畢永華，伊夢(mèng)飛，陳紅梅，韓新巍，任建莊，尉澤鵬

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射介入科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院超聲科 鄭州 450052

小動(dòng)物腹主動(dòng)脈瘤(abdominal aortic aneurysm, AAA)模型常用于研究AAA的發(fā)病機(jī)制[1-4]。彈性蛋白酶誘導(dǎo)的AAA模型是大鼠和兔最常用的模型之一。然而，由于需要經(jīng)髂總動(dòng)脈插管，建模手術(shù)操作復(fù)雜，而且在灌注過(guò)程中可能出現(xiàn)彈性蛋白酶液滲漏進(jìn)入血液，造成動(dòng)物死亡。主動(dòng)脈周彈性蛋白酶浸潤(rùn)也可誘發(fā)兔頸動(dòng)脈AAA形成，但需要1～3 h，由于手術(shù)時(shí)間較長(zhǎng)，可能導(dǎo)致高死亡率和手術(shù)失敗。此外，日本學(xué)者Origuchi等[5]發(fā)現(xiàn)彈性蛋白酶浸潤(rùn)的兔AAA模型存在自愈現(xiàn)象。另一種常見(jiàn)的AAA模型是通過(guò)氯化鈣誘導(dǎo)，但I(xiàn)senburg等[6]認(rèn)為即使采用直徑增大20%的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)定義AAA，仍只有2/3的大鼠可見(jiàn)AAA形成。彈性蛋白酶或氯化鈣都通過(guò)誘導(dǎo)主動(dòng)脈壁炎癥，進(jìn)而破壞主動(dòng)脈壁形成AAA。木瓜蛋白酶是木瓜乳膠中提取的一種酶，具有很強(qiáng)的彈性蛋白分解能力，可以破壞血管壁。研究[7]發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶能夠誘導(dǎo)兔頸動(dòng)脈形成囊狀動(dòng)脈瘤。作者通過(guò)木瓜蛋白酶浸潤(rùn)主動(dòng)脈周簡(jiǎn)化AAA建模操作，大大縮短酶浸潤(rùn)所需的時(shí)間，以期為動(dòng)脈瘤機(jī)制的研究提供新的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與主要試劑新西蘭大白兔16只，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重(2.06±0.33) kg。木瓜蛋白酶緩沖液(美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品)；小鼠抗兔巨噬細(xì)胞單克隆抗體RAM11購(gòu)自丹麥Dako公司；小鼠抗兔MMP9單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司；小鼠抗兔α-平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組與AAA模型的建立16只大白兔分為兩組，每組8只。經(jīng)耳緣靜脈按30 mg/kg注射戊巴比妥鈉麻醉大白兔。經(jīng)腹部正中線剖腹，游離出主動(dòng)脈分叉近端長(zhǎng)約1 cm的主動(dòng)脈段。實(shí)驗(yàn)組采用25 g/L木瓜蛋白酶緩沖液80 μL浸潤(rùn)20 min。生理鹽水沖洗2次，清除殘存的木瓜蛋白酶。對(duì)照組采用80 μL生理鹽水浸潤(rùn)20 min。本研究通過(guò)鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3彩色多普勒超聲檢查術(shù)后第5天和第21天兩組各取4只大白兔進(jìn)行彩色多普勒超聲檢查，測(cè)量浸潤(rùn)段主動(dòng)脈的內(nèi)徑變化。主動(dòng)脈內(nèi)徑增大至術(shù)前的1.5倍以上認(rèn)為AAA形成。

1.4組織病理學(xué)觀察超聲檢查后處死大白兔，取浸潤(rùn)段主動(dòng)脈標(biāo)本組織。體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，5 μm厚切片，EVG染色。采用Image J 1.41 軟件分析，計(jì)算彈力纖維占主動(dòng)脈壁中膜面積的百分比，以此表示彈力纖維面積百分比。

1.5MMP9、RAM11和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)的檢測(cè)采用免疫組化SP法檢測(cè)。取浸潤(rùn)段主動(dòng)脈標(biāo)本，以體積分?jǐn)?shù)1%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，分別加入一抗RAM11(稀釋100倍)和MMP9抗體(稀釋300倍)4 ℃孵育過(guò)夜。PBS清洗3遍，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色染色為陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。顯微鏡下(×200)觀察α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的檢測(cè)采用免疫熒光染色法。浸潤(rùn)段主動(dòng)脈組織石蠟標(biāo)本切片、脫蠟、脫苯、水化后，以體積分?jǐn)?shù)1%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。采用體積分?jǐn)?shù)10%山羊血清封閉，加抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白一抗(稀釋150倍)4 ℃孵育過(guò)夜，加入FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG。采用Image J軟件分析，計(jì)算α-平滑肌肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性染色面積占主動(dòng)脈壁面積的百分比，以此表示平滑肌細(xì)胞面積百分比。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0進(jìn)行分析。兩組大白兔術(shù)后第5天和第21天浸潤(rùn)段主動(dòng)脈內(nèi)徑、彈力纖維和平滑肌細(xì)胞面積百分比的比較采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1兩組大白兔浸潤(rùn)段主動(dòng)脈的變化術(shù)后第5天實(shí)驗(yàn)組大白兔浸潤(rùn)段主動(dòng)脈均形成AAA，彩超檢查可見(jiàn)瘤腔內(nèi)血流紊亂，呈五彩色湍流信號(hào)，直徑增大53.8%～100.0%。對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)AAA形成，彩超顯示血流正常，未見(jiàn)湍流形成。兩組大白兔浸潤(rùn)段主動(dòng)脈內(nèi)徑變化的比較見(jiàn)表1。

