鄧銘霞 裘云慶

乙型肝炎病毒(HBV)感染可引起急性或慢性肝臟炎癥，后者對人體健康影響更大且更易發(fā)展成為不可逆的嚴(yán)重肝臟疾病，如肝硬化或肝細(xì)胞癌。據(jù)統(tǒng)計(jì)慢性HBV感染影響了全球約2.57億人，其導(dǎo)致的肝損傷在2015年造成約88.7萬人死亡。當(dāng)前針對慢性乙型病毒性肝炎(簡稱乙肝)的抗病毒治療方案主要是以核苷(酸)類似物(NAs)和干擾素(IFN)-α為代表的藥物治療。臨床上NAs或聚乙二醇干擾素(Peg-IFN)-α長期治療持續(xù)抑制HBV復(fù)制能有效改善部分患者肝臟損傷，防止肝臟失代償?shù)陌l(fā)生，進(jìn)而減少因發(fā)展為不可逆嚴(yán)重肝臟疾病而導(dǎo)致的死亡[1]。然而，當(dāng)前的療法很少能使患者實(shí)現(xiàn)“功能上的治愈”，即血清中無法檢測到HBV表面抗原(HBsAg)與HBV DNA，這是對HBV成功免疫應(yīng)答和完全且持久地控制HBV感染的標(biāo)志[1]。最近抗HBV藥物的研發(fā)取得了許多令人矚目的新進(jìn)展。

一、抗HBV藥物現(xiàn)狀

當(dāng)前的抗HBV治療藥物主要是IFN-α(包括Peg-IFN-α)和NAs。NAs主要為拉米夫定(LAM)、阿德福韋酯(ADV)、替比夫定(LdT)、恩替卡韋(ETV)和替諾福韋。我國《慢性乙型肝炎防治指南(2019版)》推薦的首選NAs一線治療藥物為ETV、富馬酸替諾福韋酯(TDF)和富馬酸丙酚替諾福韋片(TAF)[2]。

1.IFN-α：Peg-IFN-α是一種公認(rèn)的抗HBV藥物，其作為細(xì)胞因子能增強(qiáng)機(jī)體對HBV感染的免疫反應(yīng)。許多IFN刺激基因(ISG)也已被證實(shí)可通過不同途徑抑制HBV感染和復(fù)制[3]。研究顯示，干擾素-α治療能增加慢性乙肝的HBsAg血清轉(zhuǎn)化率并延長臨床緩解期，降低發(fā)展成肝癌的風(fēng)險(xiǎn)，提高患者生存率[4]。然而，IFN-α和Peg-IFN治療仍存在持續(xù)應(yīng)答率較低(20～30%)和較多不良反應(yīng)等問題[3]。

2.NAs：NAs通過取代結(jié)構(gòu)類似的核苷，使正在合成的DNA鏈延長中止，并抑制相應(yīng)DNA聚合酶的活性，進(jìn)而抑制病毒復(fù)制[5]。LAM、ADV、LdT是較早應(yīng)用于抗HBV治療的NAs藥物，在抗HBV治療歷史中曾發(fā)揮了重要作用。但由于患者用藥1～3年后容易出現(xiàn)HBV DNA基因變異,進(jìn)而出現(xiàn)耐藥，并出現(xiàn)一些腎功能損害等不良反應(yīng)，已不再作為一線抗HBV治療藥物。ETV是一個(gè)強(qiáng)效低耐藥的HBV復(fù)制抑制劑，不良反應(yīng)也較少，因此，其目前仍是抗HBV治療的首選藥物。TDF與ETV一樣，同樣顯示出良好的安全性與較低的耐藥率。TAF也能有效地減少HBV DNA并使ALT恢復(fù)正常水平，同時(shí)發(fā)生不良事件較少[2]。盡管這些NAs表現(xiàn)出上述強(qiáng)有力的抗病毒作用，但其需要長期服用，且只能抑制HBV復(fù)制，很少使患者達(dá)到“功能性治愈”的目標(biāo)[1]。

