任曉英, 劉春燕, 侯東敏, 朱萬龍

(1. 云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動植物生態(tài)適應(yīng)進(jìn)化及保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 昆明 650500； 2. 生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心, 昆明 650500； 3. 云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 昆明 650500； 4. 中國科學(xué)院 昆明動物研究所， 昆明 650223)

表型可塑性是動物對生態(tài)環(huán)境和生理狀態(tài)變化的反應(yīng)[1]。食物在動物種群調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，許多嚙齒類動物應(yīng)對食物短缺時會采取一些適應(yīng)策略，如休眠、囤積食物或增加覓食活動[2]。不同嚙齒類動物在維持食物短缺的適應(yīng)可能是不同的，如限食使長爪沙鼠體重降低且動用體脂[3]。然而，限食條件下小鼠通過減少靜止代謝率和活動支出的能量來防止體重下降，而不是通過動用體脂[4]。瘦素作為脂肪細(xì)胞分泌的信號分子，可作用于下丘腦調(diào)節(jié)動物的食欲[5]。研究表明禁食會導(dǎo)致大鼠瘦素水平下降，重喂食后又可以恢復(fù)[6-7]。瘦素可以作用于下丘腦影響攝食神經(jīng)肽Neuropeptide Y(NPY)、Agouti related peptide(AgRP)、Pro-opiomelanocortin(POMC)、Cocaine and amphetamine regulated transcript Peptide(CART)等的表達(dá)與合成，從而控制動物的食欲和能量消耗[8-10]。瘦素濃度的增加會抑制NPY/AgRP合成代謝通路，刺激POMC分解代謝通路，導(dǎo)致動物攝食量減少[11]。食物限食會導(dǎo)致瘦素濃度降低，NPY的表達(dá)量增加[12]。長期饑餓也會使大鼠下丘腦NPY的含量增加[13]，而限食后重喂食會引起血清瘦素濃度升高，下丘腦NPY基因表達(dá)下降[14]。食物限制還會使動物AgRP含量顯著增加，POMC和CART含量顯著降低[15-16]。此外，禁食也使大鼠和小鼠CART表達(dá)下降[17-18]。

當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化時，動物通常會改變它們的活動模式。研究表明在食物短缺時，西伯利亞倉鼠覓食和囤積食物行為顯著增加，限食使大鼠及其他嚙齒類動物的輪跑活動增加[19]。此外有研究證明，限食Mesenchyme forkhead 1(MF1)小鼠活動性和能量支出增加，導(dǎo)致體重和體脂下降[20]，限食也會使自由輪轉(zhuǎn)條件下大鼠活動行為顯著增加[21]。相反，限食大鼠在24 h內(nèi)休息行為增加，其活動行為降低[22]。

橫斷山區(qū)位于中國西南部，生態(tài)系統(tǒng)復(fù)雜多樣。大絨鼠(Eothenomysmiletus)為中國特有種，是橫斷山區(qū)的典型代表和固有類群[23-25]。該地區(qū)干濕季節(jié)分明，冬天無冰雪覆蓋，故食物資源相對豐富。本課題組先前對橫斷山不同地區(qū)大絨鼠體重調(diào)節(jié)進(jìn)行了研究，結(jié)果證實(shí)了不同地區(qū)大絨鼠受溫度和海拔的影響較大[26]。此外，禁食會導(dǎo)致大絨鼠一些生理指標(biāo)顯著變化[27]。然而關(guān)于禁食對異域分布大絨鼠生存適應(yīng)的影響尚不清楚。作者在先前研究的基礎(chǔ)上，選取了表型差異顯著的香格里拉和劍川地區(qū)的大絨鼠作為實(shí)驗(yàn)對象，在禁食12 h、24 h和禁食36 h后重喂食7 d條件下，測量大絨鼠的體重、攝食量、瘦素含量、下丘腦神經(jīng)肽表達(dá)量和活動行為的變化，探討不同生境大絨鼠遭遇食物不足時其生理調(diào)節(jié)以及行為差異，最終來了解該動物在短期饑餓脅迫環(huán)境下的生態(tài)對策。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)動物2017年11月捕獲于橫斷山區(qū)香格里拉(99°83′16″E，27°90′30″N)和劍川縣(99°75′03″E，26°43′95″N)兩地，海拔分別為3450 m和2590 m，香格里拉地區(qū)冬季氣候冷涼，在冬季食物資源相對匱乏。劍川地區(qū)氣候溫涼，農(nóng)作物為一年兩熟，故可利用的食物較豐富。將香格里拉和劍川地區(qū)捕捉到的大絨鼠帶回云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院(昆明)動物飼養(yǎng)房，單獨(dú)被安置在塑料盒(260 mm×160 mm×150 mm)，無巢材，喂以浸泡過的玉米和一些瓜果，自由飲水，在室溫(25 ℃±1 ℃)和光周期下(12 L∶12 D)環(huán)境下馴化適應(yīng)。所有動物程序均符合云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定(13-0901-011)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.3 體重、攝食量和活動行為的測定

