張傳濤，張 璐，徐開慧，徐娟娟，韓智超，陳麗華*

1.西北民族大學(xué)化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730030 2.西北民族大學(xué)實驗中心，甘肅 蘭州 730030

在儲存油品時，油品中的石蠟和瀝青質(zhì)等重質(zhì)組分以及少量機械雜質(zhì)、沙粒、泥土、重金屬鹽類沉積在油罐底部形成含油污泥，含油污泥會對人體造成傷害，其油氣蒸發(fā)在空氣中能刺激皮膚、眼睛及呼吸器官，若進(jìn)入土壤，還會影響植物的正常生長.含油污泥處理困難且對環(huán)境具有放射性污染，是石油及石油化工行業(yè)的主要污染物之一[1].含油污泥中石油烴類物質(zhì)引起的環(huán)境污染逐漸引起人們的關(guān)注，目前對含油污泥的修復(fù)方法有很多，其中利用物理、化學(xué)等方法消減石油烴可以得到較好的效果，但因造價高、二次污染等問題使其應(yīng)用受到了限制，而生物修復(fù)法由于其操作方便、費用低、無二次污染等優(yōu)點，受到了高度重視，是目前處理石油烴污染效果比較好的方法[2-3].堆肥法是利用自然界廣泛分布的微生物，包括細(xì)菌、放線菌、真菌等，在一定的人工條件下，促進(jìn)降解的有機物向穩(wěn)定腐殖質(zhì)轉(zhuǎn)化的生物化學(xué)過程，其實質(zhì)是一種發(fā)酵過程[4-5].

筆者所在的課題組制備了以假單胞菌和芽孢桿菌為主的降油復(fù)合菌劑，其不僅可以廣泛利用石油中的正構(gòu)烷烴、烯烴、藿烷、甾烷等主要成分為碳源進(jìn)行自身生長代謝，而且可以將這些石油成分降解或礦化[6-8].該研究通過混合菌劑強化堆肥法處理含油污泥的小試試驗，采用GC-MS (氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀)圖譜分析技術(shù)對石油烴中正構(gòu)烷烴、藿烷、甾烷的降解特性進(jìn)行分析.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1堆肥原料

該研究使用的堆肥原料為新鮮牛糞、含油污泥和輔料(玉米秸稈).牛糞中的水分含量約為70%，pH為8.4，有機質(zhì)含量為64.3%，C/N為18.5，全碳含量為33.7%，全氮含量為2.09%，上述條件滿足各種微生物降解的需求.含油污泥來自隴東地區(qū)，含油污泥總石油烴含量在3%～20%之間，含水率為5%，pH平均值為7.82，電導(dǎo)率(EC)平均值為0.866 mS/cm，總氮含量平均值為0.493 g/kg，有機質(zhì)含量平均值為257.6 g/kg，有機磷含量平均值為13.26 mg/kg，速效鉀含量平均值為165.9 mg/kg.玉米秸稈經(jīng)粉碎機粉碎后，過10目(約0.08 μm)后上篩，高溫滅菌，晾干備用.

1.1.2堆肥菌劑

堆肥菌劑Ⅰ：T1(木霉菌屬)、A1(曲霉菌屬)、B1(芽孢桿菌屬)、P1(假單胞菌屬).將T1、A1在馬鈴薯液體培養(yǎng)基試管中接種，置于28 ℃恒溫、120 r/min下振蕩培養(yǎng)2～3 d以上，等菌液變渾濁后待用；將B1、P1在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中接種，置于37 ℃恒溫、120 r/min下振蕩培養(yǎng)24 h至液體變渾濁后，待用.將上述復(fù)活好的T1、A1、B1、P1放入發(fā)酵罐中，30 ℃、120 r/min分別發(fā)酵培養(yǎng)，檢測菌落數(shù)大于1×1010CFU/mL后，密封保存?zhèn)溆?使用時按T1、A1、B1、P1體積比為2∶2∶1∶1與腐殖質(zhì)混合吸附制成固體混合菌劑[9-13].

