龐翠萍，劉松，周景文，張國強*，李江華

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫,214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫,214122)

脂肪氧合酶(lipoxygenase，LOX，EC. 1.13.11.12)屬于脂質(zhì)過氧化酶的異構(gòu)家族，主要催化具有一個或多個cis,cis-1,4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多不飽和脂肪酸的特異性雙加氧反應(yīng)[1]，生成氫過氧化物，進一步轉(zhuǎn)化為一系列具有生物活性的氧化脂類[2]。在食品加工領(lǐng)域，LOX可以介導(dǎo)小麥面筋中二硫鍵的形成，起到強筋、改善面團流變性的作用[3]。LOX也可與過氧化氫酶、異構(gòu)酶和脫氫酶協(xié)同作用，增強水果和蔬菜的自然香氣[4]?；贚OX開發(fā)的漂白劑和洗滌劑具有天然、溫和、多效等特點[5]。此外，在制藥行業(yè)中，LOX則可用于氯丙嗪的去除[6]。

現(xiàn)階段，商業(yè)化的LOX主要來源于植物提取，但由于原料批次間成分不穩(wěn)定及提取方法低效等問題，LOX導(dǎo)致成品質(zhì)量不穩(wěn)定，成本較高。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，微生物發(fā)酵生產(chǎn)LOX因其生產(chǎn)成本低，綠色高效而得到廣泛的關(guān)注。常用的模式菌株Escherichiacoli具有遺傳背景清晰、生長周期短、培養(yǎng)成本低、產(chǎn)量高等優(yōu)點，常被用作重組蛋白的表達宿主[7]。細菌來源的LOX在E.coli表達系統(tǒng)中具有高效表達的潛力。其中，Pseudomonasaeruginosa來源的LOX被研究的較多[8]，Burkholderiathailandensis來源的LOX因其能有效轉(zhuǎn)化亞油酸為羥基不飽和脂肪酸等，用于化妝品防腐劑也被關(guān)注[5, 9]。目前，重組LOX存在表達量低、穩(wěn)定性差等問題，限制了其工業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用。隨著現(xiàn)代酶工程技術(shù)的發(fā)展，通過對不同來源LOX酶學(xué)性質(zhì)的分析比較，利用分子改造與表達優(yōu)化等策略將有利于實現(xiàn)LOX的高效異源表達。本研究通過構(gòu)建重組E.coli分別表達P.aeruginosa與B.thailandensis來源的LOX并對其酶學(xué)性質(zhì)比較分析，選擇酶學(xué)性能優(yōu)良的PaLOX進一步表達優(yōu)化，提高其可溶性表達水平，為構(gòu)建高效的LOX表達系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究所用質(zhì)粒與菌株見表1。

1.1.2 試劑

DNA聚合酶、DNA連接酶、E.coli感受態(tài),TaKaRa公司；ClonExpress?Ⅱ One step Cloning Kit試劑盒,南京諾唯贊公司;質(zhì)粒提取試劑盒、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)等,生工生物工程(上海)股份有限公司；亞油酸,麥克林(上海)公司。所有化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

表1 研究所用質(zhì)粒和菌株Table 1 Plasmids and strains used in this work

1.1.3 培養(yǎng)基和緩沖液

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5、胰蛋白胨10、NaCl 10、自然pH。

TB(Terrific-broth)培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉24、胰蛋白胨12、甘油5、KH2PO42.31、K2HPO4·3H2O 16.43、pH 7.0。

固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加質(zhì)量分數(shù)為1.5%～2%的瓊脂粉。

緩沖液A：20 mmol/L KH2PO4-K2HPO4，pH 7.5。

緩沖液B：20 mmol/L KH2PO4-K2HPO4，500 mmol/L咪唑，pH 7.5。

1.2 實驗方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

基于E.coli密碼子偏好性優(yōu)化合成Btlox基因(序列號：YP_442874.1)。為便于純化，設(shè)計引物F1、R1(見表2)在N端引入組氨酸標簽，PCR擴增得到Btlox片段。質(zhì)粒pET-22b(+)經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切后得到載體pET-22b(+)的線性化片段。經(jīng)重組、轉(zhuǎn)化即得到表達載體pET-22b(+)/Btlox。

