林以琳，李世洋，賴丹寧，黃鈺婕，胡嘉淼，張志剛，林少玲,※

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2. 肉食品安全生產(chǎn)技術(shù)國家重點試驗室，廈門 361000）

0 引 言

縊蟶又名黃蟶（Sinonovaculaconstricta），其質(zhì)地脆薄，生活在淺海的泥沙中。據(jù)2019 年中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒[1]表明，縊蟶是貝類養(yǎng)殖中的重要品種之一，至2018 年底，其養(yǎng)殖產(chǎn)量高達(dá)85.30 萬t?？O蟶肉味道鮮美，營養(yǎng)價值高，是低脂、低熱的海洋健康食品而深受消費者青睞。特別是鮮剝蟶肉的上市，因其方便處理且易于加工等特點而日益受到消費者追捧，成為縊蟶產(chǎn)業(yè)發(fā)展新亮點。但蟶肉中蛋白質(zhì)和含水率較高，肌肉中結(jié)締組織少，內(nèi)源性蛋白酶活躍[2-3]，新鮮縊蟶在貯藏過程中易受微生物污染，從而引起變色、變味而腐敗的現(xiàn)象，使其喪失營養(yǎng)及食用價值。因此，縊蟶保鮮成為國內(nèi)外研究人員關(guān)注的熱點。

目前，縊蟶的保鮮技術(shù)主要包括物理保鮮法、生物保鮮法等[4]。物理保鮮法中的低溫保鮮技術(shù)是在溫度低于0 ℃時，對食品進(jìn)行貯藏保鮮的方法。其主要優(yōu)點是時間短，對技術(shù)要求低，且能有效保持縊蟶新鮮度[5-6]。但低溫保鮮對于縊蟶的理化特性有較大影響。生物保鮮法是利用浸泡[7]、噴淋或涂抹[8]等方式，將具有抑菌或殺菌的天然物質(zhì)應(yīng)用于食品中，進(jìn)而達(dá)到防腐保鮮效果的方法。研究表明殼聚糖[9]、海藻酸鈉[10]、乳酸鏈球菌素（Nisin）[11]等生物保鮮劑對縊蟶肉具有保鮮作用，能延長縊蟶肉的貨架期。但生物保鮮劑的成本較高，在使用過程中存在不良的氣味[12]。

光動力減菌技術(shù)（Anti-microbial Photodynamic Technology，APDT）是通過光源、光敏劑及周圍氧環(huán)境共同作用的綠色、安全的非熱力滅菌手段。其作用原理是通過光敏劑的靶向性，即光敏劑可優(yōu)先聚集在有害物質(zhì)周圍，給予適當(dāng)波長的光照后，光敏劑可吸收光子能量，產(chǎn)生一些活性氧物質(zhì)；這些單線態(tài)氧、自由基通過氧化作用攻擊有害微生物，達(dá)到殺菌的目的[13-14]。因此，合適的光敏劑、孵育時間及光照時間是光動力減菌技術(shù)的核心要素，其對殺菌效果有一定的影響。目前，光動力減菌技術(shù)在食品領(lǐng)域已有相關(guān)報道，Allend 等[15]證實了由 UV-C 激發(fā)的光動力減菌技術(shù)能有效延長新鮮草莓的保質(zhì)期。此外，曹斌斌等[16]以姜黃素為光敏劑，對牡蠣進(jìn)行光動力減菌技術(shù)處理，結(jié)果表明，在LED 燈（波長范圍420～480 nm）下照射，姜黃素介導(dǎo)的光動力減菌技術(shù)能有效殺滅牡蠣中的有害微生物。

光敏劑是光動力減菌技術(shù)的核心要素。按其性質(zhì)可分為第一代光敏劑，如血卟啉；第二代光敏，如卟啉類衍生物 5-氨基乙酰丙酸；第三代光敏劑，如酞箐類。姜黃素（Curcumin）是一種天然的食品添加劑[17]，是世界衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO）和美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration, FDA）以及我國批準(zhǔn)使用的食品添加劑，具有低毒性、易代謝等特點。此外，姜黃素具有高靶向性及分子識別功能，是一種新型第三代光敏劑。大量研究表明，姜黃素具有抗炎和清除自由基等功效[18-19]；姜黃素已被證實具有多種生理活性，比如其在抗癌方面的藥理作用，有望應(yīng)用于新型抗癌、防癌藥物與保健食品的研發(fā)[20-21]。