降油復(fù)合菌劑Ⅱ：以隴東地區(qū)受污染土壤當(dāng)作菌源，原油當(dāng)作唯一碳源篩選分離得到6種石油烴降解菌，分別為P1和P2(均為假單胞菌屬)，B1、B2和B3(均為芽孢桿菌屬)以及D1(為不動桿菌屬).由一次擴培后的B1、B2和B3(芽孢桿菌屬)，P1和P2(假單胞菌屬)以及D1(不動桿菌屬)這6株菌，按體積比為1∶1∶1∶1∶1∶1配置成菌懸液，放入發(fā)酵罐中，以營養(yǎng)肉湯為培養(yǎng)基，在37 ℃、200 r/min恒溫振蕩下發(fā)酵，之后與適量的腐殖質(zhì)充分吸附混勻制成固體菌劑，當(dāng)檢測菌落數(shù)的活性在1×1010CFU/mL以上時，密封保存后備用[14-15].

固肥菌劑Ⅲ：將一次擴培后的C1(固氮菌屬)、B1(芽孢桿菌屬)按體積比為1∶1制成混合菌劑，放入發(fā)酵罐里37 ℃、200 r/min發(fā)酵，然后添加適量的腐殖質(zhì)，制成固體菌劑后使菌落數(shù)活性在1×1010CFU/mL以上，密封保存?zhèn)溆?

堆肥菌劑Ⅰ和固肥菌劑Ⅲ的作用是使堆肥原料的纖維素成分分解為微生物可直接利用的糖類等小分子物質(zhì)，并促使生物肥中的氮素固定化，以提供微生物生長必須的營養(yǎng)元素；降油復(fù)合菌劑Ⅱ的作用是利用微生物以石油為碳源的生長代謝過程降解含油污泥中的石油烴[16-17].

1.2 試驗方法

1.2.1降解率的測定

紫外分光光度法測定的是堆體中石油烴類物質(zhì)，先用索氏提取法提取其中的石油類物質(zhì)，殘余油吸光度采用紫外分光光度計測定，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到殘余油的質(zhì)量濃度及降解率[18-20].

1.2.2GC-MS檢測

GC-MS圖譜解析時從總離子流圖中提取正構(gòu)烷烴、藿烷、甾烷3種系列物質(zhì)，積分每個系列化合物的峰面積換算成相對百分含量，藿烷、甾烷系列物質(zhì)用質(zhì)量歸一法計算出相對百分含量，正構(gòu)烷烴系列物質(zhì)用加入內(nèi)標(biāo)物(44-氘代二十一烷)的絕對含量計算出該系列化合物的絕對殘留量(μg).將降解后的樣品用正己烷萃取，取5 mL萃取液，經(jīng)無水硫酸鈉脫水，以及0.22 μm耐有機溶劑濾膜過濾后，取2 mL氮氣吹干，重新溶解于1 mL正己烷中作為進(jìn)樣，用GC-MS (Agilent 7250 GC/Q-TOF，美國)檢測分析降解后總石油烴總離子流[21].

分析條件：氣化溫度260 ℃，載氣He，柱溫200 ℃，柱SE-30 (50 m).質(zhì)譜條件：電子能量70 eV，質(zhì)量范圍為40～450.

1.2.3生物演化參數(shù)分析

烷烴主峰碳反映高低碳數(shù)正構(gòu)烷烴的降解優(yōu)勢，W∑C21-/W∑C22+(W∑C21-為C21以下低碳數(shù)烷烴的質(zhì)量總和，W∑C22+為C22以上高碳數(shù)烷烴的質(zhì)量總和)反映了在微生物降油復(fù)合菌劑作用下高、低碳數(shù)正構(gòu)烷烴的降解優(yōu)勢.該參數(shù)總體反映了烷烴在微生物降油復(fù)合菌劑作用下高、低碳數(shù)正構(gòu)烷烴的降解性能.OEP (有機質(zhì)的奇偶碳比值)反映了微生物降解高碳數(shù)奇、偶碳數(shù)正構(gòu)烷烴的能力，該值越小，表明降解奇數(shù)碳烷烴的能力越強，反之降解偶數(shù)碳烷烴的能力越強.

(1)

式中：WC25為正構(gòu)二十五烷的質(zhì)量，μg；WC26為正構(gòu)二十六烷的質(zhì)量，μg；WC27為正構(gòu)二十七烷的質(zhì)量，μg；WC28為正構(gòu)二十八烷的質(zhì)量，μg；WC29為正構(gòu)二十九烷的質(zhì)量，μg.

