王淑妹，趙麗，熊鷹，張曉維，梁國新，耿文清

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，國家衛(wèi)生健康委員會艾滋病免疫學重點實驗室，國家臨床醫(yī)學研究中心，遼寧省艾滋病免疫學重點實驗室，中國醫(yī)學科學院艾滋病免疫學重點實驗室，沈陽 110001）

人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染可誘導宿主固有免疫應答并進一步產(chǎn)生適應性免疫應答，宿主免疫系統(tǒng)長期、持續(xù)以及過度的活化進而造成的免疫系統(tǒng)崩潰是引起獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）的主要原因。宿主病毒限制性因子作為固有免疫系統(tǒng)的重要成員，是人體針對病毒病原體入侵的第一道防線［1-4］。目前已報道的HIV-1限制因子主要包括三結構域5α（tripartite motif 5α，TRIM5α）、SAM和HD結構域包含蛋白1（sterile alpha motif and histidine-aspartic acid domain containing protein 1，SAMHD1）、骨髓基質抗原-2（bone marrow stromal antigen 2，BST-2）、黏液病毒抗性蛋白2（myxovirus resistance protein 2，MX2）和脂蛋白B mRNA催化多肽3G（apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3G，APOBEC3G）等［5］，均能在病毒復制周期的不同階段通過不同機制不同程度地抑制病毒復制。隨著越來越多的限制因子被發(fā)現(xiàn)，識別和明確這些限制因子的抗病毒機制有助于開發(fā)其作為HIV治療靶點的潛力［6］。細胞膜金屬蛋白酶TRAB結構域包含蛋白2B（TRAB domain-containing protein 2B，TRABD2B）屬于細胞膜金屬蛋白酶家族［7］，該家族成員主要包括TRABD2A和TRABD2B。最新研究［8］表明，TRABD2A在HIV-1感染中能夠發(fā)揮抗病毒功能，通過降解宿主細胞膜上的病毒結構蛋白Gag進而抑制HIV-1復制，而TRABD2A和TRABD2B同源基因在脊椎動物中高度保守［9］，提示TRABD2B可能同樣具有抗病毒功能。本研究旨在探討TRABD2B對HIV復制的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑： 胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素（美國Gibco公司）；Lipofectamine 3000試劑、TRIzol試劑和siRNA（美國Invitrogen公司）；jetPRIME轉染試劑盒（法國PolyPlus公司）；熒光素酶活性檢測試劑盒（美國Promega公司）；HIV-1 p24 抗原檢測試劑盒（美國ABL公司）；逆轉錄試劑盒和TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（日本TaKaRa公司）；人CD4+T細胞負選試劑盒和人單核細胞陽性分選試劑盒（美國Stemcell公司）；重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子GM-CSF（美國R&D公司）；pHIV-1NL4-3、pHIV-1NL4-3-Luc、pHIV-2st和pSIVmac239病毒質粒均由本實驗室保存，pTRABD2B-GFP、pMock和pVSV-G表達質粒均購自上海和元生物技術公司。

1.1.2 儀器：Tecan Spark酶標儀（瑞士Tecan公司）；高速離心機和普通PCR儀（德國Eppendorf公司）；QuantStudioTM3實時定量PCR儀（美國ABI公司）；Evos FL Auto倒置熒光顯微鏡和CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 研究對象

招募中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院健康志愿者3例，年齡23～30歲，其中，男1例，女2例，近1個月來無細菌或病毒性感染，每例采集全血100 mL。

1.3 研究方法

1.3.1 原代細胞的分離和培養(yǎng)：采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞（PBMCs），試劑盒分選CD4+T細胞和CD14單核細胞。用50 ng/mL GM-CSF誘導培養(yǎng)單核細胞7 d以獲得人單核細胞來源的巨噬細胞（monocyte derived macrophages，MDM）。

1.3.2 細胞系培養(yǎng)：人宮頸癌細胞系TZM-bl和人胚腎293T細胞系于DMEM完全培養(yǎng)基（美國HyClone公司）中培養(yǎng)，內含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素，置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 HIV-1假病毒包裝實驗：采用jetPRIME轉染試劑盒，在人胚腎293T細胞中共轉pHIV-1NL4-3-Luc和pVSV-G表達質粒。48 h后收集細胞培養(yǎng)上清，0.45 μm濾器過濾，ELISA法檢測HIV-1 p24 抗原，分裝后置于-80 ℃保存。

