陳雪娟， 安方玉， 顏春魯， 劉雪松， 鄧 婕， 趙崇博， 王國(guó)文

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 蘭州 730000； 2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 教學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心， 蘭州 730000； 3. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院， 蘭州 730000； 4. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院， 蘭州 730000)

圍絕經(jīng)期綜合征是因中老年婦女的卵巢功能衰退或喪失而引起激素代謝紊亂，從而出現(xiàn)一系列潮熱、盜汗、眩暈、耳鳴等臨床癥狀的一種綜合征。臨床以激素替代療法為本病的主要治療手段[1]，但長(zhǎng)期的激素治療會(huì)增加患者患心腦血管疾病和各類婦科類癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。如何降低激素替代治療的副作用和提高圍絕經(jīng)期綜合征的療效是目前關(guān)注的焦點(diǎn)。

傳統(tǒng)中藥以低毒、安全、高效的優(yōu)勢(shì)，在圍絕經(jīng)期綜合征的治療中備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，中藥復(fù)方或單體在治療圍絕經(jīng)期綜合征方面的確有效，但具體治療機(jī)制仍處于探索階段。為此，本研究通過觀察玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征模型大鼠血清雌激素含量變化、子宮組織雌激素受體的表達(dá)變化和子宮組織病理形態(tài)學(xué)變化的影響，初步探討其對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征大鼠體內(nèi)激素變化的調(diào)控機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)6周齡雌性Wistar大鼠，體重180～220 g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物飼養(yǎng)室提供，合格證號(hào) SCXK(甘)2011-0007。所有大鼠自由飲水、攝食1周，本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物符合倫理委員會(huì)規(guī)定。

1.1.2 試劑

大鼠雌二醇(E2)ELISA檢測(cè)試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)201708)；Trizol Reagent 試劑(美國(guó)，批號(hào) 47123)；GoScript TM Reverse Transcription System 試劑盒和 GoTaq qPCR Master Mix 試劑盒(Promega，批號(hào)分別為0000073135和0000121531)；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，規(guī)格1 mg/片，批號(hào)156A)，Rat ERα Polyclonal Antibody(Immuno way公司，Catalog No：YT1634)和Rat ERβ Polyclonal Antibody(Immunoway公司，Catalog No：YT1637)。

1.2 方法

1.2.1 藥物給藥劑量

玫瑰紅芪當(dāng)歸(分別產(chǎn)自甘肅苦水、隴西和岷縣)水煎劑由玫瑰6 g，紅芪15 g，當(dāng)歸10 g組成(中藥的劑量依據(jù)2010版《中國(guó)藥典》)，均購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心夏鵬飛老師鑒定。具體換算方法參考文獻(xiàn)[6]，玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑人用劑量是31 g/d，換算成標(biāo)準(zhǔn)體重大鼠的劑量為：31×0.018=0.558 g/鼠，按照大鼠的標(biāo)準(zhǔn)體重為200 g，得出大鼠的劑量為0.558 g×5≈2.8 g/kg，以此計(jì)算所得劑量作為干預(yù)的中劑量，即玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑低、中、高劑量分別為1.4、2.8和5.6 g/kg。戊酸雌二醇片的給藥劑量為0.09 mg/kg。

1.2.2 圍絕經(jīng)期綜合征大鼠模型的建立

將70只Wistar雌性大鼠隨機(jī)分為正常組(15只)和卵巢切除組 (55只)，參照文獻(xiàn)[7-8]，采用手術(shù)切除法切除卵巢切除組大鼠的雙側(cè)卵巢。每只大鼠分別以 10% 水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后，俯臥位下無(wú)菌切除其雙側(cè)卵巢，正常組大鼠僅切除卵巢周圍約卵巢大小的脂肪組織，不切除卵巢。造模后第7天正常組和卵巢切除組各取5只大鼠，用ELISA法檢測(cè)兩組大鼠的血清雌二醇 (estradiol，E2)含量以判定造模是否成功。

1.2.3 分組與給藥

根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]，于術(shù)后第2周根據(jù)體重隨機(jī)將卵巢切除組的大鼠分為卵巢切除組、玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑低、中、高劑量組(1.4、2.8和5.6 g/kg)和戊酸雌二醇片組(陽(yáng)性對(duì)照組，0.09 mg/kg)，每組10只。各干預(yù)組的給藥體積均為10 mL/kg，灌胃給藥，正常組和卵巢切除組給予等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)6周。末次給藥后，稱量各組動(dòng)物體重后，股動(dòng)脈采血處死各組動(dòng)物，制備血清，同時(shí)開腹摘取各組動(dòng)物的雙側(cè)子宮，并將子宮周圍附著的脂肪組織剝離干凈備用。

1.2.4 動(dòng)物體重及子宮系數(shù)測(cè)定

稱取各組動(dòng)物的體重及子宮濕重，計(jì)算子宮系數(shù)。子宮系數(shù)(mg/g)=子宮質(zhì)量(mg)/體重(g)

