孫駿，肖亮，宋健博

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院介入科，沈陽(yáng) 110032）

動(dòng)脈粥樣硬化是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、腦梗死和周圍血管疾病的主要病因［1-2］。動(dòng)脈粥樣硬化的病理基礎(chǔ)是脂質(zhì)代謝紊亂，其特征是內(nèi)膜和中膜的動(dòng)脈病變［3］。血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）是動(dòng)脈壁的重要組成部分，其功能變化可能參與動(dòng)脈粥樣硬化［4-5］。VSMCs的功能變化也發(fā)生在重要器官（心臟、腦和腎臟［6-7］）血管中，可引起局部缺血和壞死（心肌梗死、腦梗死和腎梗死［8］）。然而，目前VSMCs促成動(dòng)脈粥樣硬化的具體分子機(jī)制尚不完全清楚。

最近，已經(jīng)充分確信了人類基因組表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控，特別是長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long-chain noncoding RNA，lncRNA）的功能［9］。lncRNA已確定與心血管疾?。▌?dòng)脈粥樣硬化、心肌纖維化、脂質(zhì)代謝和血管內(nèi)皮異常等）有關(guān)［10］。在由氧化修飾的低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）誘導(dǎo)的VSMCs中，尿路上皮癌相關(guān)1（urothelial carcinoma-associated 1，UCA1）lncRNA通過(guò)下調(diào)磷酸酶和張力蛋白同源蛋白（phosphatase and tensin homolog，PTEN）來(lái)上調(diào)表達(dá)并拮抗miR-26a，從而調(diào)節(jié)增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、α-SMA和SM22-α的表達(dá)［11］。在ox-LDL處理的人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（human coronary artery endothelial cells，HCAECs）中，lncRNA MALAT1表達(dá)上調(diào)，敲除MALAT1可以通過(guò)結(jié)合miR -155/SOCS1軸促進(jìn)ox-LDL處理的HCAECs的細(xì)胞因子釋放和細(xì)胞凋亡［12］。本研究探討lncRNA NEAT1在VSMCs增殖和凋亡中的作用及其信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人主動(dòng)脈VSMCs購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。TRIzol試劑盒購(gòu)自寶生物工程有限公司。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，DEME培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GE公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物工程有限公司。PCR儀為ABI 7500，酶標(biāo)儀為Thermo FC。β-actin及hnRNPA1抗體購(gòu)自上海賽信通生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：VSMCs用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 鏈霉素的DEME培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，48 h消化傳代。為了探究lncRNA NEAT1在動(dòng)脈粥樣硬化環(huán)境中的表達(dá)是否不同，對(duì)VSMCs給予ox-LDL梯度濃度處理，分別在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入0、25、50、100、150 mg/L的ox-LDL后繼續(xù)培養(yǎng)VSMCs 48 h。按照試劑說(shuō)明書要求取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的VSMCs，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度約為70%時(shí)經(jīng)LipofectamineTM3000 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR：使用TRIzol 試劑盒提取細(xì)胞總RNA，按照試劑盒說(shuō)明書要求操作。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為 20 μL 反應(yīng)體系，反應(yīng)條件 25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。以18 S作為內(nèi)參，實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)采用20 μL 反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為 95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)。2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)，所有反應(yīng)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。NEAT1引物序列：F，5’-CAGTTAGTTTATCAGTTCTC CCATCCA-3’；R，5’-GTTGTTGTCGTCACCTTTCAAC TCT-3’。

1.2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)：使用胰酶消化細(xì)胞，按照每孔3×103個(gè)細(xì)胞將細(xì)胞添加至96 孔板，每組為5個(gè)復(fù)孔，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)，分別于1、2、3、4、5 d在每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔的吸光度值。

1.2.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：VSMCs加入處理因素48 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞用不含EDTA胰蛋白酶消化，1 500g離心5 min后收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌2次，離心后收集細(xì)胞5×105，加入100 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI 染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，再加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液，輕輕混勻。樣品在1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 Western blotting檢 測(cè)VSMCs中hnRNPA1的表達(dá)：培養(yǎng)或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以RIPA緩沖液裂解，BCA法提取蛋白質(zhì)定量，使用10%SDS-PAGE分離膠電泳分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)至PVDF膜，使用5%胎牛血清4 ℃封閉膜過(guò)夜。分別孵育hnRNPA1及β-actin一抗（1 ∶1 000稀釋）及二抗（1 ∶5 000），最后用ECL底物試劑盒檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 lncRNA NEAT1對(duì)VSMCs增殖、凋亡的影響