使用藿烷中WC31αβ-22S/(WC31αβ-22S+WC31αβ-22R)〔WC31αβ-22S為17α(H)21β(H)-22S-31-升藿烷的質(zhì)量，WC31αβ-22R為17α(H)21β(H)-22R-31-升藿烷的質(zhì)量〕、W∑td/W∑h(W∑td為三環(huán)二萜烷的質(zhì)量總和，W∑h為藿烷的質(zhì)量總和)、WTs/WTm〔WTs為18α(H)-22,29,30三降藿烷的質(zhì)量，WTm為17α(H)-22,29,30三降藿烷的質(zhì)量〕3個參數(shù)作為藿烷生物演化過程中降解和構(gòu)型轉(zhuǎn)化的依據(jù).碳數(shù)大于31的藿烷，由于手性碳是第22位碳原子形成的，因而會出現(xiàn)一對鏡像異構(gòu)體(22S和22R).由于22R在生物體中的含量較高，而22S的含量較低，所以通常將22R構(gòu)型稱為生物構(gòu)型(R型)，將22S構(gòu)型稱為地質(zhì)構(gòu)型(S型).藿烷類化合物由R型在成巖或微生物作用過程中逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)镾型(更穩(wěn)定)，最后達(dá)到R型和S型的平衡狀態(tài)，即S型占比為0.6.

使用甾烷中的WC29αα-20S/(WC29αα-20S+WC29αα-20R)(WC29αα-20S為ααα-20S-24-乙基-膽甾烷的質(zhì)量，WC29αα-20R為ααα-20R-24-乙基-膽甾烷的質(zhì)量)、W∑pg/W∑g(W∑pg為孕甾烷的質(zhì)量總和，W∑g為甾烷的質(zhì)量總和)、W∑rg/W∑g(W∑rg為重排甾烷的質(zhì)量總和，W∑g為甾烷的質(zhì)量總和)3個參數(shù)作為甾烷生物演化過程中降解和構(gòu)型轉(zhuǎn)化的依據(jù)，其均是石油地質(zhì)領(lǐng)域常用的有機質(zhì)演化程度參數(shù).碳數(shù)大于29的甾烷，因為手性碳是由其第20位碳原子形成的，因而會出現(xiàn)一對鏡像異構(gòu)體(20S和20R).甾烷類化合物由生物構(gòu)型(R型)在成巖或微生物作用過程中逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榈刭|(zhì)構(gòu)型(S型，更穩(wěn)定)，最后達(dá)到R型和S型的平衡狀態(tài)，即S型占比為0.6.

1.3 試驗設(shè)計

將新鮮牛糞500 kg、油泥100～130 kg和輔料(2%玉米秸稈)攪拌均勻，試驗設(shè)計空白組與試驗組各2個，空白組Ⅰ和試驗組Ⅰ石油烴的初始濃度均為7%，空白組Ⅱ和試驗組Ⅱ石油烴的初始濃度均為10%，空白組中只加入堆肥菌劑Ⅰ和固肥菌劑Ⅲ，試驗組較空白組多加入了降油復(fù)合菌劑Ⅱ.

試驗步驟：首先加入1.5%的堆肥菌劑Ⅰ，使堆肥物料快速達(dá)到高溫，控制堆肥過程中臭氣的產(chǎn)生，縮短堆肥腐熟進(jìn)程；堆體溫度升至60 ℃左右并維持一段時間(10～15 d)，當(dāng)堆體溫度降至30 ℃時試驗組加入5%降油復(fù)合菌劑Ⅱ，利用微生物以石油為碳源的生長代謝過程降解含油污泥中的石油烴，并保持含氧量在10%～20%內(nèi)，濕度在20%～45%范圍內(nèi)，實時監(jiān)測降油率等相關(guān)指標(biāo).在堆肥一個月左右時加入1%固肥菌劑Ⅲ維持堆體肥力，以供給微生物降解所必需的N、P等營養(yǎng)元素.堆至降油指標(biāo)達(dá)到目標(biāo)值，用Fenton試劑處理殺菌.