1.2.5 血清E2含量的測(cè)定

ELISA法測(cè)定各組動(dòng)物的E2含量。將制備好的血清作為待測(cè)樣品，分別設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔，空白孔不加任何物質(zhì)，標(biāo)準(zhǔn)孔加入各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，待測(cè)樣品孔加入血清，37 ℃孵育30 min，棄去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去孔內(nèi)液體，重復(fù)5次，除空白孔外，每孔加入50 μL的酶，37 ℃孵育30 min，洗滌后加入終止液50 μL，450 nm處測(cè)定各管的吸光度值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過回歸方程計(jì)算血清E2的含量。

1.2.6 子宮組織的病理學(xué)切片檢測(cè)

將上述稱量后的子宮每組取6個(gè)用4%多聚甲醛固定，將固定好的組織送蘭州軍區(qū)總醫(yī)院病理科，采用石蠟包埋法制作蠟塊，并用切片機(jī)切片，切片厚度約5 μm，HE 染色，封片、鏡檢。

1.2.7 子宮組織ERα和ERβ基因表達(dá)的測(cè)定

提取子宮組織RNA，Q5000核酸微量測(cè)定儀測(cè)定其260 nm處的含量和260/ 280的比值。取2.5 μg的RNA樣品反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一鏈。大鼠ERα、ERβ的引物序列合成由TakaRa公司完成。ERα上游引物：5′-CACTCGATC ATTCGAGCACATTC-3′，下游引 物： 5′-AAGGGTCATGGTCATGGTCAG-3′；ERβ上游引物：5′- GTACCATAGACAAGAACCGGCGTAA -3′，ERβ下游引物：5′-TCCGCACTATACGGTACCCACA-3′；以GAPDH為內(nèi)參，上游引物： 5′-TGA AGGTCGCTGTCAACGGA-3′，下游引物：5′-GATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′。實(shí)時(shí)熒光定量PCR中所用的材料包括cDNA、上下游引物、SYBR混合液、Rox染料和水；PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下： 95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s， 58 ℃退火45 s，60 ℃延伸 1 min，共 45 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品各重復(fù) 3 次，數(shù)據(jù)經(jīng) 2-ΔΔCt處理后進(jìn)行ERα和ERβ基因相對(duì)表達(dá)量分析。

1.2.8 子宮組織ERα和ERβ蛋白表達(dá)的測(cè)定

根據(jù)ERα和ERβ的抗體說(shuō)明書確定ERα和ERβ的濃度分別為1∶400和1∶100，同時(shí)用PBS 緩沖液代替一抗設(shè)立陰性對(duì)照，染色步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。免疫組化數(shù)據(jù)分析采用軟件Image proplus 6.0對(duì)各組染色結(jié)果進(jìn)行分析，每組取6張切片，每張切片取5個(gè)視野，最后取其平均值作為該切片的OD值。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑對(duì)大鼠體重及子宮系數(shù)的影響

由表1可知，與正常組相比，卵巢切除組大鼠的體重明顯升高，子宮系數(shù)明顯下降(P<0.05)；與卵巢切除組相比，玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑中、高劑量組和戊酸雌二醇片組大鼠體重明顯降低，子宮系數(shù)明顯增加(P<0.05)。

表 1 對(duì)各組大鼠體重及子宮系數(shù)測(cè)定結(jié)果的影響

2.2 玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑對(duì)大鼠血清E2含量的影響

與正常組相比，卵巢切除組大鼠的血清E2含量明顯降低(P<0.05)；與卵巢切除組相比，玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑各給藥組和戊酸雌二醇片組大鼠的血清E2含量明顯增加(P<0.05)。具體結(jié)果見表2。

表2 對(duì)各組大鼠血清E2含量測(cè)定結(jié)果的影響

2.3 玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑對(duì)大鼠子宮組織病理形態(tài)變化的影響

從圖1可以看出，正常組大鼠子宮管徑較粗，內(nèi)膜深厚，腺體豐富，單層柱狀上皮細(xì)胞排列整齊；卵巢切除組、玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑低、中劑量組大鼠子宮壁明顯變薄，管腔狹窄，黏膜層腺體消失，固有層細(xì)胞密集，柱狀上皮細(xì)胞排列紊亂；玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑高劑量組大鼠子宮壁變薄，管腔狹窄，黏膜層出現(xiàn)腺體，單層柱狀上皮細(xì)胞排列整齊；戊酸雌二醇組大鼠子宮壁變薄，管腔狹窄，單層柱狀上皮細(xì)胞排列整齊。

2.4 玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑對(duì)大鼠子宮組織ERα和ERβ基因表達(dá)的影響

由表3可知，與正常組相比，卵巢切除組大鼠子宮組織的ERα和ERβ基因表達(dá)均明顯降低(P<0.05)；與卵巢切除組相比，玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑中、高劑量組和戊酸雌二醇片組大鼠宮組織的ERα和ERβ基因表達(dá)均明顯增加(P<0.05)。

