勞 軍，王楠楠

(吉林化工學院 生物與食品工程學院，吉林 吉林 132022)

黃芪(Astragalusmembranaceus)為豆科屬多年生草本植物，是較為常見的一種中草藥，其藥用部分為根部，由于含有多糖、皂苷及酚類等成分，因此可以用來保肝、抗氧化，刺激免疫系統(tǒng)和抗病毒等[1-2].其中黃芪多糖可以用來抗氧化自由基、降低血糖和延緩衰老.在黃芪中的多糖可以分為水溶性多糖和水不溶性多糖，而其水溶性多糖中含有葡萄糖、果糖以及半乳糖等，常用來止汗、抗腫瘤以及調(diào)節(jié)免疫等[3].目前關于黃芪的水溶性多糖的研究報道很多，而對其水溶性多糖在細胞內(nèi)的抗氧化活性研究較少.因此本文通過水提醇沉法提取黃芪水溶性多糖，用DPPH法研究其體外抗氧化活性，同時也用DCFH-DA法檢測了其在胞內(nèi)抗氧化活性，并進一步用MTT法探索了其對H2O2損傷細胞模型的保護作用.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

實驗用黃芪為市售，購自于吉林大藥房，烘干后研磨成粉.無水乙醇(天津永大化學試劑公司)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(天津凱信化學試劑公司)、2,7-二氯二氫熒光素乙酰乙酯(DCF-DA)(蘇州宇恒生物科技有限公司)

實驗所用儀器主要有紫外可見分光度計(TU-1901)、電熱恒溫干燥箱(DHG-9245A)、離心機(PDZ5-WS)、CO2培養(yǎng)箱(LS-C0150)、細胞成像微孔板檢測系統(tǒng)(170524B).

1.2 實驗過程

(1)黃芪水溶性多糖的提取

采用水提醇沉淀法，稱取100 g黃芪粉，加適量的水定容于900 mL，水浴加熱至70 ℃.維持100 min之后，加300 ml 75%乙醇沉淀多糖物質(zhì)，3 000 rpm，離心10 min之后，所得沉淀即為黃芪粗多糖[4].

(2)DPPH法對不同濃度黃芪多糖清除自由基能力的測定

將上述黃芪多糖配成10、25、50、75、100 mg/mL的溶液，對照組加入50 μL水、2 mL DPPH溶液和 950 μL 95%乙醇；實驗組分別加入不同濃度50 μL黃芪多糖溶液、2 mL DPPH溶液和950 μL 95%乙醇；混合后搖勻，靜止30 min.在分光光度計517 nm處測出每組的吸光度值代入如下公式[5]：

自由基的清除率=(A0-A)/A0 ×100%(A0代表對照組，A代表實驗組)

從而計算出黃芪多糖對DPPH自由基的清除率

(3)H2O2對細胞損傷模型的建立及黃芪多糖對細胞活力作用的測定

取生長狀態(tài)良好的SH-SY5Y細胞按照每孔1×104均勻鋪到96孔板中，待細胞形態(tài)良好后，用0、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 μM H2O2和0、10、25、50、75、100 mg/mL黃芪多糖分別處理細胞，每個濃度和空白組設置三個復孔，處理24 h后，加入100 μL不完全培養(yǎng)基和10 μL 0.5 mg/mL MTT，在37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，在酶標儀570 nm波長下檢測細胞的吸光度.

(4)黃芪多糖對H2O2處理的細胞ROS生成率的影響[6]

將DCFH-DA溶于甲醇中配成1 M的儲備液.取生長狀態(tài)良好的SH-SY5Y細胞按照每孔1×104均勻鋪到96孔板中，待細胞形態(tài)良好后，以PBS洗滌細胞3次,加入200 μL0、10、25、50、75、100 mg/mL黃芪多糖溶液,于37 ℃ 下放置2 h，去除上清液，加入10 μL 0 μL不完全培養(yǎng)基，再加入H2O2終濃度為200 μM培養(yǎng)24 h之后，去除上清液，再加入95 μL的PBS和5 μL DCFH-DA,37 ℃孵育45 min,在酶標儀上激發(fā)光488 nm，發(fā)射波長525 nm進行檢測.