本研究以菌落總數(shù)和滅活率為指標(biāo)，探究光動力減菌技術(shù)對縊蟶肉菌落總數(shù)的影響，并確定其較佳的姜黃素濃度、浸泡時間和光照時間。其次，結(jié)合感官指標(biāo)和色差、含水率、pH 值、硫代巴比妥酸、揮發(fā)性鹽基氮等理化指標(biāo)，比較在4 ℃貯藏條件下保存8 d 的縊蟶肉各指標(biāo)間差異，探究光動力減菌技術(shù)對縊蟶肉品質(zhì)特性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

縊蟶：從福州金山大潤發(fā)超市購買，挑選鮮活、完整，質(zhì)量均在25 g 左右的鮮活縊蟶，購買后將樣品置于鹽水中浸泡15 min。待縊蟶吐凈沙子，用水沖洗多次，直至水中無泥沙。

蟶肉的光動力處理：將開殼后鮮活的縊蟶浸泡在一定濃度的姜黃素溶液中，并給予波長為425 nm，光功率密度為172.8 J/cm2的藍(lán)光下進(jìn)行光照[22]。

1.2 主要儀器與設(shè)備

營養(yǎng)瓊脂，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；食品級姜黃素（純度≥95%），合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；全自動色差儀，北京辰泰克儀器技術(shù)有限公司；TA-XT2i 質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro Syestem 公司；SFY-20A 鹵素快速水分測定儀，深圳市冠亞電子科技有限公司；MTP-601F全自動熒光酶標(biāo)儀，天美（中國）科學(xué)儀器有限公司；LED通道控制電源，北京卓立漢光儀器有限公司。

姜黃素母液的配置：在黑暗條件下，精確量取食品級乙醇10 mL 加入0.1 g 姜黃素粉末充分混合，制得姜黃素母液。

1.2.1 單因素試驗

光敏劑濃度的選擇：在黑暗條件下，分別用 0、5、10、20、40、80μmol/L 的姜黃素溶液中浸泡縊蟶 20 min，并在室溫于LED 燈下光照20 min。

光敏劑浸泡時間的選擇：在黑暗條件下，用40μmol/L的姜黃素溶液分別浸泡 0、5、10、15、20、25 min，并在室溫于LED 燈下光照20 min。

光照時間選擇：在黑暗條件下，用40μmol/L 姜黃素溶液浸泡20 min 后，分別用LED 燈光照0、5、10、20、30、40 min。

1.2.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計

選取濃度、浸泡時間及光照時間 3 個因素作為考察變量，以菌落總數(shù)為響應(yīng)值優(yōu)化光動力減菌技術(shù)的工藝條件。通過Design-Expert 8.06 設(shè)計試驗并分析，如表1所示。

1.3 細(xì)菌菌落平板計數(shù)

參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定（GB 4789.2—2016）》中提供的方法進(jìn)行測定[23]。

式中N為空白對照組的菌落總數(shù)，lg(CFU/g)；n為光動力試驗組的菌落總數(shù)，lg(CFU/g)。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計Table 1 Response surface test design

1.4 感官評價

參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 鮮、凍動物性水產(chǎn)品（GB 2733—2015）》中對鮮、凍動物性水產(chǎn)品的感官要求進(jìn)行對縊蟶肉進(jìn)行感官評價[22]。首先，對光動力減菌技術(shù)處理前、后的蟶肉制定感官評價標(biāo)準(zhǔn)，如表2 所示。隨機(jī)選取 10 名曾參與過感官評價的人員對新鮮縊蟶的外觀、色澤、香氣、口感4 個感官指標(biāo)進(jìn)行評分，每個指標(biāo)為 25 分，總分為 100 分，以感官指標(biāo)總分作為最終結(jié)果。

表2 縊蟶感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard of razor clam

1.5 理化指標(biāo)的測定

含水率測定：按照《中華人民共和國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定（GB 5009.3—2016）》中的相關(guān)規(guī)定，用鹵素快速水分檢測儀測定光動力減菌技術(shù)作用前后蟶肉中的含水率[24]。

pH 值測定：根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH 值的測定（GB 5009.237—2016）》中的方法進(jìn)行光動力減菌技術(shù)作用前后的蟶肉的pH 值進(jìn)行測定[25]。