子宮由肌層和子宮內(nèi)膜構(gòu)成；子宮內(nèi)膜從外向內(nèi)依次為上皮、腺體和基質(zhì)層構(gòu)成，可以形成腔管狀結(jié)構(gòu)；子宮的各層結(jié)構(gòu)見圖片中的箭頭所示

ERα和ERβ的熔點(diǎn)曲線、擴(kuò)增曲線結(jié)果，見圖2和圖3。

表3 各組大鼠子宮組織的ERα和ERβ基因表達(dá)情況

圖2ERα和ERβ的熔點(diǎn)曲線

Figure 2 Melting point curve ofERαandERβ

圖 3 ERα和ERβ的擴(kuò)增曲線

2.5 玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑對(duì)大鼠子宮組織ERα和ERβ蛋白表達(dá)的影響

ERα在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞 、腔上皮 、腺上皮和子宮肌層中均有表達(dá)。與正常組比較，卵巢切除組大鼠子宮腔上皮及基質(zhì)中ERα的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；與卵巢切除組比較，玫瑰紅芪當(dāng)歸各劑量組均能上調(diào)子宮中的雌激素受體 ERα蛋白的表達(dá)，其中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。具體結(jié)果見表4和圖4。

表4 各組大鼠子宮組織ERα和ERβ的蛋白表達(dá)情況

圖4ERα在各組大鼠子宮組織中的表達(dá)情況(免疫組化，200×)

Figure 4 Expression of ERαin uterine tissue in each group(IHC，200×)

由表4和圖5可知，子宮中ERβ呈弱表達(dá)，主要表達(dá)在子宮腔上皮中、子宮腺體及基質(zhì)中。與正常組比較，卵巢切除組大鼠子宮腔上皮及基質(zhì)中ERβ表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；與卵巢切除組比較，玫瑰紅芪當(dāng)歸各劑量組和戊酸雌二醇片組大鼠子宮腔上皮及基質(zhì)中 ERβ的表達(dá)水平均顯著升高，其中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑主要由玫瑰、紅芪和當(dāng)歸組成，方中玫瑰具有疏肝、理氣、活血等作用，紅芪有固表止汗、補(bǔ)氣利尿、托毒斂瘡等作用，當(dāng)歸有補(bǔ)血活血、養(yǎng)血滋補(bǔ)和調(diào)經(jīng)止痛等作用。根據(jù)玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑功效推測(cè)其能夠治療圍絕經(jīng)期綜合征。

圖5 ERβ在各組大鼠子宮組織中的表達(dá)情況(免疫組化， 200×)

本實(shí)驗(yàn)采用去卵巢法制備圍絕經(jīng)期大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵巢切除模型組子宮壁明顯變薄，管腔狹窄，黏膜層腺體消失，固有層細(xì)胞密集，柱狀上皮細(xì)胞排列紊亂等病理改變；血清E2的含量、子宮組織ERα和ERβ的表達(dá)和子宮系數(shù)明顯降低。給予玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑干預(yù)后，可升高卵巢切除模型組大鼠血清 E2的含量和子宮組織ERα和ERβ的表達(dá)，增加其子宮系數(shù)，改善其子宮病理形態(tài)改變，說(shuō)明玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑具有雌激素樣作用。雌激素主要通過與ERα或ERβ結(jié)合，進(jìn)一步結(jié)合雌激素反應(yīng)元件(Estrogen reflect element，ERE)， 通過AP-1 通路調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[12]。ERα的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞增殖，是雌激素發(fā)揮作用的關(guān)鍵。敲除小鼠的ERα基因研究發(fā)現(xiàn)[13]，雌二醇對(duì)小鼠的子宮增重作用消失，說(shuō)明雌二醇通過 ERα起到子宮增重作用。敲除ERα和ERβ的小鼠實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)[14]，其子宮直徑更為狹窄、子宮壁更薄、子宮萎縮程度也更為嚴(yán)重。另有研究證實(shí)[15]，活化的ERα能夠增加乳腺癌或子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而活化的ERβ則可以抗細(xì)胞增殖，說(shuō)明ERβ在ERα缺失時(shí)可直接作用于子宮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖[16]，從而發(fā)揮療效的同時(shí)，還能避免雌激素產(chǎn)生的副作用。也有研究發(fā)現(xiàn)，植物性雌激素主要結(jié)合于β受體，與β受體的親和力是 α 受體的7～30 倍[17]，相關(guān)中藥可選擇性上調(diào)去卵巢大鼠子宮ERα和 ERβ的表達(dá)[5]。因此推斷，玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑可能通過上調(diào)去卵巢大鼠子宮腔上皮和基質(zhì)中的ERα和 ERβ增加子宮系數(shù)和子宮腺體數(shù)量，從而改善子宮組織的病理形態(tài)改變，從而發(fā)揮治療圍絕經(jīng)期綜合征的作用，其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。