2 結(jié)果與討論

2.1 總石油烴降解率的變化

注：1—正十四烷；2—正十五烷；3—正十六烷；4—正十七烷；5—姥鮫烷；6—正十八烷；7—植烷；8—正十九烷；9—正二十烷；10—44-氘代二十一烷(內(nèi)標(biāo))；11—正二十一烷；12—正二十二烷；13—正二十三烷；14—正二十四烷；15—正二十五烷；16—正二十六烷；17—正二十七烷；18—正二十八烷；19—正二十九烷；20—正三十烷；21—正三十一烷；22—正三十二烷；23—正三十三烷；24—正三十四烷；25—正三十五烷.圖2 空白組與試驗組中正構(gòu)烷烴系列GC-MS質(zhì)量色譜圖Fig.2 n-alkanes series GC-MS mass chromatogram between the blank group and the experimental group

由圖1可見：在堆肥過程中，試驗組Ⅰ、Ⅱ在降解前期(0～18 d)的總石油烴降解率平均值分別為57%和44%，因試驗組Ⅱ石油烴初始濃度較高，對微生物初期生長繁殖有一定抑制，導(dǎo)致降解效果明顯不如試驗組Ⅰ；試驗組Ⅰ、Ⅱ在降解中期(18～48 d)的總石油烴降解率平均值分別為67%和46%，微生物菌劑需要一定時間去適應(yīng)環(huán)境，石油烴初始濃度為10%的試驗組Ⅱ的適應(yīng)時間明顯長于石油烴起始濃度為7%的試驗組Ⅰ，故試驗組Ⅰ的降解不如試驗組Ⅱ.相比空白組，2個試驗組在25 d時均加入了降油復(fù)合菌劑，使得2個試驗組的降解率大幅提升，到49 d時總石油烴降解率分別達(dá)86%和65%，較空白組分別提高了56%和35%.從降解趨勢分析，利用該微生物降油復(fù)合菌劑與堆肥法聯(lián)合修復(fù)含油污泥時，周期控制在50 d左右為宜.2個空白組在第25天后，其降解率均為50%，且一直保持著較低的水平，說明通過添加外源微生物降油復(fù)合降油菌劑有利于提高堆肥體系中石油烴的降解率[22];同時，試驗組Ⅰ、Ⅱ堆肥后的肥力和污染物含量也發(fā)生了變化，其中腐殖質(zhì)、有機質(zhì)、碳氮比、礦物油含量平均值分別為45 g/kg、57 g/kg、12%、0.8%，除腐殖質(zhì)含量有顯著增加外，其他指標(biāo)均較堆肥前降低，與李文玉[23]添加外源菌劑后試驗組腐殖質(zhì)含量、碳氮比分別為58 g/kg、28.5%相比，該研究添加微生物降油復(fù)合菌劑后碳氮比含量較普通菌劑低，說明該研究采用的微生物降油復(fù)合菌劑的石油烴降解率較高.此外，試驗組Ⅰ、Ⅱ堆肥后Hg含量≤15 mg/kg、Cu含量≤500 mg/kg、Zn含量≤1 000 mg/kg、Ni含量≤200 mg/kg、Pb含量≤1 000 mg/kg、Cd含量≤20 mg/kg、Cr含量≤1 000 mg/kg、As含量≤75 mg/kg，各重金屬含量均在GB 15618—1995《土壤壞境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》范圍內(nèi).

圖1 空白組與試驗組中總石油烴降解率的變化Fig.1 Changes of total petroleum hydrocarbons degradation rate between the blank group and the experimental group

2.2 正構(gòu)烷烴、藿烷、甾烷降解規(guī)律

原油中的主要成分是石油烴，包括飽和烴和不飽和烴，而飽和烴中主要成分是烷烴，其包括正構(gòu)烷烴、藿烷、甾烷3種系列，這3種系列在飽和烴餾分中的總占比較高(94.6%).烷烴中多數(shù)為直鏈烷烴，碳數(shù)范圍為C14～C39，其次是支鏈烴，低碳數(shù)異構(gòu)烷烴中植烷和姥鮫烷濃度較高.在微生物降油復(fù)合菌劑降解過程中，降解飽和烴所需的能量最低，說明微生物復(fù)合菌劑在降解過程中飽和烴會先被降解，之后結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的烴類再被降解[24].可見，總石油烴中降解率最高的是正構(gòu)烷烴.正構(gòu)烷烴中有3種系列含量較高，3種系列包括正十四烷、植烷、正三十九烷等25種物質(zhì)，從離子流圖中可以提取并獲得各物質(zhì)的含量.由圖2可見：沒有添加微生物降油復(fù)合菌劑的空白組的豐度下降趨勢最小，降解效果不明顯，較試驗組Ⅰ、Ⅱ有較大差別；正構(gòu)烷烴降解效果最明顯的是試驗組Ⅰ，其豐度下降趨勢最大；試驗組Ⅱ中正構(gòu)烷烴也有一定的降解，但降解效果不如試驗組Ⅰ.