硫代巴比妥酸（Thiobarbituric Acid，TBA）測定：參照周嬌嬌等[26]的方法，利用雙抗體夾心法，結(jié)合試劑盒說明書，對光動力作用前后的蟶肉進(jìn)行檢測。

揮發(fā)性鹽基氮（Total Volatile Basic Nitrogen，TVBN）值的測定：用全自動凱氏定氮儀對光動力減菌技術(shù)作用前后的蟶肉進(jìn)行揮發(fā)性鹽基氮的測定。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗結(jié)果均測定3 次，表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用GraphPad Prism 6 軟件對單因素試驗進(jìn)行顯著性差異性分析，并繪制相關(guān)圖表；運用Design-Expert 8.06 進(jìn)行響應(yīng)面分析；顯著性差異水平選取P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 姜黃素濃度對縊蟶肉中菌落總數(shù)的影響

由圖1a 可知，隨姜黃素濃度的增加，光動力處理后縊蟶肉中菌落總數(shù)逐漸降低。當(dāng)姜黃素濃度為0 時，菌落總數(shù)為5.19 lg(CFU/g)，當(dāng)姜黃素濃度為40μmol/L時，縊蟶中的細(xì)菌下降了1.14 lg(CFU/g)；相較于未浸泡姜黃素的蟶肉，采用40μmol/L 的姜黃素進(jìn)行光動力減菌處理后的縊蟶中的細(xì)菌的抑菌效果顯著（P<0.05），可滅活蟶肉中94.10%的細(xì)菌。因此，40μmol/L姜黃素浸泡20 min 結(jié)合20 min 光照能夠有效抑制細(xì)菌生長。

2.1.2 浸泡時間對縊蟶肉中菌落總數(shù)的影響

由圖1 b 可知，隨浸泡時間增加，縊蟶中的菌落總數(shù)逐漸降低。當(dāng)浸泡20 min 后，菌落總數(shù)降低了1.54 lg(CFU/g)；相較于未浸泡姜黃素的蟶肉，采用40μmol/L 的姜黃素浸泡20 min 可滅活97.11%的細(xì)菌。結(jié)果表明，40μmol/L 姜黃素浸泡20 min 結(jié)合20 min 光照，能夠有效抑制細(xì)菌生長。

2.1.3 光照時間對縊蟶肉中菌落總數(shù)的影響

由圖 1 c 可知，40μmol/L 姜黃素浸泡 20 min 條件下，隨著光照時間的增加，縊蟶中的菌落總數(shù)逐漸減少。當(dāng)無光照時，蟶肉中的菌落總數(shù)為5.43 lg(CFU/g)；當(dāng)給與30 min 光照，蟶肉中細(xì)菌量下降了2.82 lg(CFU/g)，可滅活99.90%的細(xì)菌。結(jié)果表明，40μmol/L姜黃素浸泡20 min結(jié)合30 min 光照，其滅菌效果較好。

圖1 單因素試驗縊蟶的抑菌效果Fig.1 Single factor test on antibacterial activity of razor clam

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

通過 Box-Behnken 試驗設(shè)計，以姜黃素濃度、姜黃素浸泡時間和LED 燈光照時間為試驗因素，菌落總數(shù)為響應(yīng)值所得擬合回歸方程：Y= 3.15 - 0.068A- 0.15B+0.059C- 0.25AB+ 0.13AC+ 0.48BC+ 0.070A2- 0.40B2-0.15C2，Y為菌落總數(shù)（lg(CFU/g)），A為姜黃素濃度，B為浸泡時間，C光照時間，如表3 所示。ANOVA 方差分析如表4 所示，結(jié)果表明P< 0.000 1，該回歸模型極顯著。此外，R2= 0.9821，表明決定系數(shù)可解釋98.21%的響應(yīng)值變化。因此，該模型可以較好的對光動力減菌技術(shù)后的菌落總數(shù)進(jìn)行預(yù)測及分析。