表1 兩組大白兔浸潤(rùn)段主動(dòng)脈內(nèi)徑的比較 mm

2.2兩組大白兔浸潤(rùn)段主動(dòng)脈病理組織學(xué)變化見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈壁變薄、紊亂，伴瘤內(nèi)血栓形成，彈力纖維層嚴(yán)重破壞；術(shù)后第5天殘留的彈力纖維層變??；術(shù)后第21天主動(dòng)脈中膜增厚、可見(jiàn)斷裂的彈力纖維，內(nèi)膜增生明顯、可見(jiàn)少量新生的彈力纖維，但排列紊亂，平滑肌細(xì)胞可見(jiàn)部分再生。對(duì)照組主動(dòng)脈壁規(guī)則，中膜彈力纖維層排列規(guī)則，內(nèi)外彈力纖維板完整，其彈力纖維無(wú)明顯變化。兩組大白兔浸潤(rùn)段主動(dòng)脈彈力纖維和平滑肌細(xì)胞面積百分比的比較見(jiàn)表2。

A：實(shí)驗(yàn)組;B：對(duì)照組

表2 兩組大白兔浸潤(rùn)段主動(dòng)脈彈力纖維和平滑肌細(xì)胞面積百分比比較 %

2.3兩組大白兔浸潤(rùn)段主動(dòng)脈MMP9和RAM11的表達(dá)見(jiàn)圖2。術(shù)后第5天實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈壁MMP9表達(dá)升高，第21天呈中度表達(dá)；術(shù)后第21天對(duì)照組未見(jiàn)MMP9表達(dá)。術(shù)后第5天實(shí)驗(yàn)組RAM11呈中度表達(dá)，第21天時(shí)表達(dá)下降，幾乎僅局限于血管外膜；對(duì)照組RAM11幾乎不表達(dá)，術(shù)后第21天僅在外膜中可見(jiàn)較弱表達(dá)。

A：MMP9;B：RAM11

3 討論

我們通過(guò)主動(dòng)脈周?chē)?rùn)2 mg木瓜蛋白酶20 min成功建立兔新型AAA模型。AAA特征性表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)降解、中層破壞、MMPs和炎癥因子表達(dá)上調(diào)。本研究結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)彈力纖維和中膜破壞以及平滑肌細(xì)胞減少；免疫組化染色顯示實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第5天內(nèi)源性MMP9的表達(dá)上升，符合AAA的特征性表現(xiàn)。

AAA模型最常見(jiàn)的建模方法是動(dòng)脈腔內(nèi)灌注豬胰彈性蛋白酶溶液[1-4]。主動(dòng)脈周浸潤(rùn)氯化鈣或彈性蛋白酶也很多見(jiàn)。此外，國(guó)外作者[7]首次采用動(dòng)脈腔內(nèi)灌注木瓜蛋白酶成功誘導(dǎo)兔頸總動(dòng)脈囊狀動(dòng)脈瘤形成。本研究首次采用主動(dòng)脈周木瓜蛋白酶浸潤(rùn)法成功誘導(dǎo)兔AAA形成。該建模方法浸潤(rùn)時(shí)間為20 min，明顯短于彈性蛋白酶浸潤(rùn)法所需的時(shí)間(1～3 h)，有利于提高建模成功率。采用主動(dòng)脈周浸潤(rùn)法建模，不需要穿刺血管、阻斷血流，建模操作大大簡(jiǎn)化，明顯優(yōu)于動(dòng)脈腔內(nèi)彈性蛋白酶灌注法。后者需要穿刺髂總動(dòng)脈并插管，暫時(shí)阻斷腹主動(dòng)脈血流，灌注時(shí)還需要避免彈性蛋白酶滲漏進(jìn)入血液，造成動(dòng)物死亡。此外，瘤內(nèi)血栓可能在AAA發(fā)病機(jī)制和動(dòng)脈瘤破裂中起作用，但在彈性蛋白酶誘導(dǎo)的模型中卻鮮有報(bào)道。本研究可見(jiàn)血栓形成，這與文獻(xiàn)[7]的報(bào)道類似，有助于對(duì)瘤內(nèi)血栓與AAA機(jī)制的關(guān)系進(jìn)一步深入研究。

日本學(xué)者Origuchi等[5]報(bào)道，主動(dòng)脈周彈性蛋白酶浸潤(rùn)誘導(dǎo)的兔AAA，術(shù)后6周后直徑逐漸回縮，3個(gè)月后可自我愈合，恢復(fù)正常主動(dòng)脈形態(tài)，這與人AAA疾病有很大不同。然而，Ding等[8-9]認(rèn)為彈性蛋白酶誘導(dǎo)的頸動(dòng)脈瘤模型的長(zhǎng)期通暢性良好，并未發(fā)現(xiàn)自愈現(xiàn)象。本研究的動(dòng)脈瘤模型在5 d后仍可見(jiàn)進(jìn)展，這與Origuchi等[5]的結(jié)果有所不同。然而，本研究?jī)H觀察到21 d，需進(jìn)一步的長(zhǎng)期隨訪研究。另外，動(dòng)脈粥樣硬化是人AAA的主要發(fā)病機(jī)制，其他危險(xiǎn)因素也與人AAA的形成和發(fā)展有關(guān)，本模型無(wú)法評(píng)估動(dòng)脈粥樣硬化等因素的影響。

總之，我們提出了一種新的AAA建模方法，該方法簡(jiǎn)單、有效，將有助于闡明動(dòng)脈瘤疾病的發(fā)病機(jī)制。