圖3為微生物降油復(fù)合菌劑與堆肥法聯(lián)合降解49 d后正構(gòu)烷烴殘留量變化.由圖3可見：試驗組Ⅰ正構(gòu)烷烴的平均殘留量較空白組Ⅰ降低了0.03 μg，說明通過添加外源微生物降油復(fù)合降油菌劑能有效降低堆肥體系中正構(gòu)烷烴的量；試驗組Ⅰ中高碳數(shù)烷烴(碳數(shù)>20)的平均殘留量比空白組Ⅰ降低了0.02 μg，低碳數(shù)烷烴(碳數(shù)<20)的平均殘留量比空白組Ⅰ降低了0.04 μg，說明試驗組Ⅰ對高碳數(shù)烷烴、低碳數(shù)烷烴均有較好地降解效果.加入堆肥混合菌劑Ⅰ后，會加速能利用牛糞的天然微生物(芽孢桿菌屬等)的增長，其將牛糞中大量纖維成分分解為其他微生物可直接利用的糖類，以及將玉米秸稈中的多糖分解成小分子淀粉等，此時添加適量的微生物降油復(fù)合菌劑(腐殖質(zhì)固載)剛好可以利用前期堆肥過程產(chǎn)生的糖類等小分子物質(zhì)使降油菌株大量繁殖，為其在降解含油污泥中石油烴的過程提供合適的環(huán)境條件.正構(gòu)烷烴(碳數(shù)<40)的降解率與碳數(shù)呈負(fù)相關(guān)，微生物降油復(fù)合菌劑對高碳數(shù)烷烴(碳數(shù)>20)的平均降解率為75.55%，大于對低碳數(shù)烷烴(碳數(shù)<20)的平均降解率(62.98%)，證明在一定鏈長范圍(C14～C35)內(nèi)，碳鏈越長，降解越快[25-26].菌劑在剛加到土壤中時并不會很快適應(yīng)土壤環(huán)境，但是隨著時間的推移，菌劑會逐漸與土壤環(huán)境相適應(yīng).現(xiàn)場試驗在某時段的菌落數(shù)會達(dá)到最大值，降解率在該時段也達(dá)到最大值，各種菌劑在降解石油不同組分中起協(xié)同作用;之后菌落數(shù)雖逐步減少，但石油烴降解率仍會升高，這是因為微生物降油復(fù)合菌劑與底物降解之間存在滯后性，雖然菌落數(shù)逐步減少，但降解效果不會隨菌落數(shù)的減少而降低，降解仍可持續(xù)一段時間；同時，正構(gòu)烷烴降解后的產(chǎn)物能為微生物提供可再利用的碳源，也利于微生物的生長.

圖3 空白組與試驗組中正構(gòu)烷烴降解規(guī)律Fig.3 Degradation trend of n-alkanes between the blank group and the experimental group

注：1—三環(huán)二萜烷；2—三環(huán)二萜烷；3—三環(huán)二萜烷；4—三環(huán)二萜烷；5—三環(huán)二萜烷；6—22S+22R-三環(huán)二萜烷；7—四環(huán)萜；8—22S-三環(huán)二萜烷；9—22R-三環(huán)二萜烷；10—22S-三環(huán)二萜烷；11—22R-三環(huán)二萜烷.圖4 空白組與試驗組中藿烷系列GC-MS質(zhì)量色譜圖Fig.4 Horane series GC-MS mass chromatogram between the blank group and the experimental group

石油烴的第二系列化合物是藿烷，在一定條件下微生物可以降解藿烷及其相關(guān)同系物[27].由圖4可見，藿烷中最主要的物質(zhì)是三環(huán)二萜烷化合物.為進(jìn)一步解釋石油烴的降解規(guī)律，分析各試驗組降解藿烷系列物質(zhì)的特征及差異，利用藿烷生物標(biāo)志物參數(shù)WTs/WTm和WC31αβ-22S/(WC31αβ-22S+WC31αβ-22R)分析微生物在生物演化石油過程中降解和構(gòu)型的轉(zhuǎn)化[28-30].

