楊吉平,費琳,柴學(xué)軍,茍興春

（1.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所陜西省缺血性心血管疾病重點實驗室陜西省腦疾病防治重點實驗室，陜西 西安 710021；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院精神心理科，陜西 西安 710061）

小膠質(zhì)細(xì)胞是機體發(fā)育過程中存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的一類特異性免疫細(xì)胞，對顱腦內(nèi)多種疾病的病理變化具有重要的調(diào)節(jié)作用［1］。近年來，不同極化狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)炎癥中的功能變化逐漸被研究者所關(guān)注，促使小膠質(zhì)細(xì)胞向選擇性激活狀態(tài)（M2 phenotype）極化，抑制其向經(jīng)典激活狀態(tài)（M1 phenotype）極化，是治療腦創(chuàng)傷和腦缺血的一個潛在靶點［2-3］。存在于小膠質(zhì)細(xì)胞膜表面的Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是連接天然固有免疫和獲得性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵［4］，髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）是TLRs 下游接頭分子，也是TLRs 信號通路中的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，TLRs/MyD88 信號通路及其調(diào)控的基因表達產(chǎn)物在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用［5］。研究［6］表明：蛛網(wǎng)膜下腔出血后MyD88 的選擇性抑制劑ST2825 通過降低其下游信號核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）的激活，減輕炎性反應(yīng)，減弱促凋亡信號，從而對蛛網(wǎng)膜下腔出血后的腦損傷具有保護作用。本課題組前期研究［7］結(jié)果顯示：體外神經(jīng)元氧-糖剝離（oxygen-glucose deprivation，OGD）處理后可使MyD88 蛋白的表達水平明顯上調(diào)。然而，阻斷或抑制MyD88 對小膠質(zhì)細(xì)胞的極化狀態(tài)是否有影響尚未見報道。因此，本研究采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞建立體外炎癥模型，探討MyD88 抑制肽（MyD88 inhibitory peptide，MIP）能否對抗LPS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的極化狀態(tài)，為腦缺血和腦創(chuàng)傷等疾病的治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞為小鼠來源的小膠質(zhì)細(xì)胞株，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco 公司，噻唑藍（MTT）和LPS 購自美國Sigma 公司，兔抗小鼠誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗體購自英國Abcam 公司，山羊抗小鼠精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）抗體購自美國Santa Cruz 公司，抗小鼠β-actin 購自上海Beyotime 公司，MIP 和對照肽（control peptide，CP）購自美國Novus Biologicals 公司。Multiskan FC 酶標(biāo)儀購自美國Thermo 公司，超微量核酸分析儀購自杭州Allsheng 公司，7500 型實時熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司，Western blotting 成像采用上海Tanon 4600 全自動化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)。實驗中所用引物由西安擎科澤西生物科技有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和實驗分組將BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞用含10% FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)基于5% CO2、37℃條件下傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞調(diào)整成密度為每毫升2×105個細(xì)胞，接種到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)3～4 h。實驗分為對照組，LPS 組，低、中和高劑量MIP+LPS 組。MIP 和 CP 在使用前均用0.01 mol·L－1PBS 緩沖液（pH7.4）溶解成5 mmol·L－1的儲備液。待細(xì)胞貼壁后棄掉上清，對照組細(xì)胞每孔加DMEM 培養(yǎng)基100 μL，LPS 組細(xì)胞每孔加入80 μL DMEM 和10 μL CP，低、中和高劑量MIP＋LPS 組每孔加入80 μ L DMEM 和10 μL MIP（MIP 用DMEM 培養(yǎng)基依次稀釋至終濃度為25、50 和100 μmol·L－1），培養(yǎng)1 h 后，分別向LPS 組和不同劑量MIP+LPS 組各孔加入LPS 10 μL（LPS 用雙純水稀釋，工作濃度為1 mg·L－1），將96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于5% CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進行后續(xù)實驗。

1.3 細(xì)胞存活率測定BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，每孔中加入10 μL MTT 液（5 g·L－1），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入DMSO 150 μ L，震蕩 10～15 min，至藍紫色的甲臜顆粒完全溶解，于自動酶標(biāo)儀490 nm 處測定各孔吸光度（A）值，計算各組細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率＝（干預(yù)組A 值－空白孔A 值）/（對照組A 值－空白孔A 值）×100%?；罨实挠嬎惴椒楦鹘M細(xì)胞隨機拍3～5 個視野，形態(tài)學(xué)觀察“阿米巴狀”活化細(xì)胞占該視野總細(xì)胞數(shù)的百分比，采用Image J 軟件進行統(tǒng)計。