體重、攝食量及行為活動的測定均采用小型哺乳動物代謝系統(tǒng)(PRO-MRMR-8，Sable Systems International Inc，美國)。小型哺乳動物代謝籠裝有體重、水瓶和食物盒，與裝載單元相連，用于體重、攝食量的監(jiān)測。每天早上9:00開始記錄，每隔5 min進(jìn)行記數(shù)。最后利用數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)(SW-METASCREEN，Sable Systems promethion)進(jìn)行分析數(shù)據(jù)。體重、攝食量和活動行為的數(shù)據(jù)記錄和儀器控制通過Meta Screen.v.1.6.2記錄。

1.4 瘦素含量和下丘腦神經(jīng)肽表達(dá)量測定

血清瘦素含量采用瘦素放射免疫分析試劑盒(美國 Linco 公司生產(chǎn))測定。大絨鼠的下丘腦總RNA參照高純總RNA快速抽提試劑盒(BioTeke Co.生產(chǎn))提供的方法進(jìn)行提取與純化。NPY、AgRP、POMC和CART基因cDNA核心序列的擴(kuò)增和表達(dá)量的定量方法詳見Zhu等[28]研究報道。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。在進(jìn)行所有統(tǒng)計分析之前，分別使用Kolmogorov-Smirnov和Levene檢驗(yàn)，檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差同質(zhì)性假設(shè)。性別對所有測定指標(biāo)影響不顯著，因此數(shù)據(jù)合并使用。采用雙因素方差分析體重的差異，攝食量、血清瘦素含量、下丘腦神經(jīng)肽基因表達(dá)量和活動行為的差異采用雙因素協(xié)方差分析，以體重作為協(xié)變量，組間差異采用Tukey多重比較分析法。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 體重、攝食量和活動行為

地區(qū)和食物處理極顯著影響了大絨鼠的體重(地區(qū)：F3,40=4.81，P=0.034；食物：F1,40=6.27，P=0.001，圖1)，兩者的交互效應(yīng)差異不顯著(F3,40=0.12，P=0.950)。地區(qū)處理極顯著影響了大絨鼠的攝食量(F1,39=20.20，P=0.010)，但是食物處理和兩者的交互效應(yīng)對大絨鼠的攝食量影響不顯著(食物：F3,39=0.01，P=0.956；交互效應(yīng)：F3,39=1.20，P=0.275；圖2)。地區(qū)、食物處理和兩者的交互效應(yīng)極顯著影響了大絨鼠的活動行為(地區(qū)：F1,39=10.78，P=0.001；食物：F3,39=106.83，P=0.000；交互效應(yīng)：F3,39=14.96，P=0.000，圖3)。

柱上不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)；下同

圖2 短期禁食和重喂食對兩地區(qū)大絨鼠攝食量的影響

圖3 短期禁食和重喂食對兩地區(qū)大絨鼠活動行為的影響

2.2 短期禁食和重喂食對不同地區(qū)大絨鼠血清瘦素含量的影響

地區(qū)處理顯著影響了大絨鼠的血清瘦素含量(F1,39=2.18，P=0.012)，食物處理極顯著影響了大絨鼠的血清瘦素含量(F3,39=10.60，P=0.000)，兩者的交互效應(yīng)差異不顯著(F3,39=0.77，P=0.669，圖4)。地區(qū)和食物處理顯著影響了大絨鼠的NPY表達(dá)量(地區(qū)：F1,39=52.45，P=0.000；食物：F3,39=4.90，P=0.000)，兩者的交互效應(yīng)差異顯著(F3,39=3.99，P=0.029，圖5-A)。地區(qū)處理極顯著影響了大絨鼠的AgRP、POMC和CART表達(dá)量(AgRP：F1,39=34.07，P=0.000，圖5-B；POMC：F1,39=7.89，P=0.001，圖5-C；CART：F1,39=32.19，P=0.000，圖5-D)，食物處理極顯著影響了大絨鼠的AgRP、POMC和CART表達(dá)量(AgRP：F3,39=6.22，P=0.000；POMC：F3,39=8.80，P=0.000；CART：F3,39=13.63，P=0.000)，但是兩者的交互效應(yīng)對AgRP、POMC和CART表達(dá)量影響不顯著(AgRP：F3,39=1.71，P=0.180；POMC：F3,39=0.15，P=0.938；CART：F3,39=1.35，P=0.254)。