同時根據(jù)所得到的擬合回歸方程可發(fā)現(xiàn)，其中的一次項B，交互項AB和BC以及二次項B2和A2均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）；此外，一次項A，交互項AC達(dá)到差異性顯著水平（P<0.05）。由表4 中的F值可判斷三因素對縊蟶的菌落總數(shù)的影響大小為：B（浸泡時間）、A（姜黃素濃度）、C（光照時間）。該結(jié)果提示浸泡時間對殺菌效果具有較大的影響，長時間的浸泡有利于姜黃素在蟶肉內(nèi)細(xì)菌中富集，更有效發(fā)揮姜黃素的作用。同時，姜黃素濃度也有顯著的影響。但響應(yīng)面優(yōu)化時間范圍內(nèi)（20～40 min）光照時間的作用不顯著，提示20 min光照即可達(dá)到較好的滅活效果。

表3 響應(yīng)面設(shè)計和結(jié)果Table 3 Experimental design and results of response surface analysis

表4 回歸模型和方差分析Table 4 ANOVA for response surface quadratic model

通過回歸模型對最優(yōu)保鮮工藝進(jìn)行預(yù)測分析，得到響應(yīng)值Y最大值時的各因素值為A=0.33、B=0.97、C=-0.95，對應(yīng)各因素的數(shù)值為：26.6μmol/L 姜黃素、浸泡時間24.8 min，LED 藍(lán)光光照時間20.5 min。在此條件下，預(yù)測姜黃素介導(dǎo)的光動力殺菌技術(shù)作用后，蟶肉中的細(xì)菌數(shù)量為1.862 lg(CFU/g)可滅活蟶肉中99.99%的細(xì)菌。為驗證該模型的可靠性，根據(jù)預(yù)測條件進(jìn)行 3 次平行試驗，結(jié)果表明縊蟶中的細(xì)菌數(shù)量為1.743 lg(CFU/g)，說明此模型優(yōu)化所得結(jié)果可靠。

2.3 光動力減菌技術(shù)對縊蟶感官評價的影響

新鮮購買的縊蟶口感好，肉質(zhì)白嫩、緊密，有彈性，呈新鮮海腥味。由圖 2 可知，隨貯藏時間的延長，空白組縊蟶的評分逐漸下降，當(dāng)貯藏4 d 時，空白組蟶肉的感官總分為76 分，低于80 分，達(dá)到不可食用狀態(tài)，這可能是由于縊蟶肉中存在的微生物侵入行為，導(dǎo)致縊蟶肌肉組織松軟、分解肌肉組織中的蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，導(dǎo)致縊蟶出現(xiàn)腐敗變質(zhì)的現(xiàn)象。而光動力組蟶肉的感官總分為87 分，仍表現(xiàn)良好的新鮮水產(chǎn)品狀態(tài)。在4 ℃下貯藏第 8 天時，空白組蟶肉已腐爛，且出現(xiàn)黑斑、嚴(yán)重的腥臭味，而光動力組蟶肉的外觀也開始變黑，出現(xiàn)酸臭味，達(dá)到不可食用狀態(tài)。因此，選用 8 天內(nèi)不同處理方式下的蟶肉進(jìn)行理化指標(biāo)的檢測。

2.4 光動力減菌技術(shù)對縊蟶含水率和pH 值的影響

由圖3 可知，隨著貯藏時間的增加，縊蟶的含水率逐漸降低。在貯藏2 d 后，光動力組中縊蟶的含水率降低5.02個百分點，而空白組中縊蟶的含水率降低了10.90 個百分點。當(dāng)貯藏至第8 天，空白組中縊蟶的含水率相較于光動力組降低了13.85 個百分點。這可能是隨著貯藏天數(shù)增加，蟶肉出現(xiàn)細(xì)胞破裂、細(xì)胞液流失等現(xiàn)象；然而，光動力組的縊蟶含水率下降較慢，這可能是光動力作用維持了蟶肉體內(nèi)的蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，保持了蟶肉的肌肉組織[17]。因此，光動力減菌技術(shù)能夠有效的減緩縊蟶水分的流失。

圖2 光動力減菌技術(shù)對縊蟶的感官評價總分Fig.2 Effects of APDT on the total score of sensory evaluation of razor clam