1.4 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測各組細(xì)胞因子mRNA 表達水平采用Trizol 法提取各孔細(xì)胞總RNA，按照TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟進行反轉(zhuǎn)錄cDNA，分裝保存，然后按組別分別加入反應(yīng)體系，反應(yīng)體系：2×SYBRⅡMix 5 μL，Rox 0.2 μL，引物（10 μmol·L－1）1 μL，cDNA 1 μL，RNase free dH2O 2.8 μL，每孔10 μ L，設(shè)3 個復(fù)孔。引物序列見表1。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共循環(huán)30 次；72℃延伸5 min。采用2－△△Ct法計算目的基因mRNA 表達水平，目標(biāo)基因mRNA 水平通過與同組GAPDH mRNA 水平標(biāo)準(zhǔn)化后進行組間比較。

1.5 Western blotting 法檢測各組細(xì)胞中iNOS 和Arg-1 蛋白的表達水平BV2 細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，棄掉上清，分別加入終濃度為1 mmol·L-1PMSF 的RIPA 裂解液100 μL，在冰上超聲裂解15 min，4℃、12 000 r·min-1離心20 min；將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，Bradford 法檢測蛋白水平。每孔取30 μg 總蛋白上樣，以SDS-PAGE 電泳分離蛋白質(zhì)，濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用5% 脫脂奶粉封閉1 h，TBST 漂洗，分別加入一抗：iNOS（1 ∶300）、Arg-1（1∶300）和β-actin（1∶3 000），4℃過夜，TBST 漂洗后，加入HRP 標(biāo)記的相應(yīng)種屬源的二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h。TBST 漂洗4 次，ECL 發(fā)光。采用Image J 軟件進行蛋白表達條帶灰度分析。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值／β-actin 條帶灰度值。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞存活率、4 種細(xì)胞因子mRNA 表達水平以及各組細(xì)胞中iNOS 和Arg-1 蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)對照組BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞胞體較小，以圓形或類圓形居多，突起較少；LPS 組細(xì)胞胞體明顯變大，突起增多，部分突起變粗變短，有時可見小棘，呈典型的“阿米巴狀”；不同劑量MIP+LPS 組BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞較LPS 組細(xì)胞突起變細(xì)變少，呈梭形，見圖1。采用Image J 軟件對活化的BV2 細(xì)胞進行統(tǒng)計，不同劑量MIP+LPS 組BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞的活化率較 LPS 組明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），見表2，且呈劑量依賴性，表明MIP 對LPS 激活BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞具有明顯抑制作用。

2.2 各組BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞存活率與對照組比較，LPS 組BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.01）；與LPS 組比較，不同劑量MIP +LPS 組BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞存活率明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01），且呈一定的劑量依賴性。見表2。

2.3 各組 BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中 IL-1 β、IL-18、IL-4 和IL-10 mRNA 表達水平與對照組比較，LPS 組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中M1型細(xì)胞因子IL-1β 和IL-18mRNA表達水平明顯升高（P＜0.01）。與LPS 組比較，不同劑量MIP＋LPS 組BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1β 和IL-18 mRNA 的表達水平明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），而M2 型細(xì)胞因子IL-4 和IL-10 mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01），且呈劑量依賴性。見表3。

表2 各組BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞活化率和存活率Tab.2 Activation rates and survival rates of BV2 microglial cells in various groups(n=8,,η/%)

表2 各組BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞活化率和存活率Tab.2 Activation rates and survival rates of BV2 microglial cells in various groups(n=8,,η/%)

*P＜0.01 compared with control group；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 compared with LPS group.

2.4 各組BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中iNOS 和Arg-1 蛋白表達水平與對照組比較，LPS 組BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中iNOS 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01），Arg-1 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01）；與LPS 組比較，不同劑量MIP＋LPS 組BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中iNOS 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），而Arg-1 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）。見圖2 和表4。

3 討論

圖2 各組BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中iNOS 和Arg-1 蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of iNOS and Arg-1 protein in BV2 microglial cells in various groups

BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞是源于小鼠腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄病毒v-raf/v-myc 轉(zhuǎn)染獲得的永生細(xì)胞，建立于1990 年，該細(xì)胞保留了小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、表型和多種功能［8］。由于原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞來源有限，細(xì)胞增殖分裂能力差，操作過程繁瑣，獲得的細(xì)胞數(shù)量較少，不能很好地適應(yīng)體外研究需要，因此一般采用BV2 細(xì)胞系替代小膠質(zhì)細(xì)胞進行體外實驗。LPS 是一種強力炎性反應(yīng)誘導(dǎo)劑，可通過激活BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建體外神經(jīng)炎癥模型［9］。本研究結(jié)果顯示：經(jīng)1 mg·L－1LPS 刺激后，BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞胞體明顯變大，突起變粗變短，呈典型的“阿米巴狀”，表明BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞在LPS 刺激下呈激活形態(tài)；MTT 法檢測結(jié)果顯示：LPS 組BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞存活率低于對照組，這與文獻報道［10-11］相一致。