表2 質(zhì)粒構(gòu)建過程中所用引物Table 2 Primers used in the construction of plasmids

質(zhì)粒pCold-TF經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切后得到載體pCold-TF的線性化片段。利用引物F2、R2(見表2)擴增得到目的基因Palox片段,經(jīng)重組、轉(zhuǎn)化得到表達載體pCold-TF/Palox。引物、基因合成與DNA測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2.2 重組LOX的表達

將各株重組甘油菌劃線于LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)12 h，單菌落接種于裝有10% LB培養(yǎng)基的250 mL 搖瓶中，37 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)8～10 h。按4%的接種量接入裝有10% TB培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，于37 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)至菌體密度(OD600)達到0.5～0.6，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，20 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h。以上培養(yǎng)過程均需添加100 μg/mL氨芐青霉素以維持質(zhì)粒穩(wěn)定及防止雜菌污染。

1.2.3 重組LOX的純化

利用鎳柱親和層析的方法對LOX蛋白進行分離純化。具體過程如下：不同重組菌的發(fā)酵液及細胞提取物均在4 ℃,14 000 r/min下離心15 min取上清液，并用0.22 μm的混合纖維素膜過濾除雜。將樣品上樣于已用緩沖液A預(yù)平衡的鎳親和層析柱中，待再次平衡后，用8%緩沖液B洗脫雜蛋白。用20%緩沖液B洗脫目標LOX，隨后于預(yù)冷的緩沖液A中在4 ℃環(huán)境下透析獲得純蛋白。

1.2.4 菌體濃度OD600值的測定

發(fā)酵液用緩沖液A稀釋相應(yīng)倍數(shù)后，檢測600 nm下的吸光值，以O(shè)D600值表示。OD600值與菌體干重之間的換算關(guān)系為當OD600值為1時，菌體質(zhì)量濃度為0.578 g/L，可以計算出相應(yīng)OD600值所對應(yīng)的菌體干重。

1.2.5 LOX酶活力的測定

LOX的酶活力檢測方法根據(jù)STEFAN[10]的方法進行了改進。酶活力測定條件：亞油酸在緩沖液A中稀釋至終濃度0.32 mmol/L，將200 μL亞油酸底物緩沖液與20 μL稀釋的LOX酶液混勻，25 ℃孵育4 min。每隔10 s向混合物中添加10 μL 10 mg/mL可溶性淀粉和40 μL飽和碘化鉀溶液。最后，添加500 μL 體積分數(shù)15.0%的乙酸溶液顯色10 min，測定470 nm下的吸光值。在所有的實驗中，以失活LOX作為空白對照。單位LOX酶活力定義：1 min內(nèi)470 nm下的吸光值增加0.001即為1個酶活力單位(U)。

1.2.6 SDS-PAGE電泳及蛋白濃度檢測

10%的NuPAGE?SDS-PAGE蛋白膠用于分析蛋白的表達水平，以2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液為電泳緩沖液，上樣量為15 μL，電泳電壓為120 V。采用Brandford方法[11]測定蛋白濃度。

1.2.7 LOX最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性的測定

最適反應(yīng)溫度：將溶有底物的緩沖液A分別在20～60 ℃的條件下孵育10 min，在不同溫度下測定LOX酶活力，以酶活力最高者為100%。

熱穩(wěn)定性：重組LOX的熱穩(wěn)定性用30 ℃和50 ℃下酶活力的半衰期(t1/2, min)來表示。將純酶用緩沖液A稀釋到100 μg/mL，在不同溫度下保溫，間隔5 min取樣測定殘余酶活力，將殘余酶活力按照文獻所述方式擬合并計算半衰期(t1/2, min)[12]。

1.2.8 LOX最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性的測定

最適反應(yīng)pH：分別用濃度為20 mmol/L的CH3COOH-CH3COONa (pH 3～6)、K2HPO4-KH2PO4(pH 6～8)、C2H5NO2-NaOH (pH 8～11)的緩沖液配制底物，測定純酶在不同pH下的酶活力，將最高酶活力值定義為100%，采用非線性回歸擬合曲線。

pH穩(wěn)定性：將純酶液用上述不同pH緩沖液稀釋至100 μg/mL，在25 ℃下放置1 h，測定殘余酶活力，以未保溫酶液的酶活力為100%，采用非線性回歸擬合曲線。

1.2.9 金屬離子對酶活力的影響

將純酶在pH 7.5,20 mmol/L Tris-HCl緩沖液中透析以置換緩沖液A。在底物中分別添加終濃度為0.1 mol/L和1 mol/L的一價(Li+、Na+)、二價金屬離子(Ca2+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+)，測定添加金屬離子后純化酶的酶活力，以無任何添加物下的酶活力為100%。