1.3.4 ELISA法檢測HIV-1 p24 抗原：收集細胞培養(yǎng)上清，采用HIV-1 p24 抗原檢測試劑盒檢測p24 抗原。按試劑說明書稀釋標準品，并稀釋樣品至適宜濃度。反應板中各孔均加入裂解液25 μL，于每孔中加入已稀釋的標準品、樣品、陽性和陰性對照各100 μL，封板，37 ℃孵育1 h；wash buffer洗板，重復5次，最后1次拍凈孔內殘余的液體；除空白孔外，所有孔中均加入酶標二抗100 μL，封板，37 ℃孵育30 min；wash buffer洗板，重復5次，最后1次拍干孔內殘余的液體；所有孔中加入顯色液A和顯色液B各50 μL，封板，37 ℃孵育30 min；所有孔中加入50 μL終止液，設置酶標儀波長為450 nm進行檢測。

1.3.5 小干擾RNA（small intefering RNA，siRNA）干擾實驗：實驗組分為陰性對照組（siCtrl）和siRNA干擾組（siTRABD2B-1、siTRABD2B-2）。采用Lipofectamine 3000轉染293T細胞，6 h后細胞換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后感染p24為10 ng的HIV-1NL4-3-Luc（VSVG）假病毒，24 h后檢測293T細胞內的熒光素酶活性。

1.3.6 Total RNA提取及實時PCR分析：采用TRIzol試劑從細胞中提取總RNA，將1 μg純化的RNA用DNase I（Invitrogen公司）在室溫下處理15 min去除DNA并逆轉錄為cDNA。PCR反應體系：TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL，上、下游引物各0.8 μL，ddH2O 8.9 μL，模板2 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸30 s，共40個循環(huán)；用2-ΔΔCt方法計算目的基因相對表達量。所用引物序列如下：TRABD2B上游引物序列5’-AACTCCTTCCTGTGGACGATT-3’，下游引物序列5’-TCCGGGATGAATGCCCAGAC-3’；GAPDH上游引物序列5’-AATGACCCCTTCATTGAC-3’，下游引物序列 5’-TCCACGACGTACTCAGCGC-3’。

1.3.7 293T細胞中TRABD2B過表達實驗：采用jetPRIME轉染試劑轉染293T細胞，在293T細胞中共轉人pTRABD2B-GFP表達質粒、pMock對照質粒和pHIV-1NL4-3、pHIV-2st和pSIVmac239病毒質粒，或共轉不同種屬pTRABD2B-GFP表達質粒、pMock對照質粒和pHIV-1NL4-3病毒質粒，不同種屬pTRABD2B-GFP主要包括人、獼猴屬、雞、斑馬魚、鼠和非洲蟾蜍屬。轉染6 h后細胞換液，48 h后收集上清感染TZM-bl細胞，24 h后裂解細胞取上清并加入熒光素酶底物，酶標儀檢測熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用表示，組間比較采用Student’t檢驗。多組進行比較時，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TRABD2B在細胞中的表達和定位

實時PCR結果顯示，293T細胞中TRABD2BmRNA表達水平高于CD4+T細胞、單核細胞和MDM細胞，差異有統(tǒng)計學意義［CD4+T細胞（0.09±0.07），單核細胞（0.10±0.07），MDM（0.27±0.04），293T細胞（5.38±1.05），均P＜ 0.001］。人pTRABD2B-GFP表達質粒轉染293T細胞并通過熒光顯微鏡觀察TRABD2B在293T細胞中的定位，結果顯示，TRABD2B主要分布于293T細胞的胞膜。見圖1。

圖1 TRABD2B在細胞中的定位 ×100Fig.1 Localization of TRABD2B in cells ×100

2.2 內源性TRABD2B對HIV-1NL4-3復制的影響

siRNA下調293T細胞中內源性TRABD2B的表達并感染p24為10 ng 的HIV-1NL4-3-Luc（VSVG）假病毒，檢測胞內熒光素酶活性。實時PCR法驗證敲減效率。siTRABD2B組293T細胞中TRABD2BmRNA表達水平與對照組siCtrl相比，差異有統(tǒng)計學意義［siTRABD2B-1組（0.28±0.07），siTRABD2B-2組（0.38±0.09），siCtrl組（1.00±0.34），均P＜ 0.001］。siTRABD2B組細胞中的熒光素酶活性與對照組siCtrl相比，差異有統(tǒng)計學意義［siTRABD2B-1（38 963.700±20 000.00），siTRABD2B-2（34 236.83±5181.48），siCtrl組（1 629.84±543.72），均P＜ 0.05］，提示敲減293T細胞中的TRABD2B可導致病毒復制增加，即內源性TRABD2B能夠抑制HIV-1NL4-3復制。

2.3 人TRABD2B對HIV-1NL4-3、HIV-2st和SIVmac239復制的影響

在293T細胞中將人pTRABD2B-GFP/pMock表達質粒和pHIV-1NL4-3/pHIV-2st/pSIVmac239病毒質粒按不同比例共轉染，48 h后收集細胞培養(yǎng)上清感染TZMbl細胞，以相對熒光單位（relative luminescence units，RLU）表示TZM-bl細胞的熒光檢測值。結果顯示，與Mock對照組相比，轉染不同比例TRABD2B后各組TZM-bl細胞中的熒光素酶活性下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜ 0.05），提示人TRABD2B可不同程度地抑制HIV-1NL4-3、HIV-2st和SIVmac239的復制。見表1。