圖4 短期禁食和重喂食對兩地區(qū)大絨鼠血清瘦素含量的影響

3 討論與結(jié)論

動物在適應(yīng)不同食物質(zhì)量或可用性時，其體重會發(fā)生顯著變化[3]。已有研究表明，動物體重的變化受限食程度的影響[13]。在本研究中，短期禁食使得兩地區(qū)大絨鼠體重顯著下降，重喂食后恢復(fù)到對照組水平，這與其他嚙齒動物相似[29]。相反，草原田鼠[30]、紅背鼠和棕背鼠在禁食和重喂食條件下體重變化不大[31]。此外，兩地區(qū)大絨鼠在重喂食后食物攝入量沒有增加，類似于沙鼠[32]，實(shí)驗(yàn)室小鼠和大鼠[33]、布氏田鼠[34]以及與其同域分布的高山姬鼠[35]。相反，敘利亞倉鼠[36]和黑線毛足鼠[37]在食物被剝奪后，食物攝入量補(bǔ)償性增加。因此，不同的哺乳動物對限食和重喂食的反應(yīng)并不完全一致，說明各物種間存在種屬差異。低濃度瘦素可以刺激NPY/AgRP通路，抑制POMC/CART通路[38]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)兩個地區(qū)大絨鼠禁食后血清瘦素水平顯著下降，除劍川地區(qū)大絨鼠NPY和AgRP表達(dá)量變化不顯著以外，限食可以顯著影響其下丘腦神經(jīng)肽表達(dá)量，重喂食后又可以回復(fù)到對照組水平，具有一定的表型可塑性。劍川地區(qū)較香格里拉地區(qū)環(huán)境氣候溫和，食物資源豐富，所以在短時間內(nèi)禁食，只通過降低血清瘦素來調(diào)節(jié)體重和能量支出，故NPY和AgRP表達(dá)量變化不顯著。

圖5 短期禁食和重喂食對兩地區(qū)大絨鼠下丘腦神經(jīng)肽NPY(A)、AgRP(B)、POMC(C)和CART(D)表達(dá)量的影響

動物一般會通過改變活動行為以適應(yīng)環(huán)境的變化，如限食MF1小鼠活動行為顯著減少，而黑線倉鼠在限食期間活動行為顯著增加[39]。本研究中，禁食導(dǎo)致兩組大絨鼠的活動行為顯著降低，這一結(jié)果與瑞士小鼠[40]和金花鼠[41]的研究相似。這可能說明當(dāng)食物短缺時，大絨鼠通過減少活動相關(guān)的能量消耗，以補(bǔ)償能量不足。而兩地區(qū)大絨鼠禁食期間活動行為的差異可能和兩地區(qū)的食物資源差異有關(guān)，香格里拉地區(qū)食物資源較差，所以一旦禁食，迅速降低活動行為，劍川地區(qū)由于食物條件較好，所以在禁食后并沒有降低活動行為，反而是增加活動行為去尋找食物，還可能因?yàn)樵谝巴庖捠硶r食物不足，以增加活動范圍來獲取更多食物。

綜上所述，禁食使兩地區(qū)大絨鼠的體重、活動行為、血清瘦素水平和下丘腦POMC/CART表達(dá)量均顯著下降。重喂食7 d后，除血清瘦素外，各生理指標(biāo)恢復(fù)到對照水平。這些變化表明在不可預(yù)測的環(huán)境中，大絨鼠的能量代謝和行為模式表現(xiàn)出顯著的可塑性，最終來適應(yīng)食物資源短缺環(huán)境。通過兩地區(qū)差異比較研究表明禁食對于香格里拉地區(qū)的大絨鼠影響更為明顯，故同一物種在不同生境下對其能量收支和行為模式有特定的反應(yīng)，存在種內(nèi)差異。