隋欣 ,徐巖 ,周佳,王偉楠,張明天,韓冬,李娜,楊擎,曲曉波,黃曉巍

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)與中藥藥理教研室，吉林 長(zhǎng)春 130117；3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)與中藥化學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春 130117；4.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院藥理組，吉林 長(zhǎng)春 130117）

隨著現(xiàn)代社會(huì)人口老齡化問題的日益加劇，軟骨損傷因具有難以修復(fù)、病程長(zhǎng)且易反復(fù)等特點(diǎn)，現(xiàn)已成為影響老年人生活質(zhì)量的主要因素之一［1-2］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一類具有多向分化潛能的多能干細(xì)胞，可在特定條件下分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和黃酮類化合物等誘導(dǎo)劑可以促進(jìn)這一過程的發(fā)生，甚至產(chǎn)生靶向作用［3-5］。梅花鹿鹿茸是吉林省道地優(yōu)勢(shì)藥材，具有“強(qiáng)筋骨”之功效，近千年來一直被廣泛應(yīng)用于各類骨病治療［6］。鹿茸中含有大量的膠原蛋白，其中Ⅰ型膠原蛋白約占90%，已被證實(shí)作為醫(yī)用生物材料對(duì)缺損組織修復(fù)、再生和重建具有重要意義［7］。但鹿茸Ⅰ型膠原（velvet antler collagen type Ⅰ，VACTⅠ）是否具有誘導(dǎo)BMSCs 成軟骨分化的作用目前尚無報(bào)道。本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察VACTⅠ對(duì)BMSCs 增殖、細(xì)胞周期以及成軟骨相關(guān)因子骨形態(tài)生成蛋白4（BMP-4）、轉(zhuǎn)錄因子Sox9、Ⅱ型膠原（type Ⅱcollagen）和聚集蛋白聚糖（aggrecan）的影響，探討其誘導(dǎo)BMSCs成軟骨化的潛在可能及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器4 周齡SD 大鼠，雄性，清潔級(jí)，由長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（吉）2016-0003。VACTⅠ由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)提供；兔抗大鼠Ⅱ型膠原（貨號(hào)：15943-1-AP）、兔抗大鼠聚集蛋白聚糖（貨號(hào)：13880-1-AP）和山羊抗兔二抗HRP（貨號(hào)：SA00001-2）購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（貨號(hào)：P1200）、全蛋白提取試劑盒（貨號(hào)：BC3711）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：PC0020）、ECL 化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：SW2010）和彩虹245 廣譜蛋白Marker（貨號(hào)：PR1920）購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，增強(qiáng)型CCK-8 試劑盒（貨號(hào)：BA00208）購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。Multiskan FC 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司），Alliance Q9 型凝膠成像儀（英國(guó)UVItec 公司），Gallios 型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司），Nanodrop 2000 型微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo 公司），CFX Connect 型熒光定量PCR 儀和CFX Manager 型采集及分析軟件（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 大鼠BMSCs 的原代及傳代培養(yǎng)大鼠脫頸椎處死后75%酒精浸泡10 min，超凈工作臺(tái)中切取雙側(cè)股骨，75%酒精浸泡2 min，移入新的超凈工作臺(tái)中，剪去兩端干骺端用PBS 緩沖液反復(fù)沖洗出骨髓細(xì)胞至離心管中，800 r·min－1離心5 min，收集BMSCs，接種于含10%FBS 和100 U·mL－1雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)，差時(shí)貼壁法純化細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，使用含EDTA 的0.25%胰酶消化傳代，取第3～5 代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8 法檢測(cè)BMSCs 增殖率取第3 代BMSCs，用胰蛋白酶消化后以每孔3 × 104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1 mL，孵育24 h 后分別加入條件培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3（TGF-β3）組（給予濃度為10 μg·L－1TGF-β3）和不同濃度VACTⅠ（給藥濃度分別為1.25、2.50、5.00、10.00和20.00 g·L－1）組。連續(xù)培養(yǎng)24、48 和72 h 后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入CCK-8 10 μL 和DMEM 190 μL，孵育4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處吸光度（A）值。細(xì)胞增殖率＝實(shí)驗(yàn)組A 值/空白對(duì)照組A 值。