峰號：1—三環(huán)二萜烷；2—三環(huán)二萜烷；3—三環(huán)二萜烷；4—三環(huán)二萜烷；5—三環(huán)二萜烷；6—22S+22R-三環(huán)二萜烷；7—四環(huán)萜；8—22S-三環(huán)二萜烷；9—22R-三環(huán)二萜烷；10—22S-三環(huán)二萜烷；11—22R-三環(huán)二萜烷；12—22S-三環(huán)二萜烷；13—22R-三環(huán)二萜烷；14—18α(H)-22,29,30-三降藿烷；15—17α(H)-22,29,30-三降藿烷；16—17α(H),21β(H)-30-降藿烷；17—重排-30-降藿烷；18—羽扇烷；19—17β(H),21α(H)-30-降莫烷；20—17α(H),21β(H)-藿烷；21—五環(huán)三萜烷；22—五環(huán)三萜烷；23—17β(H),21α(H)-莫烷；24—17α(H),21β(H)-22S-31-升藿烷；25—17α(H),21β(H)-22R-31-升藿烷；26—γ-蠟烷；27—17α(H),21β(H)-22S-31,32-二升藿烷；28—17α(H),21β(H)-22R-31,32-二升藿烷；29—17α(H),21β(H)-22S-31,32,33-三升藿烷；30—17α(H),21β(H)-22R-31,32,33-三升藿烷.圖5 空白組與試驗組中藿烷的降解規(guī)律Fig.5 Degradation of hopane between the blank group and the experimental group

由圖5可見，試驗組Ⅰ、Ⅱ的藿烷含量較空白組Ⅰ、Ⅱ分別降低了2.6%和3.0%，試驗組Ⅰ、Ⅱ的降解趨勢基本一致，表明微生物混合菌劑對含油污泥土壤中藿烷類物質(zhì)的降解率(90%以上)較高，說明藿烷的降解主要表現(xiàn)為手性碳R型向更穩(wěn)定的S型轉(zhuǎn)化的特征.藿烷的降解波動明顯，原因是該類物質(zhì)S型 和R型交替出現(xiàn)，混合菌劑促使五環(huán)三萜類化合物立體構(gòu)型中不穩(wěn)定構(gòu)型向穩(wěn)定性構(gòu)型轉(zhuǎn)化，S型化合物更穩(wěn)定，所以降解率低，R型物質(zhì)不穩(wěn)定，所以降解率高，故整體呈波浪狀的降解趨勢.其中，微生物混合菌劑對22S-31,32,33,34-四升藿烷的降解效果最好，降解率達(dá)98.8%；而對γ-蠟烷、17α(H),21β(H)-22S-31,32-二升藿烷、17α(H),21β(H)-22R-31,32-二升藿烷、17α(H),21β(H)-22S-31,32,33-三升藿烷、17α(H),21β(H)-22R-31,32,33-三升藿烷的降解效果均較好，降解率均在85%以上.該微生物降油復(fù)合菌劑對五環(huán)三萜類、升藿烷類、降藿烷類的降解難易程度依次為五環(huán)三萜類>升藿烷類>降藿烷類.可見，油污土壤中的藿烷類化合物在混合菌劑中各菌株配比合適的情況下降解率均較高，藿烷屬于環(huán)烷烴的一種，與正構(gòu)烷烴相比更難被降解，說明該微生物降油復(fù)合菌劑對藿烷也具有較強的降解能力.

石油烴的第三系列化合物是甾烷，是由一組不對稱異構(gòu)多環(huán)環(huán)烷烴組成，其特點是具有旋光性.由圖6可見，甾烷中最主要的物質(zhì)是升孕甾烷、重排膽甾烷、膽甾烷等化合物.許多甾烷存在于沉積物和原油中，是由生物中的甾族(甾醇)化合物轉(zhuǎn)化而來的.因此，具有海相或湖相的沉積物一般含有大量的甾烷類化合物.

由圖7可見：試驗組Ⅰ、Ⅱ?qū)︾尥轭惢衔锏慕到庑Ч鶅?yōu)于空白組，與試驗組Ⅰ、Ⅱ加入了微生物降油復(fù)合菌劑有關(guān).微生物降油復(fù)合菌劑對甾烷類化合物的降解幅度均較高，經(jīng)過49 d的降解，石油烴中甾烷含量均降至2%以下，其中，4-甲基-24-乙基-膽甾烷的降解效果最好，降解率達(dá)98.6%；ααα-20S-膽甾烷、αββ-20R-膽甾烷、βα20S-24-乙基-重排膽甾烷、αββ-20S-膽甾烷、ααα-20R-膽甾烷、βα-20R-24-乙基-重排膽甾烷、ααα-20S-24-甲基-膽甾烷、αββ-20R-24-甲基-膽甾烷、αββ-20S-24-甲基-膽甾烷、ααα-20R-24-甲基-膽甾烷、ααα-20S-24-乙基-膽甾烷、αββ-20R-24-乙基-膽甾烷、αββ-20S-24-乙基-膽甾烷、4-甲基-24-甲基-膽甾烷的降解效果均較好，降解率均在90%以上.由此可見，微生物降油復(fù)合菌劑對石油烴中的甾烷類化合物降解幅度均較高.

