徐紀(jì)中，袁維堂，王貴憲，周全博，胡晟云

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科 鄭州 450052

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是臨床常見消化道惡性腫瘤。據(jù)調(diào)查[1]，世界范圍內(nèi)CRC每年新發(fā)病例約800萬，發(fā)病率和死亡率均位居惡性腫瘤前列，近年來隨著人們生活節(jié)奏的加快及飲食結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病率呈逐年升高趨勢。CRC起病隱匿，早期癥狀不典型，故多數(shù)患者確診時(shí)已至局部晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，尤其以肝轉(zhuǎn)移最為常見，導(dǎo)致根治術(shù)、放化療效果不理想，預(yù)后較差[2]。隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，人們發(fā)現(xiàn)抑癌基因失活及凋亡抑制基因過度表達(dá)在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。脆性組氨酸三聯(lián)體(fragile histidine triad,FHIT)基因是一種包含人類染色體脆性位點(diǎn)的抑癌基因，目前已有報(bào)道[3]其在肺癌、胃癌等多種惡性腫瘤組織中異常表達(dá)。另有研究[4]表明，凋亡抑制蛋白Apollon過度表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞的惡性變。FHIT和Apollon蛋白在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中均起重要作用，但關(guān)于其對(duì)CRC轉(zhuǎn)移病程影響的研究尚少。本研究對(duì)既往收治的163例CRC患者的臨床資料進(jìn)行回顧，分析FHIT和Apollon蛋白在CRC組織中的表達(dá)情況，重點(diǎn)探討其與CRC轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象回顧性分析2012年7月至2014年6月我院收治的163例CRC患者的臨床資料。其中男84例，女79例；年齡35～71(58.7±6.2)歲；腫瘤部位：結(jié)腸138例，直腸25例；腫瘤直徑≤5 cm者92例，>5 cm者71例；分化程度：高分化72例，中分化59例，低分化32例；浸潤深度：肌層65例，漿膜外60例，漿膜層38例；Dukes分期：A、B期46例，C、D期117例；組織學(xué)分型：管狀/乳頭狀腺癌118例，黏液腺癌30例，印戒細(xì)胞癌15例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移117例；有同時(shí)性結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移(SCRLM)93例，無SCRLM 70例。研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

CRC患者均符合以下納排標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①接受CRC根治術(shù)治療。②術(shù)后病理檢測確診為CRC，SCRLM經(jīng)病理學(xué)檢查肝轉(zhuǎn)移灶來源于CRC。③術(shù)前均未進(jìn)行化療。④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位原發(fā)性惡性腫瘤。②術(shù)后隨訪資料缺失。③有嚴(yán)重貧血、感染或凝血功能障礙。

1.2FHIT及Apollon蛋白表達(dá)的檢測收集CRC癌組織、癌旁組織(距離病灶<3 cm，非正常組織)，均采用體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛固定，修整為1 cm3組織塊，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯固定后，石蠟包埋，制作4 μm厚連續(xù)切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、熱修復(fù)后，用體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫孵育，PBS洗滌，封閉液封閉；每張切片加入1∶100稀釋的兔抗人FHIT、Apollon多抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)37 ℃孵育1 h，加入生物素標(biāo)記的二抗繼續(xù)孵育30 min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。FHIT蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，Apollon蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核。采用雙評(píng)分半定量分析法[5]判定蛋白表達(dá)情況。200倍鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野：按染色強(qiáng)度評(píng)分，無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評(píng)分，無陽性細(xì)胞為0分，≤10%為1分，≤50%且>10%為2分，≤75%且>50%為3分，>75%為4分。兩項(xiàng)評(píng)分乘積≤1判定為陰性，≥2判定為陽性。

1.3資料的收集及分析收集CRC患者性別、年齡、腫瘤部位、分化程度等臨床及病理資料。采用門診或電話方式進(jìn)行隨訪，以接受手術(shù)治療為隨訪起始時(shí)間，以患者死亡、失訪或研究截止時(shí)間(2019年7月)為終點(diǎn)事件，計(jì)算總生存時(shí)間。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0分析處理數(shù)據(jù)。CRC及癌旁組織中FHIT、Apollon陽性率的比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，不同臨床病理特征CRC組織中FHIT、Apollon陽性率的比較采用χ2檢驗(yàn)或精確概率法，采用列聯(lián)系數(shù)c評(píng)估CRC組織中FHIT、Apollon表達(dá)的關(guān)聯(lián)性；采用Kaplan-Meier法繪制不同F(xiàn)HIT、Apollon表達(dá)特征的CRC患者的生存曲線并進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1CRC組織中FHIT及Apollon蛋白的表達(dá)CRC組織中，F(xiàn)HIT和Apollon蛋白陽性率分別為32.5%和84.7%，癌旁組織中分別為67.5%和48.5%。與癌旁組織比較，CRC組織中FHIT蛋白陽性率降低，Apollon蛋白陽性率升高，見表1、2。CRC組織中FHIT與Apollon蛋白表達(dá)存在負(fù)關(guān)聯(lián),見表3。

表1 CRC與癌旁組織中FHIT蛋白表達(dá)的比較 例

表2 CRC與癌旁組織中Apollon蛋白表達(dá)的比較 例

表3 CRC組織中FHIT與Apollon蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性分析 例

2.2不同臨床病理特征CRC組織中FHIT及Apollon蛋白表達(dá)的比較與浸潤至肌層或漿膜外、Dukes分期A或B期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無SCRLM者比較，浸潤至漿膜層、Dukes分期C或D期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有SCRLM的CRC組織中FHIT陽性率降低，Apollon陽性率升高(P<0.05)；而不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、組織學(xué)分型、大便隱血試驗(yàn)狀態(tài)、HBsAg狀態(tài)及腹腔積液狀態(tài)的患者FHIT、Apollon陽性率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 不同臨床病理參數(shù)CRC組織中FHIT及Apollon蛋白表達(dá)的比較 例(%)

