的霞多麗葡萄OTA含量明顯高于未感染的對(duì)照組；18、28、38 ℃條件下，感染炭黑曲霉的霞多麗葡萄在第2～5天產(chǎn)OTA能力較強(qiáng)，第3天達(dá)到峰值，產(chǎn)OTA能力均呈逐漸上升后降低的趨勢(shì)；溫度為18 ℃時(shí)，被感染的霞多麗OTA產(chǎn)量略低于溫度28、38 ℃，但差異不大。

以上結(jié)果表明，不同溫度條件下，炭黑曲霉感染釀酒葡萄產(chǎn)OTA能力存在明顯差異且顯著高于對(duì)照組。炭黑曲霉在赤霞珠葡萄上的產(chǎn)OTA量略低于在霞多麗葡萄上的產(chǎn)OTA量；接種第3天，霞多麗葡萄OTA含量出現(xiàn)峰值且平均含量為1.75 μg/L，接種第4天，赤霞珠葡萄OTA含量出現(xiàn)峰值且平均含量為1.46 μg/L，說(shuō)明成熟的霞多麗葡萄比赤霞珠葡萄更易感染炭黑曲霉，并且霞多麗葡萄產(chǎn)OTA量高于赤霞珠葡萄的產(chǎn)OTA量；溫度為18 ℃時(shí)，炭黑曲霉在赤霞珠、霞多麗葡萄上的產(chǎn)OTA量均較低，說(shuō)明低溫一定程度抑制了炭黑曲霉的產(chǎn)OTA能力；觀察葡萄表面感染情況時(shí)，發(fā)現(xiàn)溫度為38 ℃時(shí)，釀酒葡萄易明顯發(fā)生感染雜菌的情況，可能與細(xì)菌在38 ℃時(shí)存活能力較強(qiáng)有關(guān)。

2.5 不同濕度條件下炭黑曲霉感染釀酒葡萄產(chǎn)OTA情況

不同濕度條件下，炭黑曲霉感染赤霞珠、霞多麗葡萄產(chǎn)OTA情況如圖5所示。由圖5-a可知，不同濕度條件下，感染炭黑曲霉的赤霞珠葡萄OTA含量明顯高于未感染對(duì)照組；感染炭黑曲霉的赤霞珠葡萄OTA含量由高到低為相對(duì)濕度85%>相對(duì)濕度75%>相對(duì)濕度65%，但總體差異不大；赤霞珠葡萄被感染的第4天產(chǎn)OTA量達(dá)到峰值，產(chǎn)OTA量呈先迅速上升后快速降低的趨勢(shì)；由圖5-b可知，不同濕度條件下，感染炭黑曲霉的霞多麗葡萄明顯高于未感染的對(duì)照組；感染炭黑曲霉的霞多麗葡萄OTA含量由高至低為相對(duì)濕度85%>相對(duì)濕度75%>相對(duì)濕度65%，但差異不明顯；霞多麗葡萄被感染的第3天產(chǎn)OTA量達(dá)到峰值，產(chǎn)OTA量同樣呈先迅速上升后快速降低的趨勢(shì)。

總的來(lái)說(shuō)，不同濕度條件下，炭黑曲霉感染釀酒葡萄產(chǎn)OTA能力存在的差異不明顯，但顯著高于；炭黑曲霉在赤霞珠葡萄上的產(chǎn)OTA量略低于在霞多麗葡萄上的產(chǎn)OTA量；感染第3天，霞多麗葡萄產(chǎn)OTA量出現(xiàn)峰值，感染第4天，赤霞珠葡萄產(chǎn)OTA量出現(xiàn)峰值，說(shuō)明成熟的霞多麗比赤霞珠葡萄更易感染炭黑曲霉并產(chǎn)OTA；隨著相對(duì)濕度逐漸增加，炭黑曲霉在赤霞珠、霞多麗葡萄上的產(chǎn)OTA量也逐漸增加，但增加差異不明顯，說(shuō)明較高的濕度環(huán)境中，炭黑曲霉更易感染釀酒葡萄并產(chǎn)OTA；觀察葡萄表面感染情況時(shí)，發(fā)現(xiàn)各濕度條件下，釀酒葡萄陸續(xù)出現(xiàn)感染雜菌的情況，說(shuō)明高濕度時(shí)成熟葡萄容易被微生物感染，但組間差異不明顯，可能與相對(duì)濕度設(shè)置均較高有關(guān)。

a-赤霞珠葡萄;b-霞多麗葡萄圖5 不同濕度炭黑曲霉感染赤霞珠葡萄和 霞多麗葡萄OTA含量的變化Fig.5 Changes of OTA content in Cabernet Sauvignon and Chardonnay grape infected by A.carbonarius with different humidity