近年來，不同極化狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)炎癥中的功能變化逐漸被研究者所重視，當(dāng)腦組織受到各種傷害性刺激（創(chuàng)傷、缺血和感染等）時，小膠質(zhì)細(xì)胞即從靜息態(tài)（M0）轉(zhuǎn)變?yōu)镸1 型或M2 型［12-13］，iNOS 是M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞表面主要的標(biāo)記物之一［14］。本研究結(jié)果顯示：BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)LPS 處理后iNOS 蛋白表達水平較對照組明顯升高，表明LPS 可使小膠質(zhì)細(xì)胞向M1 方向極化；RT-PCR 法檢測結(jié)果顯示：LPS 組BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1β 和IL-18 mRNA 表達水平較對照組明顯升高，提示LPS 可增加M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子。

表3 各組BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1β、IL-18、IL-4 和IL-10 mRNA 表達水平Tab.3 Expression levels of IL-1β,IL-18,IL-4 and IL-10 mRNA in BV2 microglial cells in various groups (n=8,)

表3 各組BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1β、IL-18、IL-4 和IL-10 mRNA 表達水平Tab.3 Expression levels of IL-1β,IL-18,IL-4 and IL-10 mRNA in BV2 microglial cells in various groups (n=8,)

*P＜0.01 compared with control group；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 compared with LPS group.

表4 各組BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中iNOS 和Arg-1 蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of iNOS and Arg-1 proteins in BV2 microglial cells in various groups(n＝8,)

表4 各組BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中iNOS 和Arg-1 蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of iNOS and Arg-1 proteins in BV2 microglial cells in various groups(n＝8,)

*P＜0.01 compared with control group；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 compared with LPS group.

MyD88 是TLRs 和IL-1 家族信號通路在胞內(nèi)的一個關(guān)鍵接頭蛋白，與多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［15-17］。研究［18］表明：MyD88 基因敲除可減少癲癇持續(xù)狀態(tài)后小鼠海馬中炎癥反應(yīng)，增加癲癇模型小鼠海馬CA1 區(qū)谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白-1 的表達，從而減少錐體神經(jīng)元凋亡。本研究應(yīng)用25、50 和100 μmol·L-1MIP 干預(yù)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞后結(jié)果顯示：不同劑量MIP+LPS 組活化細(xì)胞的數(shù)目較LPS 組明顯減少，細(xì)胞存活率較LPS 組明顯提高，且呈一定的劑量依賴性，表明MIP 對LPS 激活BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞具有一定的抑制作用。M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物包括Arg-1、CD163、CD206、CD209、Ym1、Fizzl 和甘露糖受體（mannose receptor，MR）等［19］。本研究結(jié)果顯示：與模型組比較，MIP 可劑量依賴性地上調(diào)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞體外炎癥模型Arg-1 蛋白的表達水平，表明通過抑制MyD88 信號通路可使小膠質(zhì)細(xì)胞向M2 方向極化，從而抑制炎癥反應(yīng)，促進組織修復(fù)。

M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞能產(chǎn)生腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-1、IL-6、IL-18 和IL-23 等促炎性細(xì)胞因子，以及多種趨化因子，促進炎癥和產(chǎn)生組織損傷，對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用［20］。M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞能分泌轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF β1）、IL-4 和IL-10 等抗炎性細(xì)胞因子，能夠抑制過度的炎性反應(yīng)，有利于清除壞死組織，促進組織修復(fù)和神經(jīng)元再生［21］。本研究結(jié)果顯示：LPS 組BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞M1 型細(xì)胞因子IL-1β 和IL-18 mRNA 表達水平較對照組明顯升高；與LPS 組比較，不同劑量MIP ＋LPS 組BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞M2 型細(xì)胞因子IL-4 和IL-10 mRNA 的表達水平明顯升高，且呈劑量依賴性，表明MIP 可抑制LPS 誘導(dǎo)的促炎因子釋放，劑量依賴性地增加抗炎細(xì)胞因子的分泌。

綜上所述，本研究利用MyD88 的選擇性抑制劑MIP 作用于LPS 誘導(dǎo)的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型，結(jié)果顯示：MIP 能有效抑制BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞向M1 型極化，促進其向M2 型表型轉(zhuǎn)化，抑制炎癥的過度激活。因此，通過阻斷或抑制MyD88 表達調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的極化表型，可作為一個潛在的腦卒中和腦創(chuàng)傷等治療策略。然而，MIP 促使小膠質(zhì)細(xì)胞向M2 型轉(zhuǎn)化的具體分子機制及其能否直接發(fā)揮神經(jīng)元保護作用還需進一步研究。