2.4 不同種屬TRABD2B對HIV-1NL4-3復制的影響

在293T細胞中共轉不同種屬pTRABD2B/pMock表達質粒和pHIV-1NL4-3病毒質粒。結果顯示，與Mock對照組相比，轉染不同種屬TRABD2B組熒光素酶活性均降低，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜ 0.001），且來源于人的TRABD2B組熒光素酶活性降低最明顯。見表2。

表1 人TRABD2B對HIV-1NL4-3、HIV-2st和SIVmac239復制的影響Tab.1 Effects of human TRABD2B on HIV-1NL4-3，HIV-2st，and SIVmac239 replication

表2 不同種屬TRABD2B對HIV-1NL4-3復制的影響Tab.2 Effects of TRABD2B from different species on HIV-1NL4-3 replication

3 討論

HIV-1是引起AIDS的主要病原體。目前對HIV/AIDS的治療主要是高效抗逆轉錄病毒療法，由于長期治療產(chǎn)生的藥物毒性及耐藥性，仍然不能徹底治愈AIDS［10］。因此，了解病毒與宿主相互作用的機制，尋找抑制病毒復制的宿主限制因子，將其作為治療靶點對抗病毒治療尤為重要。TRABD2B作為金屬蛋白酶，主要分布于人體腎臟、心臟和脂肪組織等，研究［11］發(fā)現(xiàn)在多種癌癥組織中，TRABD2B的表達水平發(fā)生了改變。此外，TRABD2B還通過Wnt信號轉導通路調節(jié)器官發(fā)生和胚胎發(fā)育。由于TRABD2A在HIV感染中能夠發(fā)揮抗病毒功能，而TRABD2B作為TRABD2A的家族同源物是否具有抗病毒功能尚不清楚。

本研究首先對TRABD2B 在人原代細胞及細胞系中的表達進行了檢測。結果顯示，TRABD2B主要表達于293T細胞，且熒光顯微鏡觀察到TRABD2B主要定位于293T細胞的胞膜。使用siRNA下調293T細胞中TRABD2BmRNA表達并感染HIV-1NL4-3-Luc（VSVG）假病毒，結果顯示下調293T細胞中TRABD2B的表達可導致胞內熒光素酶活性增加，推測TRABD2B可能具有抗病毒功能。在293T細胞中共轉人pTRABD2B/pMock和pHIV-1NL4-3、pHIV-2st及pSIVmac239，結果顯示TRABD2B組熒光素酶表達下降，表明HIV-1NL4-3、HIV-2st和SIVmac239復制減少，進一步提示TRABD2B能夠在HIV-1NL4-3、HIV-2st和SIVmac239感染中發(fā)揮抗病毒功能。以上結果證實了對TRABD2B作為抗病毒因子的推測，TRABD2B作為金屬蛋白酶家族的成員，同TRABD2A一樣，能夠抑制HIV復制，為治療HIV/AIDS開辟了新途徑。

HIV的宿主為人類和靈長類動物，靈長類動物是人類重大疾病研究的首選實驗動物，其研究成果更容易實現(xiàn)臨床轉化。HIV最初由黑猩猩或烏白眉傳染給人類，慢病毒跨物種傳播表明病毒在宿主中的復制必須適應宿主中的物種特異性限制因子。已有研究［12-15］表明TRIM家族的蛋白通過物種依賴的方式抑制病毒復制。由于正向選擇，宿主限制因子在HIV感染的天然宿主中抗病毒作用較弱，但在跨物種傳播中可發(fā)揮強大的抑制作用［16］，而TRABD2B在人類、猿猴和鼠等多個物種表達，其在脊椎動物中具有較高的物種同源性，提示不同種屬TRABD2B在進化過程中其抗病毒功能可能保留了共性。本研究結果顯示，不同種屬的TRABD2B均可以抑制HIV-1NL4-3復制，由于人類對病毒傳播、發(fā)病機制研究的許多進展可歸功于動物模型的使用，構建HIV/AIDS靈長類動物模型是科學家們追求的目標，故不同種屬TRABD2B在HIV-1感染中抗病毒功能的保守性為動物模型的構建提供了可能性。

綜上所述，本研究首次探討了人TRABD2B作為一種抗病毒因子能夠顯著抑制HIV-1、HIV-2和SIV的復制，同時發(fā)現(xiàn)不同種屬的TRABD2B對HIV-1復制也有不同程度的抑制作用，為抗病毒治療新靶點的開發(fā)積累了資料。作為金屬蛋白酶，TRABD2B功能特性及發(fā)揮抗病毒作用的機制目前尚未闡明，有待進一步研究。