楊澤斌,王明月,陳麗,劉寧,王浩,崔梅英,方楷漪,夏薇,關(guān)新剛

（北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院腫瘤靶向治療重點實驗室，吉林 吉林 132013）

阿霉素（doxorubicin，DOX），又稱多柔比星，是一種具有廣譜抗腫瘤活性的蒽環(huán)類抗生素，廣泛應(yīng)用于乳腺癌、胃癌、肝癌、宮頸癌、膽管癌和前列腺癌等實體瘤及多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療。盡管在多種腫瘤中顯現(xiàn)出良好的治療效果，但DOX 用藥過程中產(chǎn)生的心臟毒性及骨髓抑制等嚴(yán)重不良反應(yīng)限制了其在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用［1］。提高DOX 的靶向腫瘤輸送效率并降低對正常組織的不良反應(yīng)成為改善治療效果的關(guān)鍵。近年來，基于納米顆粒的藥物遞送系統(tǒng)引起了廣泛關(guān)注［2］，與游離小分子藥物比較，納米藥物遞送系統(tǒng)具有藥物代謝時間延長、肝腎組織吸收降低、高通透性和滯留（EPR）效應(yīng)［3-5］等優(yōu)勢。多項研究［6-8］顯示：利用細(xì)胞膜為原材料制備的納米囊泡具有極佳的生物相容性，可作為一種高效安全的藥物遞送系統(tǒng)用于抗腫瘤研究。細(xì)胞膜納米囊泡擔(dān)載紫杉醇（paclitaxel，PTX）用于惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療，與小分子PTX 比較，納米藥物能明顯延長藥物的體內(nèi)循環(huán)時間并減輕不良反應(yīng)［9］；此外，利用膜囊泡作為siRNA 遞送載體，能夠改善siRNA 在血液中的快速降解，明顯抑制c-Myc 基因表達(dá)［10］。本研究利用人胚腎細(xì)胞HEK293T 的細(xì)胞膜制備一種細(xì)胞膜納米囊泡（nanovesicle，NVs），通過電穿孔法將DOX 擔(dān)載于囊泡內(nèi)腔，得到新型阿霉素納米藥物NVs-DOX，探討納米藥物NVs-DOX 對黑色素瘤B16F10 細(xì)胞的內(nèi)吞作用及殺傷效應(yīng)，為開發(fā)高效低毒的新型抗癌藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器小鼠黑色素瘤B16F10 細(xì)胞、人胚胎腎細(xì)胞HEK293 和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3 由本實驗室保存。DOX、MTT、PMSF、DAPIT 和BCA 蛋白定量試劑盒購于碧云天生物技術(shù)公司，二甲基亞砜（DMSO）、DMEM 和胎牛血清（FBS）購于生工生物工程（上海）股份有限公司，活/死細(xì)胞活力檢測試劑盒購于凱基生物。納米粒度及Zeta 電位分析儀Microtrac Nanotrac Wave Ⅱ（美國麥奇克有限公司），LF10 脂質(zhì)體擠出儀（加拿大AVESTIN 公司），M200 多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN 公司），CUY21EDIT Ⅱ細(xì)胞電轉(zhuǎn)化儀（日本BEX 公司），紫外分光光度計（上海儀電INESA 有限公司），ACEA NovoCyte 序列流式細(xì)胞儀和倒置熒光顯微鏡（美國Lifte-Technologies 公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育，用含10%FBS 和1% 雙抗混合液（penicillinstreptomycin solution）的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞膜NVs制備將對數(shù)生長期的HEK293T 細(xì)胞進(jìn)行消化后，離心收集細(xì)胞沉淀用PBS 緩沖液洗滌3 次（1 500 r·min－1，5 min），使用HM 培養(yǎng)基（1 mmol·L－1EDTA、20 mmol·L－1Hepes-NaOH、pH7.4、1 mmol·L－1PMSF）進(jìn)行重懸，冰上使用勻漿器擠壓50 次，1 500 r·min－1離心10 min，收集上清超高速離心（35 000 r·min－1，2 h）收集沉淀，PBS 緩沖液重懸3 次后順序通過裝有1 μm 和0.4 μm 濾膜的擠出儀擠壓20 次，得到細(xì)胞膜NVs，利用BCA 蛋白定量試劑盒檢測囊泡中蛋白濃度，細(xì)胞膜NVs 濃度以蛋白濃度（mg·L－1）表示。使用Microtrac Nanotrac Wave Ⅱ檢測NVs的粒徑分布。

1.4 MTT 法分析NVs 的細(xì)胞相容性取對數(shù)生長期小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3，消化后接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后每孔加入終濃度分別為0、5、10、20、50 和100 mg·L－1（蛋白濃度）的NVs，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 后每孔加入20 μL MTT（5 g·L－1）溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄去孔中溶液，加入150 μL DMSO，震蕩1 min 后檢測490 nm 處吸光度（A）值并計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率＝NVs 組A 值/空白組A 值×100%。