1.2.10 底物促溶劑對酶活力的影響

在緩沖液A中分別添加體積分數(shù)為2%和6%的有機溶劑(甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇、二甲基亞砜)促進底物在緩沖液內(nèi)分散，測定添加底物促溶劑后純酶的酶活力，以無任何添加條件下的酶活力為100%。

1.2.11 LOX的動力學(xué)常數(shù)測定

用緩沖液A配制不同濃度(0.02～0.2 mmol/L)的亞油酸底物溶液，在25 ℃下分別測定LOX催化不同濃度亞油酸生成氫過氧化物的速率，采用非線性回歸擬合計算Km和Kcat。

2 結(jié)果與分析

2.1 LOX基因進化樹構(gòu)建與性質(zhì)分析

通過MEGA 6.06軟件對12種來源的LOX基因序列進行分析，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過Kimura 2-Parameter Distance模型計算進化距離。如圖1所示，來源于P.aeruginosaPA01和B.thailandensisE264的LOX進化距離接近。結(jié)合前期研究報道(見表3)，來源于P.aeruginosa、B.thailandensis的LOX的底物親和力相對其他原核細菌來源的高，具有較大的開發(fā)潛力。因此，我們選取來源于P.aeruginosa和B.thailandensis的LOX基因進行異源表達，并比較分析其酶學(xué)性質(zhì)。

2.2 LOX在E. coli BL21(DE3)中的表達

為研究LOX的表達情況，分別在E.coliBL21(DE3)中構(gòu)建表達PaLOX、BtLOX的重組質(zhì)粒pET-22b(+)/Palox、pET-22b(+)/Btlox(圖2-a)，并在20 ℃條件下誘導(dǎo)表達。

圖1 LOX的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree on the basis of LOXs

表3 LOX酶學(xué)性質(zhì)分析Table 3 Comparison of LOXs properties from different sources

a-LOX表達式質(zhì)粒；b-SDS-PAGE電泳分析圖 M-蛋白質(zhì)標準分子量；箭頭表示PaLOX和BtLOX蛋白條帶圖2 構(gòu)建的LOX表達質(zhì)粒和Palox、Btlox 表達蛋白SDS-PAGE電泳分析圖Fig.2 Construction of LOX expression plasmid and SDS-PAGE analysis of the expressed Palox and Btlox

通過蛋白表達分析發(fā)現(xiàn)，PaLOX、BtLOX在胞內(nèi)可溶和不溶部分均有明顯條帶，其大小約為70 kDa。而BtLOX胞外未見重組蛋白條帶(圖2-b)。LOX活性結(jié)果顯示，PaLOX發(fā)酵上清液LOX酶活力為351 U/DCW(Units per Dry Cell Weight)，胞內(nèi)為726 U/DCW；BtLOX胞內(nèi)酶活力為597 U/DCW。上述結(jié)果表明，Palox和Btlox基因在E.coli中均實現(xiàn)了可溶表達，與以往研究報道[13]不一致的是，BtLOX表達過程中產(chǎn)生了大量的包涵體，可能是由于誘導(dǎo)溫度高于16 ℃所致。

2.3 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性

為評估LOX的應(yīng)用潛力，對LOX的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性進行了比較分析。結(jié)果表明，重組PaLOX和BtLOX的最適反應(yīng)溫度分別為25和35 ℃(圖3-a)。隨著反應(yīng)溫度的不斷升高，當反應(yīng)溫度超過50 ℃時，2種來源的LOX活力均顯著降低，但BtLOX活性下降較PaLOX明顯。進一步研究LOXs的熱穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，在30 ℃的條件下孵育，PaLOX和BtLOX的酶活力下降趨勢緩慢，t1/2分別為59 min和157 min。在50 ℃的條件下孵育，隨著時間的延長，二者活力下降趨勢均較明顯，PaLOX和BtLOX的t1/2分別為7 min和5 min(圖3-b)。上述結(jié)果表明，30 ℃條件下重組BtLOX的穩(wěn)定性較PaLOX好，而在50 ℃條件下則較PaLOX差。

a-最適反應(yīng)溫度；b-不同溫度下的熱穩(wěn)定性圖3 溫度對LOX催化活性及穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of temperature on the catalytic efficiency and stability of LOX