2.6 不同接種量條件下炭黑曲霉感染釀酒葡萄產(chǎn)OTA情況

不同接種量條件下，炭黑曲霉感染赤霞珠、霞多麗葡萄產(chǎn)OTA情況如圖6所示。由圖6-a可知，不同接種量條件下，被感染的赤霞珠葡萄OTA含量明顯高于對(duì)照組；炭黑曲霉菌懸液孢子數(shù)越高，被感染的赤霞珠葡萄OTA含量就越高；赤霞珠葡萄被感染的第4～5天產(chǎn)OTA量最高；被感染的赤霞珠葡萄產(chǎn)OTA量總體呈先上升后降低的趨勢(shì)，炭黑曲霉菌懸液孢子數(shù)為108個(gè)/mL時(shí)，被感染赤霞珠葡萄OTA含量降低不明顯；由圖6-b可知，不同接種量條件下，被感染的霞多麗葡萄OTA含量明顯高于對(duì)照組；炭黑曲霉菌懸液孢子數(shù)越高，被感染的霞多麗葡萄OTA含量就越高；赤霞珠葡萄被感染的第2～4天產(chǎn)OTA量較高，炭黑曲霉菌懸液孢子數(shù)為108個(gè)/mL時(shí)，被感染的霞多麗葡萄OTA含量顯著高于菌懸液孢子數(shù)為106個(gè)/mL；被感染的霞多麗葡萄產(chǎn)OTA量總體呈先上升后降低的趨勢(shì)，但炭黑曲霉菌懸液孢子數(shù)為108個(gè)/mL時(shí)，被感染霞多麗葡萄OTA含量降低不明顯。

a-赤霞珠葡萄;b-霞多麗葡萄圖6 不同接種量下炭黑曲霉感染赤霞珠葡萄和 霞多麗葡萄OTA含量的變化情況Fig.6 Changes of OTA content in Cabernet Sauvignon and Chardonnay grape infected by A.carbonarius at different inoculation amounts

總的來(lái)說(shuō)，不同接種量條件下，炭黑曲霉感染釀酒葡萄產(chǎn)OTA能力存在明顯差異，且被感染的釀酒葡萄OTA含量顯著高于對(duì)照組；炭黑曲霉菌懸液孢子數(shù)與被感染的釀酒葡萄OTA含量呈正相關(guān)；被感染的釀酒葡萄OTA含量隨感染時(shí)間增加呈先上升后下降趨勢(shì)，但炭黑曲霉菌懸液孢子數(shù)為108個(gè)/mL時(shí)，被感染霞多麗葡萄OTA含量降低不明顯；觀察葡萄表面感染情況時(shí)，發(fā)現(xiàn)黑曲霉菌懸液孢子數(shù)為108個(gè)/mL時(shí)，釀酒葡萄幾乎沒(méi)有感染雜菌。

2.7 不同光照條件下炭黑曲霉感染釀酒葡萄產(chǎn)OTA情況

不同光照條件下，炭黑曲霉感染赤霞珠、霞多麗葡萄產(chǎn)OTA情況如圖7所示，由圖7-a可知，不同光照條件下，感染炭黑曲霉的赤霞珠葡萄OTA含量明顯高于未感染的對(duì)照組；黑暗條件下的赤霞珠葡萄感染炭黑曲霉后OTA含量明顯高于光照條件下的赤霞珠葡萄，而光暗交替條件下赤霞珠葡萄感染炭黑曲霉后OTA含量居中；赤霞珠葡萄被感染的第3～5天產(chǎn)OTA量較高，最高為黑暗條件下第4天，OTA含量為1.72 μg/L；另外，赤霞珠葡萄被感染后OTA含量均呈先上升后降低的趨勢(shì)，感染組和對(duì)照組感染雜菌情況較少；由圖7-b可知，不同光照條件下，感染炭黑曲霉的霞多麗葡萄OTA含量明顯高于未感染的對(duì)照組；被感染的霞多麗葡萄OTA含量由高到低為黑暗環(huán)境>黑暗交替環(huán)境>光照環(huán)境；霞多麗葡萄被感染的第2～4天產(chǎn)OTA量較高，最高為黑暗條件下第3天，OTA含量為2.35 μg/L；另外，被感染的霞多麗葡萄OTA含量也呈先上升后降低的趨勢(shì)。

a-赤霞珠葡萄;b-霞多麗葡萄圖7 不同光照下炭黑曲霉感染赤霞珠葡萄和 霞多麗葡萄OTA含量的變化情況Fig.7 Changes of OTA content in Cabernet Sauvignon and Chardonnay grape infected by A.carbonarius under different illumination