1.5 納米藥物NVs-DOX 的制備利用電轉(zhuǎn)法將DOX 擔(dān)載于細(xì)胞膜內(nèi)腔：CUY21EDIT Ⅱ細(xì)胞電轉(zhuǎn)化儀電擊杯（內(nèi)徑尺寸為0.4cm）加入細(xì)胞膜NVs 與DOX（質(zhì)量比為2∶1），電轉(zhuǎn)條件為PPV：200 V，On：10 ms，Off：10 ms，PdV：25 V，On：50 ms，Off：50 ms，C：940 μF，Cycle：10。冰上孵育30 min，35 000 r·min－1超高速離心2 h 后將沉淀重懸于PBS 緩沖液，得到NVs-DOX；孵育方法裝載DOX，將細(xì)胞膜與DOX（質(zhì)量比2∶1）37℃孵育2 h，PBS 緩沖液洗滌3 次后重懸，利用DOX 在485 nm 吸光度（A）值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對上述2 種方法制備的納米藥物DOX 濃度進(jìn)行定量。使用Microtrac Nanotrac Wave Ⅱ測定NVs-DOX 的粒徑分布。

1.6 激光共聚焦成像檢測細(xì)胞中熒光分布將對數(shù)生長期的黑色素瘤B16F10 細(xì)胞消化后，接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育12 h 后，分別加入10 mg·L－1（DOX 濃度）的小分子DOX 或NVs-DOX，37℃孵育3 h 棄去孔中培養(yǎng)液，PBS 緩沖液清洗3 次后4%多聚甲醛37℃固定20 min，PBS 緩沖液清洗3 次后DAPI 室溫染色10 min，PBS 緩沖液清洗3 次后封片于熒光顯微鏡（Zeiss）下成像。采用Image J 軟件分析圖片熒光強(qiáng)度。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞中熒光強(qiáng)度將B16F10 細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1.8×105個細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h 后，分別加入10 mg·L－1（DOX 濃度）的小分子DOX 或NVs-DOX，37℃孵育3 h 后胰蛋白酶消化，1 500 r·min－1離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，PBS 緩沖液清洗3 次后加入500 μL PBS 緩沖液輕輕混勻重懸，采用流式細(xì)胞儀檢測并分析B16F10 細(xì)胞內(nèi)吞后的熒光強(qiáng)度。

1.8 MTT 法檢測NVs-DOX 作用后B16F10 細(xì)胞存活率取對數(shù)生長期的小鼠黑色素瘤B16F10 細(xì)胞，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1×104個細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h 后，實驗組每孔加入100 μL NVs-DOX，藥物終濃度分別為0.001、0.005、0.010、0.050、0.100、0.500 和1.000 μmol·L－1，對照組加入相同終濃度的游離DOX，每組設(shè)置5 個重復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。棄上清，加入20 μL MTT（5 g·L－1），37℃、5%CO2孵育4 h。棄上清，每孔加入150 μL DMSO，使用全波長多功能自動酶標(biāo)儀檢測490 nm 處A 值，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率＝藥物處理組A 值/空白對照組A 值×100%。

1.9 活/死細(xì)胞染色檢測NVs-DOX 對B16F10 細(xì)胞的毒性取對數(shù)生長期的黑色素瘤B16F10 細(xì)胞，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1×104個細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h 后，分別加入含有1 μmol·L－1DOX 的小分子DOX 及NVs-DOXs，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基后PBS緩沖液沖洗2 次，加入活/死細(xì)胞活力檢測試劑盒進(jìn)行染色，熒光顯微鏡成像，使用Image J 軟件分析數(shù)據(jù)。計算各組死細(xì)胞占總細(xì)胞比率。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析采用Graphpad Prism 5.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組細(xì)胞存活率、載藥效率、熒光強(qiáng)度和死細(xì)胞占總細(xì)胞比率經(jīng)正態(tài)分布檢驗均呈正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，2 組間樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞膜NVs 的制備通過超速離心法得到HEK293 細(xì)胞的細(xì)胞膜，脂質(zhì)體擠出儀處理后得到細(xì)胞膜NVs，動態(tài)光散射檢測結(jié)果顯示：NVs 平均粒徑為254.3 nm（圖1）。MTT 法檢測結(jié)果顯示：隨著NVs 濃度逐漸增加，NVs 不僅未顯示出細(xì)胞毒性，而且在一定程度上促進(jìn)了NIH3T3 細(xì)胞的增殖（細(xì)胞存活率＞120%）（表1），顯示出良好的生物相容性。

圖1 細(xì)胞膜NVs 的粒徑分布Fig.1 Size distribution of cell membrane NVs

表1 細(xì)胞膜NVs 與NIH3T3 細(xì)胞的生物相容性Tab.1 Biocompatibilities of cell membrane NVs and NIH3T3 cells(n＝5,，η/%)

表1 細(xì)胞膜NVs 與NIH3T3 細(xì)胞的生物相容性Tab.1 Biocompatibilities of cell membrane NVs and NIH3T3 cells(n＝5,，η/%)