2.4 最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性

為了評估pH對LOX的影響，測定了pH在3.0～11.0之間LOX的酶活力變化。結(jié)果顯示，重組PaLOX和BtLOX的最適反應(yīng)pH分別為7.0和7.5，pH值>8.0或<6.5均會使LOX的催化活性快速下降；當pH<4.5或>10.0時，LOX的催化活性基本完全喪失(圖4-a)。對LOX的pH穩(wěn)定性進行分析，結(jié)果表明重組PaLOX在pH 6.0～10.0之間均較BtLOX穩(wěn)定，而在pH<5.0時，BtLOX的穩(wěn)定性有所提高(圖4-b)。

a-不同pH條件下LOX的催化活性； b-不同pH條件下LOX的穩(wěn)定性圖4 pH對LOX酶活力及穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of pH on the catalytic efficiency and stability of LOX

2.5 金屬離子對LOX酶活力的影響

對酶有激活作用的激活劑，能在酶與底物之間形成一種酶-金屬離子-底物的三元復(fù)合物，有利于底物與酶的活性中心結(jié)合；而對酶活力有抑制作用的，則可作為酶的抑制劑。因此，實驗研究了金屬離子對2種LOX酶活力的影響(圖5)。其中Mg2+和Na+對PaLOX和BtLOX有激活作用，Cu2+、Zn2+對二者有明顯的抑制作用。值得注意的是，低濃度的Fe2+對BtLOX有激活作用，而對PaLOX則有抑制作用。

a-金屬離子對BtLOX活性的影響； b-金屬離子對PaLOX活性的影響圖5 金屬離子對LOX催化活性的影響Fig.5 Effect of metal ions on catalytic activity of LOX

2.6 底物促溶劑對LOX酶活力的影響

酶和底物之間的結(jié)合能力是酶催化反應(yīng)的主要推動力，其中底物的溶解度是直接影響酶和底物結(jié)合的因素。通過比較不同底物促溶劑對LOX酶活力的影響，發(fā)現(xiàn)體積分數(shù)為2%的甲醇、乙醇、乙二醇、異丙醇和丙酮對PaLOX的酶活力影響不大。在體積分數(shù)為6%下，PaLOX酶活力受到了抑制，可能是高濃度的有機溶劑使部分酶失活所致。體積分數(shù)為2%和6%的甲醇、乙醇、乙二醇對BtLOX酶活力均有不同程度的提高，特別是甲醇和乙二醇能顯著提高40%的酶活力，可能是由于甲醇和乙二醇改善了底物亞油酸的溶解度，進而提高了BtLOX的酶活力(圖6)。AN等[14]曾報道體積分數(shù)為6%的甲醇可以作為底物促溶劑有效改善LOX的催化效率。

2.7 LOX酶動力學(xué)分析

酶的動力學(xué)參數(shù)是評價酶與底物的親和力及催化活性的重要指標。據(jù)報道，野生型PaLOX以亞油酸為底物的Km值為660 μmol/L[19]，而進行重組表達后，Km值則為48.9 μmol/L[8]，表明重組表達有利于提高PaLOX對底物的親和力。因此，分析比較了重組PaLOX和BtLOX在不同亞油酸濃度下的酶促動力學(xué)參數(shù)(表4)。結(jié)果表明，以亞油酸作為底物時，重組表達的PaLOX的底物親和力較BtLOX高14.9倍；Kcat/Km較BtLOX高16.7倍。因此，PaLOX在底物親和力、催化效率以及表達效果上優(yōu)勢明顯，具有更好的開發(fā)應(yīng)用潛力。

表4 LOX酶動力學(xué)參數(shù)Table 4 LOX kinetic parameters

2.8 誘導(dǎo)劑優(yōu)化對PaLOX表達水平的影響

如何提升外源蛋白高效、可溶表達是工業(yè)酶生產(chǎn)與應(yīng)用的瓶頸。前期研究也發(fā)現(xiàn)，雖然2種細菌來源的LOX均能異源表達，但表達過程中存在著大量的包涵體，可溶表達水平較低。為進一步實現(xiàn)LOX的高效可溶表達，選擇可溶性表達與應(yīng)用潛力較好的PaLOX，通過設(shè)計不同濃度的IPTG和乳糖的組合添加，進行表達條件優(yōu)化。結(jié)果表明，隨IPTG濃度的降低，乳糖濃度的增加，PaLOX的酶活力在不斷增加。當單獨使用乳糖作為誘導(dǎo)劑時，PaLOX酶活力較IPTG作為誘導(dǎo)劑時提高了1.53倍，可溶表達水平提高了2.41倍，不可溶部分也提高了1.29倍(圖7)。雖然更換誘導(dǎo)劑可以大幅提高PaLOX的表達水平與酶活力，但未能完全解決包涵體問題。