注：1—孕甾烷；2—升孕甾烷；3—βα-20S-重排膽甾烷；4—βα-20R-重排膽甾烷；5—βα-20S-24-甲基重排膽甾烷；6—βα-20R-24-甲基重排膽甾烷；7—ααα-20S-膽甾烷；8—αββ-20R-膽甾烷.圖6 空白組與試驗組中甾烷系列GC-MS質(zhì)量色譜圖Fig.6 Gonane series GC-MS mass chromatogram between the blank group and the experimental group

峰號：1—孕甾烷；2—升孕甾烷；3—βα-20S-重排膽甾烷；4—βα-20R-重排膽甾烷；5—βα-20S-24-甲基重排膽甾烷；6—βα-20R-24-甲基重排膽甾烷；7—ααα-20S-膽甾烷；8—αββ-20R-膽甾烷；9—βα20S-24-乙基-重排膽甾烷；10—αββ-20S-膽甾烷 ；11—ααα-20R-膽甾烷；12—βα-20R-24-乙基-重排膽甾烷；13—ααα-20S—24-甲基-膽甾烷；14—αββ-20R-24-甲基-膽甾烷；15—αββ-20S-24-甲基-膽甾烷；16—ααα-20R-24-甲基-膽甾烷；17—ααα-20S-24-乙基-膽甾烷；18—αββ-20R-24-乙基-膽甾烷；19—αββ-20S-24-乙基-膽甾烷；20—4-甲基-24-甲基-膽甾烷；21—ααα-20R-24-乙基-膽甾烷；22、23、24—4-甲基-24-乙基-膽甾烷.圖7 空白組與試驗組中甾烷的降解規(guī)律Fig.7 Degradation of Gonane between the blank group and the experimental group

2.3 正構(gòu)烷烴、藿烷、甾烷的生物演化參數(shù)分析

由表1可見：正構(gòu)烷烴生物演化參數(shù)中，試驗組Ⅱ的W∑C21-/W∑C22+為 0.282 6，小于試驗組Ⅰ(0.577 1)，表明試驗組Ⅰ降解高碳數(shù)烷烴的能力強于試驗組Ⅱ.試驗組Ⅱ的OEP值為 0.632 0，小于試驗組Ⅰ(1.018 3)，表明試驗組Ⅰ的降解程度高于試驗組Ⅱ；試驗組Ⅱ的OEP值是空白組Ⅱ的0.6倍，其OEP值最小，說明微生物降油復(fù)合菌劑對高碳數(shù)奇數(shù)碳烷烴的降解效果優(yōu)于對偶數(shù)碳烷烴的降解效果.試驗組Ⅰ的OEP值約為1，沒有表現(xiàn)出奇偶碳優(yōu)勢的特征.2個空白組烷烴主峰碳范圍為C16～C20，2個試驗組的主峰數(shù)均發(fā)生后移，主峰碳數(shù)后移表明石油烴在微生物的作用下優(yōu)先降解低碳數(shù)烷烴.