二、抗HBV新藥的研究進(jìn)展

HBV是一種具有包膜的嗜肝病毒，其基因組由結(jié)構(gòu)復(fù)雜的部分環(huán)狀雙鏈DNA組成[5]。由于HBV生活周期的獨(dú)特性及HBV對宿主免疫系統(tǒng)的抑制作用，治愈HBV感染極具挑戰(zhàn)。據(jù)此，針對病毒生活周期及HBV免疫應(yīng)答做出干預(yù)成為治愈HBV感染的主要策略[9]。近年來根據(jù)這兩條策略發(fā)展了多種乙肝抗病毒創(chuàng)新療法(表1)。

1.直接抗病毒藥物

直接抗病毒藥物可干擾病毒生活周期各個(gè)階段，根據(jù)抗病毒機(jī)制主要分為以下5個(gè)機(jī)制：阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞、抑制cccDNA產(chǎn)生或使其失活降解、抑制病毒基因表達(dá)、抑制核衣殼組裝、抑制HBsAg釋放[7](圖1)。

(1)阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞：鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽(NTCP)位于肝細(xì)胞基底外側(cè)膜，被認(rèn)為是HBV進(jìn)入細(xì)胞的功能性受體[8]，其一經(jīng)發(fā)現(xiàn)即成為防止病毒進(jìn)入細(xì)胞的主要靶點(diǎn)。Myrcludex B是一種模擬HBV NTCP結(jié)合域的合成肽，能夠競爭性抑制HBV進(jìn)入宿主細(xì)胞。它在臨床試驗(yàn)中也呈現(xiàn)了較好的抗HBV作用[7]。單克隆抗體也可通過阻斷前S1蛋白與NTCP的特異性結(jié)合阻止HBV進(jìn)入細(xì)胞[9]。環(huán)孢菌素衍生物能在不干擾NTCP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的情況下抑制HBV入侵，這表明阻止HBV進(jìn)入細(xì)胞可以在功能上與膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)分開，這對減少藥物相關(guān)的不良反應(yīng)十分有益[10]。

表1 進(jìn)入臨床研究的抗HBV部分新藥的作用機(jī)制和研究階段

注：①為阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞的主要靶點(diǎn)；②為抑制cccDNA產(chǎn)生或使其失活降解的主要靶點(diǎn)；③為抑制病毒基因表達(dá)的主要靶點(diǎn)；④為抑制核衣殼組裝的主要靶點(diǎn)；⑤為抑制HBsAg釋放的主要靶點(diǎn)。HSPG:硫酸乙酰肝素蛋白多糖；rcDNA:松弛環(huán)狀DNA；pgRNA:前基因組RNA圖1 HBV生活周期及藥物主要作用靶點(diǎn)

(2)抑制cccDNA的產(chǎn)生或使其失活降解：cccDNA是由HBV蛋白連接的松弛環(huán)狀DNA基因組在宿主細(xì)胞核轉(zhuǎn)變而成的質(zhì)粒樣游離基因，其重要功能是作為所有病毒RNA的模板，進(jìn)而形成新的病毒體。cccDNA半衰期較長，其在細(xì)胞中的持續(xù)存在是治愈HBV感染的主要障礙[11]。治愈HBV的最可靠方法是清除或永久沉默cccDNA。靶向cccDNA的療法需要充分了解cccDNA的分子生物學(xué)機(jī)制。宿主蛋白參與cccDNA生成的多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。干預(yù)宿主蛋白能有效抑制cccDNA產(chǎn)生，但較多的不良反應(yīng)限制了該方法的發(fā)展[7]。因?yàn)镠Bx對HBV進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí)取消cccDNA的沉默是必須，故其可能成為一個(gè)治療靶點(diǎn)。使用基因編輯技術(shù)設(shè)計(jì)的核酸酶能靶向cccDNA,是使其失活降解的新工具，如鋅指核酸酶和轉(zhuǎn)錄激活樣內(nèi)切核酸酶。但肝細(xì)胞遞送、脫靶效應(yīng)等問題仍需進(jìn)一步研究解決[7]。