1.4 ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞上清液中BMP-4 和Sox9水平按照武漢酶免生物科技有限公司ELISA 試劑盒說明書檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中BMP-4 和Sox9水平，于450 nm 波長(zhǎng)處依次讀取各孔的A 值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，A 值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程，計(jì)算各樣品水平。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率制備濃度為1 × 106mL－1的細(xì)胞懸液1 mL，離心后去上清，在細(xì)胞中加入70% 預(yù)冷乙醇500 μL 固定2 h，4℃保存，染色前用PBS 緩沖液洗去固定液。加入100 μL RNase A 溶液，重懸細(xì)胞，37℃水浴30 min，再加入400 μL PI 染色液混勻，4℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率。

1.6 RT-PCR 法檢測(cè)各組細(xì)胞中Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖mRNA 表達(dá)水平按美國(guó)Axygen 公司提供的AxyPrep 總RNA 小量制備試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì)測(cè)定總RNA 濃度。按照日本TaKaRa 公司提供的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作規(guī)程逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。以cDNA 鏈作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系：5×iScript Reaction Mixture 4 μL，iScript Reverse Transcriptase 1 μL，RNA template 1 μ g，加Nuclease-free water 至20 μL；反應(yīng)條件：37℃孵育60 min，85℃孵育5 min，冰浴5 min，合成的cDNA 于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。以cDNA 鏈作為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，20 μL 反應(yīng)體系：iTaqTMuniversal SYBR Green supermix（2×）10 μL，F(xiàn)orward and reverse primers 1.8 μ L，DNA template 1 μ L，加H2O 至20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，40 循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)后，72℃、5 min。將96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入熒光定量PCR 儀中，并在Bio-Rad CFX Manager 軟件上設(shè)定檢測(cè)。PCR 引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列Tab.1 Sequences of PCR primers

1.7 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖蛋白表達(dá)水平提取各組細(xì)胞總蛋白，采用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)樣品蛋白濃度，調(diào)節(jié)濃度為2 g·L－1，將蛋白樣品與2×樣品緩沖液按體積比1∶4 混合后，100℃水浴5 min；制備SDS-PAGE 凝膠，每孔加樣20 μL，280 mA 恒定電流轉(zhuǎn)膜60 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF 膜，采用TBST 洗滌3 次，每次5 min，之后將膜放入5%脫脂奶粉中，水平搖床，室溫下封閉2 h。封閉結(jié)束后，TBST 浸洗3 次，每次5 min，分別加入Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖一抗（1∶1 000）稀釋液，4℃儲(chǔ)存，過夜。加HRP標(biāo)記二抗（1∶2 000），水平搖床，室溫封閉2 h。加入ECL 發(fā)光顯色液后將膜正面朝上放到凝膠成像儀內(nèi)，記錄結(jié)果。對(duì)電泳條帶進(jìn)行灰度值掃描，對(duì)各目的蛋白進(jìn)行半定量分析。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組BMSCs 增殖率，細(xì)胞中BMP-4和Sox9 水平，不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率，細(xì)胞中Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖mRNA 及蛋白表達(dá)水平以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組BMSCs 增殖率與空白對(duì)照組比較，1.25 g·L－1VACTⅠ組大鼠BMSCs 增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），2.50～20.00 g·L－1VACT Ⅰ組大鼠BMSCs 增殖率明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），并呈時(shí)間劑量依賴性；與TGF-β3 組比較，2.50 g·L－1VACT Ⅰ組大鼠BMSCs 增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），故選用2.5 和5.0 g·L－1VACTⅠ組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表2。

2.2 各組BMSCs 上清液中BMP-4 和Sox9 水平與空白對(duì)照組比較，TGF-β3 組和不同濃度VACTⅠ組細(xì)胞上清液中BMP-4 和Sox9 水平明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見表3。

2.3 各組不同細(xì)胞周期BMSCs 百分率與空白對(duì)照組比較，TGF-β3 組和不同濃度VACTⅠ組不同細(xì)胞周期BMSCs 百分率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4 和圖1。

表2 各組BMSCs 增殖率Tab.2 Proliferation rates of BMSCs in various groups（n＝5,）

表2 各組BMSCs 增殖率Tab.2 Proliferation rates of BMSCs in various groups（n＝5,）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with blank control group.

表3 各組BMSCs 上清液中BMP-4 和Sox9 水平Tab.3 Levels of BMP-4 and Sox9 in cell supernatant of BMSCs in various groups [n＝5,,ρB/(ng·L－1）]

表3 各組BMSCs 上清液中BMP-4 和Sox9 水平Tab.3 Levels of BMP-4 and Sox9 in cell supernatant of BMSCs in various groups [n＝5,,ρB/(ng·L－1）]

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with blank control group.