續(xù)表4

2.3FHIT、Apollon表達(dá)與CRC預(yù)后的關(guān)系163例生存曲線見圖1。FHIT+Apollon-患者預(yù)后優(yōu)于FHIT+Apollon+患者(χ2=10.765，P<0.001)；FHIT-Apollon+、FHIT-Apollon-患者預(yù)后差于FHIT+Apollon+患者(χ2=9.154、12.130，P<0.001)；FHIT-Apollon+與FHIT-Apollon-患者生存曲線比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.205，P=0.651)。

圖1 不同F(xiàn)HIT、Apollon表達(dá)狀態(tài)的CRC患者的生存曲線

3 討論

CRC屬于結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞惡性腫瘤，其發(fā)病原因與不良生活習(xí)慣、遺傳及環(huán)境因素等關(guān)系密切[6]。由于腸道血供及淋巴回流豐富，CRC細(xì)胞更易通過血液及淋巴循環(huán)發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致多數(shù)患者確診時(shí)已失去最佳治療時(shí)機(jī)，預(yù)后差[7]。因此，急需尋找可早期預(yù)測CRC復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，以便能及時(shí)有效干預(yù)，改善患者預(yù)后，延長生存期。

FHIT蛋白是三聯(lián)組氨酸家族重要成員，生理狀態(tài)下可在機(jī)體多種組織中表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)CRC組織中FHIT蛋白陽性率低于癌旁組織，Apollon陽性率高于癌旁組織，提示FHIT蛋白表達(dá)缺失或Apollon蛋白表達(dá)增強(qiáng)與CRC的發(fā)生關(guān)系密切。Zheng等[8]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HIT在胃癌中的表達(dá)水平低于正常胃黏膜組織，且其表達(dá)水平與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移及分化程度負(fù)相關(guān)。Apollon是凋亡抑制蛋白家族中相對(duì)分子質(zhì)量最大的蛋白，其特有結(jié)構(gòu)域桿狀病毒IAP重復(fù)序列(BIR)可與Caspase-9、Smac結(jié)合并促進(jìn)其降解，從而抑制Caspase-9前體活化，抑制凋亡信號(hào)啟動(dòng)，從而有利于癌細(xì)胞的無限增殖、轉(zhuǎn)移等過程[9]。本研究中與浸潤至肌層或漿膜外、Dukes分期A或B期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無SCRLM者比較，浸潤至漿膜層、Dukes分期C或D期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有SCRLM的CRC組織中FHIT陽性率降低，Apollon陽性率升高，提示FHIT蛋白表達(dá)異常降低或Apollon蛋白表達(dá)異常升高均有利于CRC細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。

Druck等[10]研究表明，F(xiàn)HIT可通過死亡受體途徑和線粒體依賴凋亡蛋白酶活化因子(Apaf)-1/Caspase-9兩種信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；FHIT蛋白具有顯著的抑癌作用，但其作用機(jī)制尚不明確，有研究[11-12]認(rèn)為與FHIT具有二腺苷三磷酸(Ap3A)水解酶、mRNA脫帽、形成FHIT底物復(fù)合物等多種因素有關(guān)。而Apollon可促進(jìn)Caspase-9降解，從而抑制凋亡進(jìn)程；兩者可能存在負(fù)調(diào)節(jié)及相互抑制的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，CRC組織中FHIT與Apollon蛋白表達(dá)存在較微弱的負(fù)向關(guān)聯(lián)性。

禹志韞等[13]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HIT陽性宮頸癌患者1 a生存率明顯高于FHIT陰性患者，提示FHIT與腫瘤預(yù)后關(guān)系密切。吳玨堃等[14]采用小干擾RNA法敲低乳腺癌MCF-7細(xì)胞Apollon基因，結(jié)果顯示低表達(dá)Apollon基因的乳腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性增強(qiáng)，提示Apollon與腫瘤治療轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切。本研究經(jīng)Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HIT陰性表達(dá)(FHIT-Apollon+、FHIT-Apollon-)患者的預(yù)后均差于陽性表達(dá)(FHIT+Apollon+、FHIT+Apollon-)者;Apollon陽性表達(dá)(FHIT-Apollon+)患者預(yù)后差于陰性表達(dá)(FHIT+Apollon-)者;進(jìn)一步證實(shí)FHIT蛋白低表達(dá)和Apollon蛋白高表達(dá)不利于CRC的預(yù)后轉(zhuǎn)歸。

綜上所述，F(xiàn)HIT和Apollon蛋白在CRC組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，兩者的表達(dá)與CRC侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系密切，可作為預(yù)測CRC轉(zhuǎn)移及預(yù)后的可靠標(biāo)志物；臨床上可通過靶向調(diào)控FHIT與Apollon的表達(dá)，調(diào)控CRC細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等過程。本研究的不足之處在于，納入研究對(duì)象較少，隨訪時(shí)間較短。我們進(jìn)一步將擴(kuò)大樣本量，開展多中心、高質(zhì)量隨機(jī)對(duì)照研究，以證實(shí)本研究結(jié)果的穩(wěn)定性和正確性，為CRC臨床治療提供一定理論依據(jù)。