(3)抑制病毒基因表達(dá)：抑制病毒基因表達(dá)主要是通過RNA干擾(RNAi)和反義寡核苷酸(ASO)技術(shù)實(shí)現(xiàn)?；赗NAi的治療可以高特異性直接靶向HBV轉(zhuǎn)錄本，導(dǎo)致病毒抗原減少，進(jìn)而可能允許免疫重建和功能性治愈[12]。ARO-HBV(JNJ-3989)包含兩個(gè)直接與N-乙酰半乳糖胺共軛的小干擾RNA，能夠使cccDNA和宿主整合病毒DNA形成的所有mRNA沉默。有關(guān)臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，ARO-HBV與NAs的聯(lián)合治療能有效降低HBsAg水平且安全性與耐受性良好[13]。反義寡核苷酸是小的單鏈核酸序列，可高選擇性地結(jié)合到目標(biāo)RNA上，通過RNase h依賴途徑觸發(fā)降解。目前正在開發(fā)的一種用于治療慢性HBV感染的ASO為GSK3389404，已經(jīng)證實(shí)其在健康受試者的初步臨床試驗(yàn)中具有可接受的安全性和藥代動(dòng)力學(xué)特征[14]，為其進(jìn)一步臨床研究提供了基礎(chǔ)。

(4)抑制核衣殼組裝：核衣殼對病毒基因組進(jìn)行包裝，同時(shí)也是HBV前基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄的場所，更承擔(dān)著胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)裙δ?，對維持HBV復(fù)制周期起重要作用。在其組裝過程，核心蛋白同型二聚體包裹HBV前基因組RNA和聚合酶，初步形成具有生物活性的不成熟HBV核衣殼，前基因組RNA在不成熟HBV核衣殼內(nèi)完成逆轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而形成成熟的核衣殼[15]。目前很多靶向核衣殼組裝的藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。HBV衣殼裝配調(diào)節(jié)劑JNJ-56136379和NVR 3-778在慢性HBV感染患者的Ⅰ期研究中顯示出良好的耐受性與抗病毒活性[16-17]。ABI-H0731同樣可抑制核衣殼組裝，也已在臨床試驗(yàn)中被證實(shí)能降低HBV DNA和RNA水平，且未發(fā)生任何治療性不良事件[18]。

(5)抑制HBsAg釋放：抑制HBsAg釋放有助于恢復(fù)其介導(dǎo)的免疫抑制，能有效控制HBV感染[19]。核酸聚合物REP 2139是一種正在研究的分泌抑制劑,能夠阻斷肝細(xì)胞中亞病毒顆粒的組裝進(jìn)而抑制HBsAg釋放。臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，REP 2139與Peg-IFN-α-2a聯(lián)合使用能在治療1年后實(shí)現(xiàn)對大部分患者的感染控制并使其血清氨基轉(zhuǎn)移酶恢復(fù)正常，且安全性和耐受性良好[20]。REP 2165是一種REP 2139類似物，含有3個(gè)等距分布的未修飾核糖腺苷。一項(xiàng)Ⅱ期隨機(jī)試驗(yàn)結(jié)果顯示在TDF+pegIFN中添加REP 2139或REP 2165不會(huì)改變患者耐受性，并且顯著增加HBsAg清除率和血清轉(zhuǎn)化率[21]。

2.間接抗病毒藥物

間接抗病毒藥物靶向宿主免疫系統(tǒng)通過激活針對HBV的免疫應(yīng)答實(shí)現(xiàn)抗病毒作用。免疫反應(yīng)包括固有免疫及適應(yīng)性免疫，前者主要由組織屏障和固有免疫細(xì)胞細(xì)胞組成，后者由體液免疫和細(xì)胞免疫組成。HBV表現(xiàn)出對宿主的免疫功能抑制，同時(shí)還能建立免疫耐受使自己逃脫免疫防御與清除[5]。因此，通過適當(dāng)激活宿主的固有免疫與適應(yīng)性免疫，可能能夠促進(jìn)HBV感染清除的完全治愈。