1-1 mmol/L IPTG;2-0.8 mmol/L IPTG+0.56 mmol/L乳糖; 3-0.6 mmol/L IPTG+1.11 mmol/L乳糖;4-0.4 mmol/L IPTG+ 1.67 mmol/L乳糖;5-0.2 mmol/L IPTG+2.22 mmol/L 乳糖;6-2.78 mmol/L乳糖圖7 不同濃度IPTG和乳糖濃度組合對LOX活性 和表達水平的影響Fig.7 Effect of combination of IPTG and lactose concentration on LOX activity and expression level

2.9 分子伴侶促進PaLOX的可溶表達

在重組蛋白的表達過程中，合適的載體和分子伴侶對重組蛋白的正確折疊，防止包涵體的形成具有積極作用[20]。觸發(fā)因子(triggering factor，TF)是一種來源于E.coli的核糖體結(jié)合伴侶蛋白，是第1個與新生多肽鏈相互作用并協(xié)助蛋白質(zhì)共翻譯折疊的伴侶[21]，可有效促進蛋白的可溶表達。因此，構(gòu)建了分子伴侶TF融合表達質(zhì)粒pCold-TF/Palox(圖8-a)，分析TF對PaLOX可溶表達的影響。結(jié)果表明，TF-PaLOX融合酶活力較PaLOX提高了1.85倍，達到4520 U/DCW(圖8-b)。SDS-PAGE分析顯示，胞內(nèi)不溶部分基本消失，可溶表達水平提高了3.19倍(圖8-c)。與其他來源的標簽相比，TF表達效率高，可溶性效果好，能有效促進PaLOX的可溶表達，具有重要的應(yīng)用價值。

a-pCold-TF/lox表達質(zhì)粒示意圖；b-胞內(nèi)LOX活性分析；c-SDS-PAGE電泳分析 M-蛋白質(zhì)標準相對分子質(zhì)量；1,2-TF-PaLOX的SDS-PAGE分析；3,4-PaLOX的SDS-PAGE分析；其中1,3-胞內(nèi)可溶部分；2,4-胞內(nèi)不溶部分圖8 TF對LOX表達的影響Fig.8 Effect of TF on LOX expression

3 結(jié)論與討論

由于LOX在食品、醫(yī)藥、造紙等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，研究者對其進行了大量研究，包括從天然酶的分離提取[22-23]到LOX異源表達與分子改造等[17, 24]。到目前為止，已經(jīng)有大量來自植物[25]、動物[26-27]和真菌[16, 24]等的LOX基因被克隆并成功表達。本研究以原核細菌來源的P.aeruginosa、B.thailandensisLOX基因為研究對象，通過將其在E.coli中異源表達，比較酶學(xué)性質(zhì)，并利用優(yōu)化誘導(dǎo)劑及分子伴侶融合表達策略，最終實現(xiàn)了LOX在E.coli表達系統(tǒng)中的高效可溶性表達。實驗結(jié)果表明,TF作為促折疊的分子伴侶，通過與未折疊的蛋白結(jié)合，有效促進LOX的可溶表達。另外，TF催化肽基脯氨酰鍵的順反異構(gòu)化，可能也有利于改善蛋白質(zhì)折疊過程中的限速步驟[21]。

目前研究表明，細菌來源的LOX的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性較其他來源的LOX差，限制了其工業(yè)應(yīng)用。已有對LOX熱穩(wěn)定性研究的報道，例如通過在LOX的N-端和C-端的loop結(jié)構(gòu)域(L6)插入1～3個L6序列[28]，或融合雙親短肽[8]，以及高柔性loop區(qū)域改造[29]等策略，可有效提高其熱穩(wěn)定性。因此，在后期研究中，進一步利用理性改造、定向進化等策略進行LOX分子改良，并結(jié)合高效的蛋白表達系統(tǒng)，將有利于實現(xiàn)LOX的高效生物合成，有效拓展LOX的工業(yè)應(yīng)用范圍。