以上結(jié)果表明，不同光照條件下的釀酒葡萄感染炭黑曲霉產(chǎn)OTA能力存在明顯差異，且顯著高于對(duì)照組；炭黑曲霉感染赤霞珠葡萄的OTA含量略低于霞多麗；黑暗條件下，炭黑曲霉感染釀酒葡萄的OTA含量明顯高于光照條件下被感染的釀酒葡萄OTA含量，說(shuō)明炭黑曲霉在光照條件下產(chǎn)OTA能力較弱；觀察葡萄表面感染情況時(shí)，發(fā)現(xiàn)部分霞多麗葡萄感染雜菌。

2.8 炭黑曲霉接種至有無(wú)損傷釀酒葡萄上產(chǎn)OTA情況

炭黑曲霉感染有無(wú)損傷的赤霞珠、霞多麗葡萄產(chǎn)OTA情況如圖8所示，由圖8-a可知，感染了炭黑曲霉的赤霞珠葡萄OTA含量明顯高于未感染的對(duì)照組；有損傷的赤霞珠葡萄感染炭黑曲霉后OTA含量明顯高于無(wú)損傷的赤霞珠葡萄；有損傷赤霞珠葡萄被感染的第3天產(chǎn)OTA量達(dá)到峰值，無(wú)損傷赤霞珠葡萄被感染的第4天產(chǎn)OTA量達(dá)到峰值，產(chǎn)OTA量均呈先上升后降低的趨勢(shì)；另外，對(duì)照組有損傷的赤霞珠葡萄OTA含量逐漸上升，可能與葡萄損傷后在接種過(guò)程中感染產(chǎn)OTA霉菌有關(guān)；由圖8-b可知，感染了炭黑曲霉的霞多麗葡萄OTA含量明顯高于未感染的對(duì)照組；有損傷的霞多麗葡萄感染炭黑曲霉后OTA含量明顯高于無(wú)損傷的赤霞珠葡萄，說(shuō)明成熟釀酒葡萄損傷后更易感染炭黑曲霉菌；有損傷霞多麗葡萄被感染的第2天產(chǎn)OTA量達(dá)到峰值，無(wú)損傷赤霞珠葡萄被感染的第3天產(chǎn)OTA量達(dá)到峰值，產(chǎn)OTA量呈先上升后降低的趨勢(shì)；同樣，對(duì)照組有損傷的霞多麗葡萄OTA含量逐漸上升，可能與取樣過(guò)程感染OTA來(lái)源霉菌有關(guān)。

a-赤霞珠葡萄;b-霞多麗葡萄圖8 炭黑曲霉感染有無(wú)損傷赤霞珠葡萄和 霞多麗葡萄OTA含量的變化情況Fig.8 Changes of OTA content in Cabernet Sauvignon and Chardonnay grape infected by A.carbonarius without damage

以上結(jié)果表明，有無(wú)損傷的釀酒葡萄感染炭黑曲霉產(chǎn)OTA能力存在的差異十分明顯，且顯著高于對(duì)照組；炭黑曲霉在赤霞珠葡萄上的產(chǎn)OTA量略低于在霞多麗葡萄上的產(chǎn)OTA量；有損傷赤霞珠、霞多麗葡萄產(chǎn)OTA量比無(wú)損傷赤霞珠、霞多麗葡萄產(chǎn)OTA量出現(xiàn)峰值的日期提前了一天，且有損傷的釀酒葡萄OTA含量呈逐漸上升趨勢(shì)，說(shuō)明有損傷的釀酒葡萄比無(wú)損傷的釀酒葡萄更易感染炭黑曲霉并產(chǎn)OTA；觀察葡萄表面感染情況時(shí)，發(fā)現(xiàn)有損傷的釀酒葡萄明顯感染雜菌。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)新疆地區(qū)不同產(chǎn)區(qū)葡萄品種和根系土壤中霉菌的分離，共分離出霉菌12株，這其中有3株產(chǎn)黃綠色熒光，經(jīng)檢測(cè)有2株為OTA來(lái)源菌，分別A.niger和A.carbonarius，且炭黑曲霉產(chǎn)OTA含量較高；單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，接種量、溫度、釀酒葡萄有無(wú)損傷這幾個(gè)條件對(duì)炭黑曲霉產(chǎn)OTA能力的影響較為明顯，各條件下，炭黑曲霉感染成熟霞多麗葡萄的OTA含量高于炭黑曲霉感染赤霞珠葡萄的OTA含量且OTA含量基本呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，這與霉菌更易感染果皮較薄且酸度較低、含糖量較高的釀酒葡萄有關(guān)[20]。因此，對(duì)于酒莊來(lái)說(shuō)，本研究可為構(gòu)建葡萄酒OTA污染的預(yù)警機(jī)制提供理論依據(jù)。