圖3 光動力減菌技術(shù)對縊蟶含水率的影響Fig.3 Effects of APDT on water content of razor clam

從表5 可以看出，空白組縊蟶的pH 值隨著貯藏天數(shù)的增加而升高，這可能是由于蟶肉自身內(nèi)源酶及細(xì)菌的升高，導(dǎo)致其體內(nèi)蛋白質(zhì)被分解為氨和胺類物質(zhì)，進(jìn)而使蟶肉的pH 值升高[27]。此外，相較于4 d 內(nèi)蟶肉的pH值，在貯藏4 d 后的蟶肉pH 值的變化程度加快。光動力組蟶肉的pH 值與空白組相比，升高速度較為平緩。因此，光動力減菌技術(shù)能夠抑制縊蟶在貯藏過程中的腐敗速率，能較好保持蟶肉的新鮮程度。

表5 光動力減菌技術(shù)對縊蟶pH 值的影響Table 5 Effects of (APDT) Anti-microbial Photodynamic Technology on pH value of razor clam

2.5 光動力減菌技術(shù)對縊蟶硫代巴比妥酸和揮發(fā)性鹽基氮的影響

如圖4 所示，硫代巴比妥酸（Thiobarbituric Acid，TBA）是用于評價脂肪氧化的指標(biāo)之一，其主要原理[27-28]為顯色反應(yīng)，即 TBA 能與脂肪中的分解產(chǎn)物結(jié)合，加入丙二醛生成藍(lán)色化合物，最終轉(zhuǎn)化為黃色化合物。隨儲藏時間的增加，空白組和光動力組的 TBA 值逐漸升高，光動力組與空白組相比存在顯著差異（P<0.05）。從圖中可知，2 d內(nèi)，空白組中蟶肉的 TBA 值從 0.093μmol/L 升高至0.257μmol/L，光動力組中蟶肉的 TBA 值從 0.093μmol/L升高至0.195μmol/L；第2 天后，其上升速度均出現(xiàn)減緩現(xiàn)象，且光動力組的 TBA 值均低于空白組。這可能與姜黃素和 LED 光照時間有關(guān)；同時姜黃素具有抗氧化性，短時間的藍(lán)光照射減弱了脂質(zhì)的過度氧化[29]。

圖4 光動力減菌技術(shù)對縊蟶硫代巴比妥酸的影響Fig.4 Effects of APDT on Thiobarbituric Acid (TBA)value of razor clam

當(dāng)縊蟶出現(xiàn)品質(zhì)下降時，其體內(nèi)微生物和內(nèi)源酶的作用會引起含氮化合物的降解，如三甲胺、二甲胺等這類含氮物質(zhì)即總揮發(fā)性鹽基氮。研究表明，當(dāng)水產(chǎn)食品的TVBN 值超過25 mg/100g，則不可食用[30]。由圖5 所示，在貯藏過程中蟶肉的TVBN 值總體呈上升趨勢。4 d內(nèi)空白組與光動力組中蟶肉的 TVBN 值均未超過25 mg/100g；但空白組在第 6 天的 TVBN 值已經(jīng)達(dá)到25 mg/100g，光動力組在第 8 天的 TVBN 值超25 mg/100g。因此，光動力減菌技術(shù)可在一定程度上減緩縊蟶中蛋白質(zhì)的腐敗。

圖5 光動力減菌技術(shù)對縊蟶揮發(fā)性鹽基氮的影響Fig.5 Effects of APDT on total volatile basic nitrogen of razor clam

3 結(jié) 論

通過探究不同姜黃素濃度、姜黃素浸泡時間和不同光照時間條件的光動力技術(shù)對縊蟶菌落總數(shù)的影響，確定較佳抑菌參數(shù)，并在優(yōu)化條件下評價蟶肉的感官、含水率、pH 值、硫代巴比妥酸和揮發(fā)性鹽基氮等指標(biāo)。結(jié)果表明，影響光動力滅活縊蟶中的微生物的顯著性順序為浸泡時間、姜黃素濃度、光照時間。姜黃素介導(dǎo)的光動力減菌技術(shù)對縊蟶的優(yōu)化保鮮工藝條件：26.6μmol/L姜黃素濃度、浸泡時間 24.8 min，LED 藍(lán)光光照時間20.5 min，在此條件下可滅活蟶肉中99.99%的細(xì)菌。光動力減菌技術(shù)保持了蟶肉的感官品質(zhì)，又能最大程度保留其營養(yǎng)成分，有效延長了縊蟶的保質(zhì)期至6 d。同時，光動力減菌技術(shù)更好保持了蟶肉的水分，有效減緩了蟶肉的腐敗。