2.4 各組細(xì)胞中Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖mRNA表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較，TGF-β3 組和不同濃度VACTⅠ組細(xì)胞中Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。見圖2和表5。

圖2 RT-PCR 法檢測(cè)各組細(xì)胞中Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖mRNA 表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of type Ⅱcollagen and aggrecan mRNA in cells in various groups detected by RT-PCR method

表4 各組不同細(xì)胞周期BMSCs 百分率Tab.4 Percentages of BMSCs in different cell cycles in various groups（n＝5,,η/%）

表4 各組不同細(xì)胞周期BMSCs 百分率Tab.4 Percentages of BMSCs in different cell cycles in various groups（n＝5,,η/%）

表5 各組細(xì)胞中Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖mRNA 表達(dá)水平Tab.5 Expression levels of type Ⅱcollagen and aggrecan mRNA in cells in various groups（n＝5,）

*P＜0.01 compared with blank control group.

2.5 各組細(xì)胞中Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較，TGF-β3 組和不同濃度VACTⅠ組細(xì)胞中Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見表6 和圖3。

表6 各組細(xì)胞中Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖蛋白表達(dá)水平Tab.6 Expression levels of collagen type Ⅱand aggrecan proteins in cells in various groups（n＝5,）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with blank control group.

3 討論

骨折是骨質(zhì)疏松最嚴(yán)重的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響老年人生活質(zhì)量，其愈合過程及機(jī)制不同于一般骨折，在手術(shù)治療的同時(shí)應(yīng)給予必要的抗骨質(zhì)疏松治療及促軟骨生成［8-9］。BMSCs 具有來源廣、多向分化潛能且應(yīng)用技術(shù)成熟等特點(diǎn)，是軟骨組織工程修復(fù)最理想的工具。通過誘導(dǎo)劑靶向誘導(dǎo)BMSCs 成軟骨分化是現(xiàn)代研究的熱點(diǎn)，目前常用的誘導(dǎo)劑包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）、地塞米松和TGF-β3等；此外巴戟天多糖、柚皮苷和淫羊藿苷等中藥提取物也具有誘導(dǎo)劑的潛質(zhì)［10-13］。鹿茸作為中藥傳統(tǒng)名貴藥材，具有壯腎陽(yáng)、益精血、強(qiáng)筋骨、調(diào)沖任和托瘡毒之功效，一直以來作為宮廷藥膳食材應(yīng)用歷史悠久［14］。研究［15］表明：膠原是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多的一類蛋白質(zhì)，具有很高的生物學(xué)活性，鹿茸中含有豐富的Ⅰ型膠原，已被證實(shí)對(duì)多種骨病具有治療作用。

本研究結(jié)果表明：2.5～20.0 g·L－1VACTⅠ對(duì)大鼠BMSCs 增殖率起到不同程度的抑制作用，且細(xì)胞增殖率與時(shí)間和劑量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。BMP-4在肥大軟骨細(xì)胞和成熟的骨細(xì)胞中廣泛表達(dá)，可以促進(jìn)軟骨組織早期形成，而Sox9 是軟骨發(fā)育形成中的重要轉(zhuǎn)錄因子，在軟骨的發(fā)育成熟等過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［16-17］。本研究中ELISA 法檢測(cè)結(jié)果表明：VACTⅠ誘導(dǎo)可促進(jìn)細(xì)胞釋放BMP-4和Sox9，VACTⅠ在抑制BMSCs 增殖的同時(shí)具有誘導(dǎo)其向軟骨細(xì)胞分化的潛質(zhì)。Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖蛋白是Sox9 調(diào)控的下游靶點(diǎn)蛋白，也是軟骨組織的特征性蛋白，二者表達(dá)增加是軟骨組織修復(fù)的標(biāo)志過程［18-20］。本研究中RT-PCR 法和Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果表明：VACTⅠ可上調(diào)BMSCs 中Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的表達(dá)水平，但誘導(dǎo)過程中各組細(xì)胞周期未發(fā)生明顯變化。

綜上所述，VACTⅠ可通過提高BMSCs 中Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖表達(dá)水平抑制其增殖，是一種潛在的成軟骨分化誘導(dǎo)劑。