2.2 納米藥物NVs-DOX 的制備動態(tài)光散射檢測結(jié)果顯示：裝載DOX 后的NVs 平均粒徑為289.6 nm（圖2），較空NVs 粒徑（254.3 nm）略大。電轉(zhuǎn)法DOX 擔(dān)載效率（24.91%±2.26%）高于孵育法（15.10%±0.73%，P＜0.05），與參考文獻(xiàn)［11］報道一致，因此在后續(xù)研究中均采用電轉(zhuǎn)法進(jìn)行藥物擔(dān)載。

圖2 納米藥物NVs-DOX 的粒徑分布Fig.2 Size distribution of NVs-DOX

2.3 激光共聚焦成像和流式細(xì)胞術(shù)檢測NVs-DOX 的腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞熒光成像檢測結(jié)果顯示：藥物孵育3 h 后小分子DOX 和納米藥物NVs-DOX均可以快速進(jìn)入胞內(nèi)，主要分布在細(xì)胞核中（圖3）；熒光定量分析顯示：小分子DOX 組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度（38.81±1.58）高于NVs-DOX 組（30.20±3.81）（P＜0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：小分子DOX 細(xì)胞內(nèi)吞效率（95.47%±1.32%）高于NVs-DOX組（91.07%±0.42%），與熒光成像結(jié)果一致，見圖4。

2.4 MTT 法和活死細(xì)胞染色法檢測NVs-DOX 對黑色素瘤B16F10 細(xì)胞的毒性MTT 法檢測結(jié)果顯示：隨著藥物濃度增加，小分子DOX 和NVs-DOX 處理的細(xì)胞存活率均逐漸降低；不同濃度NVs-DOX 組細(xì)胞存活率與相對應(yīng)濃度小分子DOX 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖5）?；?死細(xì)胞染色法檢測結(jié)果顯示：處理24 h 后小分子DOX 組與NVs-DOX 組死細(xì)胞占總細(xì)胞比率分別為（41.14±3.13）%和（43.38±5.41）%（圖6），2 組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

晚期黑色素瘤由于高侵襲性和強(qiáng)轉(zhuǎn)移性，其臨床治療仍是一個亟待解決的難題［12］。降低DOX 的嚴(yán)重不良反應(yīng)成為影響治療效果的關(guān)鍵問題［13］。近年來基于納米顆粒的藥物遞送系統(tǒng)取得了重要進(jìn)展，已開發(fā)出脂質(zhì)體納米粒、納米膠束、納米囊泡、金納米顆粒和介孔納米硅球等載藥體系用于靶向腫瘤遞送DOX 研究［14-19］。然而藥物載體在體內(nèi)的代謝去向及安全性仍是不容忽視的問題。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測NVs-DOX 的黑色素瘤B16F10 細(xì)胞內(nèi)吞Fig.4 Endocytosis of melanoma B16F10 cells of NVs-DOX detected by flow cytometry

圖5 MTT 法檢測各組黑色素瘤B16F10 細(xì)胞存活率Fig.5 Survival rates of melanoma B16F10 cells in various groups detected by MTT method

細(xì)胞膜來源的NVs 由于其獨特的材料特性在藥物輸送領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注［20］。研究［21］顯示：利用細(xì)胞膜制備的NVs 擔(dān)載姜黃素不僅能夠改善姜黃素藥物溶解度差的問題，還能延長姜黃素的體內(nèi)循環(huán)時間，取得了較游離藥物更好的治療效果。細(xì)胞膜NVs 作為藥物遞送載體可以降低肝腎組織對藥物的清除，從而降低藥物對正常組織的不良反應(yīng)［11，22-23］。由于胚胎腎細(xì)胞分化程度較低，基本不表達(dá)胞外配體所對應(yīng)的受體分子，因而具有較低的免疫原性，因此本研究采用人胚腎HEK293 細(xì)胞的細(xì)胞膜作為原材料制備NVs，利用其擔(dān)載并遞送DOX 用于抗黑色素瘤細(xì)胞的研究。本研究結(jié)果表明：NVs 與NIH3T3 細(xì)胞具有良好的生物相容性；短時間（3 h）內(nèi)納米藥物NVs-DOX 內(nèi)吞效率略低于小分子DOX，與其通過自由擴(kuò)散的方式快速入胞有關(guān)，納米藥物主要以內(nèi)吞方式進(jìn)入胞內(nèi)，速度較自由擴(kuò)散稍慢；但48 h 處理結(jié)果顯示：納米藥物NVs-DOX 具有與小分子DOX 相當(dāng)?shù)哪[瘤細(xì)胞毒性，提示納米藥物NVs-DOX 具有高效殺傷黑色素瘤B16F10 細(xì)胞的特性。

綜上所述，本研究成功制備了基于細(xì)胞膜NVs的納米藥物NVs-DOX，細(xì)胞膜NVs 在成纖維細(xì)胞上顯示出良好的生物相容性，納米藥物NVs-DOX可被黑色素瘤B16F10 細(xì)胞高效內(nèi)吞并展示出與小分子DOX 相當(dāng)?shù)哪[瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)。本研究為開發(fā)高效低毒的新型抗癌藥提供了新思路。