表1 正構(gòu)烷烴生物演化參數(shù)Table 1 Biological evolution parameters of n-alkanes

由表2可見，藿烷系列生物演化參數(shù)中，試驗組Ⅱ的三環(huán)二萜烷化合物主峰相對于試驗組Ⅰ發(fā)生了后移，說明石油烴在協(xié)同作用下表現(xiàn)出較強的優(yōu)先降解低碳數(shù)藿烷的能力.試驗組Ⅰ和試驗組Ⅱ的W∑td/W∑h分別為 0.086 7 和 0.089 5，均小于各空白組，說明2個試驗組的三環(huán)二萜烷被微生物降油復(fù)合菌劑降解的程度均較高.碳數(shù)大于C31的17α(H)、21β(H)構(gòu)型的藿烷，因其第22位碳原子形成手性碳，所以會出現(xiàn)一對鏡像異構(gòu)體(22S和22R).WC31αβ-22S/(WC31αβ-22S+WC31αβ-22R)是石油地質(zhì)領(lǐng)域常用的有機質(zhì)演化程度參數(shù)，空白組Ⅱ的WC31αβ-22S/(WC31αβ-22S+WC31αβ-22R)為 0.546 4，其較為接近終點值 0.600 0，所以成熟質(zhì)的原石油樣受外力作用變化不大.試驗組Ⅰ、試驗組Ⅱ經(jīng)微生物降油復(fù)合菌劑降解后的WC31αβ-22S/(WC31αβ-22S+WC31αβ-22R)分別為 0.593 2 和 0.614 6，均大于各空白組，因此該降油復(fù)合菌劑能促進(jìn)三環(huán)二萜類化合物的手性碳R型向更穩(wěn)定的S型轉(zhuǎn)化.WTs/WTm也是石油地質(zhì)領(lǐng)域常用的有機質(zhì)演化程度參數(shù)，試驗組Ⅰ、Ⅱ的WTs/WTm分別為 0.802 2 和 0.822 9，均大于各空白組，說明三降藿烷在微生物作用下，Tm立體構(gòu)型逐漸向更穩(wěn)定的Ts立體構(gòu)型轉(zhuǎn)化，表明該降油復(fù)合菌劑能促進(jìn)藿烷不穩(wěn)定構(gòu)型向更穩(wěn)定性構(gòu)型轉(zhuǎn)化.

表2 藿烷系列生物演化參數(shù)Table 2 Biological evolution parameters of hopane series

由表3可見：甾烷系列生物演化參數(shù)中，試驗組Ⅰ、Ⅱ的W∑pgW∑g分別為 0.019 0 和 0.020 4，均小于各空白組，說明微生物降油復(fù)合菌劑能促進(jìn)孕甾烷的轉(zhuǎn)化；試驗組Ⅰ、Ⅱ的W∑rgW∑g分別為 0.048 5 和 0.049 6，均明顯小于各空白組 (0.233 9 和 0.258 7)，表明微生物降油復(fù)合菌劑對重排甾烷的降幅較大.碳數(shù)大于C29的甾烷，因其第20位碳原子成為手性碳，所以會出現(xiàn)一對鏡像異構(gòu)體(20S和20R).空白組Ⅱ的WC29αα-20S(WC29αα-20S+WC29αα-20R)為 0.644 7，其較為接近終點值 0.600 0，所以成熟質(zhì)的原石油樣受外力作用變化不大；試驗組Ⅰ、試驗組Ⅱ經(jīng)降解后WC29αα-20S(WC29αα-20S+WC29αα-20R)分別為 0.565 4 和 0.595 3，均小于各空白組.綜上，該降油復(fù)合菌劑能有效促進(jìn)甾烷的降解.

表3 甾烷系列生物演化參數(shù)Table 3 Biological evolution parameters of gonane series

3 結(jié)論

a) 通過GC-MS分析，石油烴3種系列的降解難易程度為正構(gòu)烷烴>藿烷>甾烷.從降解規(guī)律看，77%的油泥經(jīng)微生物強化堆肥處理49 d后降解率在85%以上.總石油烴中降解率最大的是正構(gòu)烷烴，藿烷、甾烷中最具代表性的物質(zhì)分別為22S-31,32,33,34-四升藿烷、4-甲基-24-乙基-膽甾烷，降解率分別為98.8%以及90%以上.結(jié)果表明，微生物降油復(fù)合菌劑對石油烴中正構(gòu)烷烴、藿烷、甾烷的降解效果均較好.

b) 從生物演化參數(shù)可以看出，該微生物降油復(fù)合菌劑對高碳數(shù)奇數(shù)碳烷烴的降解效果優(yōu)于對偶數(shù)碳烷烴，可促進(jìn)三環(huán)二萜類化合物的手性碳R型向更穩(wěn)定的S型轉(zhuǎn)化，三降藿烷的Tm立體構(gòu)型向更穩(wěn)定的Ts立體構(gòu)型轉(zhuǎn)化，以及孕甾烷的轉(zhuǎn)化.演化參數(shù)分析說明，微生物強化堆肥過程中該降油復(fù)合菌劑能夠有效促進(jìn)石油烴3種系列物質(zhì)的生物降解和演化.