(1)激活固有免疫系統(tǒng)：針對固有免疫系統(tǒng)療法主要利用細(xì)胞因子直接抗病毒效應(yīng)和模式識別受體激活。傳統(tǒng)抗HBV藥物IFN-α是常見的細(xì)胞因子[3]；研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF和IFN-γ能通過脫氨基作用減少cccDNA[7]。同時(shí)，模式識別受體介導(dǎo)的固有免疫激活能抑制人肝細(xì)胞衍生細(xì)胞中HBV的復(fù)制,例如視黃酸誘導(dǎo)型基因Ⅰ(RIG-1)和Toll樣受體(TLR)[22]。RIG-Ⅰ激動(dòng)劑inarigivir激活I(lǐng)FN信號通路，進(jìn)而引起宿主對HBV的天然IFN反應(yīng)，一項(xiàng)臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示其能有效降低HBV DNA和HBV RNA水平，并使部分患者HBsAg水平出現(xiàn)下降[13]。GS-9620能激活TLR-7信號，一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GS-9620能促進(jìn)IFN-α等細(xì)胞因子產(chǎn)生，進(jìn)而激活I(lǐng)FN刺激基因、T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，誘導(dǎo)HBV感染的肝細(xì)胞凋亡，使血清HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平降低[23]。而在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，GS-9620雖然表現(xiàn)出良好的安全性，但其抗病毒效果不佳，可能與給藥劑量太低有關(guān)[7,24]。GS-9688是TLR-8的激動(dòng)劑,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都顯示出其具有良好的抗HBV療效,有關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)正在開展中[30-31]。

(2)激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)：免疫檢查點(diǎn)[包括程序性死亡受體-1(PD-1)]抑制劑在惡性腫瘤中的成功應(yīng)用證實(shí)了其在激活人體特異性免疫并清除病原體成分的關(guān)鍵作用?？筆D-1療法已被證實(shí)能夠使受損的HBV特異性T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞反應(yīng)部分恢復(fù)[7]。這些都為靶向PD-1作為抗HBV藥物的新開發(fā)策略提供了理論支持。與此同時(shí)，一些針對HBV治療性疫苗的研究也正在開展中。其中，基于腺病毒的HBV治療性疫苗TG1050表達(dá)HBV聚合酶及核心和表面抗原域，臨床試驗(yàn)證實(shí)其能夠誘導(dǎo)HBV特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)且具有良好的安全性[27]。應(yīng)用基因工程技術(shù)同樣能有效激活適應(yīng)性免疫，靶向HBV的嵌合抗原受體T細(xì)胞(TCR-T)或T細(xì)胞受體嵌合型T細(xì)胞(CAR-T)療法能夠解決HBV感染患者的T淋巴細(xì)胞受損問題，并有效控制HBV感染，但還需要進(jìn)一步研究攻克該療法的技術(shù)難關(guān)以開展相關(guān)的臨床試驗(yàn)[10]。

三、總結(jié)與展望

目前抗HBV藥物IFN-α和NAs雖能控制HBV復(fù)制，但很少能實(shí)現(xiàn)功能性治愈，且長期使用也會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生不良反應(yīng)與耐藥突變的問題。完全抑制病毒的感染與產(chǎn)生和HBsAg的生成與釋放并適當(dāng)激活免疫系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)HBV功能性治愈需達(dá)到的目標(biāo)[7]。研究人員正在不斷地攻克這一難關(guān)，開發(fā)出針對HBV生活周期與免疫調(diào)控的以治愈為目標(biāo)的創(chuàng)新療法。最近已研發(fā)出針對cccDNA的產(chǎn)生、穩(wěn)態(tài)、降解及病毒復(fù)制周期的其他干涉治療手段[6]，不少抗HBV新藥也已進(jìn)入臨床試驗(yàn)并展現(xiàn)出良好的安全性與抗病毒活性(表1)。我們期待HBV感染功能性治愈這一目標(biāo)能夠早日實(shí)現(xiàn)。