結(jié)果顯示，使用0、25、50、100、150 mg/L ox-LDL處理后的VSMCs中NEAT1表達(dá)分別為1.09±0.08、1.38±0.07、3.13±0.07、5.11±0.10、5.42±0.11。與0、25 mg/L ox-LDL處理組比較，50、100、150 mg/L ox-LDL處理組NEAT1表達(dá)明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜ 0.05）。

VSMCs與ox-LDL（100 mg/L）一起培養(yǎng)0、6、12、24、48 h，NEAT1的表達(dá)分別為1.07±0.11、1.30±0.07、2.15±0.15、3.25±0.25、5.49±0.20。與一起培養(yǎng)0、6、12 h比較，24、48 h時(shí)NEAT1的表達(dá)增高顯著（P＜0.05）?？梢?jiàn)NEAT1的表達(dá)隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。

將靶向NEAT1的特殊寡核苷酸轉(zhuǎn)染到VSMCs中以沉默NEAT1的表達(dá)。CCK-8增殖測(cè)定表明，與對(duì)照組（siRNA-NC組）比較，si-NEAT1組VSMCs增殖活性顯著降低（P＜ 0.05）。表明NEAT1沉默抑制了VSMCs的增殖活性（圖1）。與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染si-NEAT1后VSMCs表現(xiàn)誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡（圖2）。

圖1 NEAT1沉默對(duì)VSMCs增殖的影響Fig.1 Effect of NEAT1 knockdown on the proliferation of VSMCs

圖2 NEAT1沉默對(duì)VSMCs凋亡的影響Fig.2 Effect of NEAT1 knockdown on the apoptosis of VSMCs

2.2 miR-490-3p的表達(dá)

si-NEAT1轉(zhuǎn)染細(xì)胞中miR-490-3p表達(dá)檢測(cè)，結(jié)果顯示，與si-NEAT1轉(zhuǎn)染前（0.43±0.05）比較，si-NEAT1轉(zhuǎn)染后（1.01±0.07）miR-490-3p表達(dá)顯著增高（P＜ 0.05）。然而NEAT1表達(dá)在miR-490-3p表達(dá)上調(diào)前后分別為0.98±0.06、0.97±0.04，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），可見(jiàn)miR-490-3p表達(dá)上調(diào)并不影響NEAT1表達(dá)，因此推斷miR-490-3p可能是NEAT1的抑制劑靶點(diǎn)。

2.3 starBase V3.0軟件預(yù)測(cè)NEAT1互補(bǔ)結(jié)合的下游miRNA及基因

結(jié)果顯示，NEAT1可與miR-490-3p互補(bǔ)結(jié)合；miR-490-3p可與Hnrnp A1mRNA互補(bǔ)結(jié)合，見(jiàn)圖3 。

2.4 Western blotting檢測(cè)VSMCs中hnRNPA1表達(dá)

結(jié)果顯示，與si-NC組（1.37±0.04）比較，si-NEAT1轉(zhuǎn)染組（1.11±0.07）hnRNPA1表達(dá)顯著降低（P＜ 0.05）。與NC組（1.89±0.07）比較，miR-490-3p過(guò)表達(dá)組（1.18±0.06）hnRNPA1表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4。表明NEAT1/miR-490-3p/hnRNPA1信號(hào)通路在VSMCs的增殖和凋亡中具有重要作用。

圖3 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)NEAT1互補(bǔ)結(jié)合情況Fig.3 Bioinformatics software predicts the sequences complementary to that of NEAT1

3 討論

已有研究［13］表明lncRNA與血管平滑肌細(xì)胞的增殖和侵襲有關(guān)。MANG等［14］報(bào)道lncRNA NEAT1可以通過(guò)調(diào)節(jié)hnRNPA2的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展，且該調(diào)控與NEAT1-U2AF65 蛋白復(fù)合物有關(guān)。SUN等［15］研究發(fā)現(xiàn)，NEAT1通過(guò)與miRNA-19a-3p結(jié)合來(lái)上調(diào)SMYD2，從而促進(jìn)心臟肥大的發(fā)生和發(fā)展。ZOU等［16］報(bào)道NEAT1可以通過(guò)刺激miR-224-5p促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，這表明NEAT1/miR-224-5p軸可以作為黑素瘤標(biāo)記物。然而lncRNA NEAT1在VSMCs中的具體作用機(jī)制尚不完全清楚。

圖4 si-NEAT1轉(zhuǎn)染及miR-490-3p過(guò)表達(dá)時(shí)hnRNPA1的表達(dá)情況Fig.4 Expression of hnRNPA1 during si-NEAT1 transfection and miR-490-3p overexpression

本研究結(jié)果表明lncRNA NEAT1對(duì)VSMCs具有促進(jìn)增殖作用，在經(jīng)ox-LDL處理過(guò)的細(xì)胞中呈高表達(dá)，NEAT1沉默能夠抑制VSMCs的增殖。lncRNA能夠調(diào)控miRNA的表達(dá)和活性，LI等［17］發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1通過(guò)海綿效應(yīng)吸附miR-23c來(lái)促進(jìn)小鼠腎小球系膜細(xì)胞的增殖、纖維化和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時(shí)阻止小鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)糖尿病性腎病的發(fā)生和發(fā)展，表明NEAT1可作為糖尿病性腎病治療的有效標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。WEI等［18］證明了lncRNA NEAT1通過(guò)海綿效應(yīng)吸附miR-144-3p來(lái)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑，促進(jìn)敗血癥誘導(dǎo)的心肌損傷進(jìn)展，揭示了NEAT1對(duì)膿毒癥和膿毒癥所致心肌損傷的作用。lncRNA和miRNA在VSMCs中的研究目前鮮有報(bào)道，還需要大量實(shí)驗(yàn)予以證實(shí)。本研究證實(shí)了miR-490-3p為NEAT1的抑制靶標(biāo)，下調(diào)NEAT1的表達(dá)能夠增加miR-490-3p表達(dá)，但是miR-490-3p表達(dá)增高并不能影響NEAT1表達(dá)，因此認(rèn)為miR-490-3p是NEAT1的直接靶標(biāo)。

hnRNPA1屬于保守的不均一性核糖核蛋白家族。研究［19］顯示hnRNPA1主要有影響轉(zhuǎn)錄、mRNA剪切、核穿梭、miRNA生物合成4種功能。已有研究［20］表明hnRNPA1改變會(huì)影響轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的不同RNA代謝過(guò)程，這種改變也參與癌癥、神經(jīng)降解性疾病和阿爾茨海默病。WEN等［21］發(fā)現(xiàn)lncRNA ANCR通過(guò)抑制hnRNPA1降解和海綿吸附miR-140-3p來(lái)上調(diào)hnRNPA1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，表明hnRNPA1可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。NISHIKAWA等［22］研究表明hnRNPA1和hnRNPU調(diào)節(jié)TRA2B轉(zhuǎn)錄和外顯子2的可變剪接并且在結(jié)腸癌細(xì)胞的異常增殖中起關(guān)鍵作用。本研究si-NEAT1轉(zhuǎn)染VSMCs中hnRNPA1表達(dá)顯著降低，同時(shí)在miR-490-3p過(guò)表達(dá)的VSMCs中hnRNPA1表達(dá)顯著降低。表明過(guò)表達(dá)lncRNA NEAT1通過(guò)使miR-490-3p/hnRNPA1軸海綿化而促進(jìn)VSMCs增殖。

綜上所述，miR-490-3p是NEAT1的抑制靶標(biāo)，lncRNA NEAT1通過(guò)激活miR-490-3p/ hnRNPA1軸促進(jìn)VSMCs增殖、減少VSMCs早期凋亡。因此認(rèn)為NEAT1有望成為動(dòng)脈粥樣硬化基因治療的新靶標(biāo)。