(5)黃芪多糖對H2O2損傷細胞的保護作用測定

取生長狀態(tài)良好的SH-SY5Y細胞按照每孔1×104均勻鋪到96孔板中，待細胞形態(tài)良好后，以PBS洗滌細胞3次,分別加入200 μL0、10、25、50、75、100 mg/mL黃芪多糖溶液,于37 ℃下對細胞分別預處理3、6和12 h之后，去除上清液，加入100 μL不完全培養(yǎng)基，再加入H2O2終濃度為200 μM培養(yǎng)24 h之后，用MTT檢測細胞活力，方法同上.

(6)統(tǒng)計學分析

使用Graphpad prism 7.0進行統(tǒng)計學分析，兩組間分析使用t檢驗，組間分析使用軟件進行One-Way ANOVA分析，P<0.05說明數(shù)據(jù)存在的差異性.

2 結果與討論

2.1 黃芪多糖在細胞外清除自由基的能力

在體外不同濃度的黃芪多糖對自由基的清除能力如圖1所示，在黃芪多糖濃度低于50 mg/mL時，隨著濃度不斷增加，對自由基的清除率也不斷升高；當濃度達到50 mg/mL時，清除率可達(72.3±1.7)%；濃度達100 mg/mL時，清除率可達(73.1±2.8)%，對自由基的清除率上升幅度不大，達到了一個平臺期.

黃芪多糖濃度/(mg·mL-1)

2.2 黃芪多糖在細胞內(nèi)的抗氧化結果

2.2.1 H2O2及黃芪多糖對細胞活力作用的測定

H2O2是一種強氧化劑,是最常用的建立細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生模型的試劑，進入細胞培養(yǎng)液后,會直接攻擊細胞上的蛋白質(zhì)、脂類,破壞膜系的完整性,從而造成細胞連續(xù)受損而壞死[7].本實驗中,在細胞培養(yǎng)過程中加入外源性的 H2O2,通過MTT法檢測H2O2對細胞活力的影響，結果見圖2.

H2O2濃度/μM

圖2表明SH-SY5Y細胞經(jīng)H2O2處理后細胞活力明顯下降，表明細胞受到損傷或者部分已經(jīng)死亡，在12.5～800 μM濃度范圍內(nèi)，隨著H2O2濃度升高，細胞活力呈梯度下降，與對照組相比具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，當H2O2濃度為200 μM時細胞活力達到(55±1.52)%，與H2O2其它濃度的細胞活力相比之下較為適中，故選擇200 μM H2O2作為建立氧化損傷模型的最佳濃度.同時，通過MTT檢測了不同濃度的黃芪多糖對SH-SY5Y細胞活力的影響，如圖3所示，黃芪多糖對細胞活力的影響不大，隨著其濃度的升高，細胞活力略微下降，當濃度達到100 mg/mL，細胞活力仍在95%以上.

黃芪多糖濃度/(mg·mL-1)

2.2.2 黃芪多糖細胞內(nèi)抗氧化實驗結果

DCFH-DA 是可穿透細胞的非熒光性物質(zhì),能夠被細胞中的ROS 所氧化.進入細胞以后,經(jīng)過細胞的脂酶作用脫去二乙?；煞菬晒獾?′,7′-二氯氫化熒光素(DCFH),DCFH 被細胞內(nèi)的活性氧氧化以后生成發(fā)熒光的2′,7′-二氯熒光素(DCF),因此通過檢測熒光的強度可以判斷細胞的氧化程度[8].黃芪多糖對細胞內(nèi)ROS的清除率結果如圖4所示，圖4表明用200 μM H2O2處理細胞，胞內(nèi)產(chǎn)生ROS.經(jīng)過黃芪多糖預處理的細胞，能夠清除胞內(nèi)的ROS；并且預處理的黃芩多糖濃度越大，對ROS自由基的清除率也增大.當黃芪多糖濃度到達75 mg/mL時，對ROS自由基的清除率達到(53.33±5.24)%；而當黃芪多糖濃度到達100 mg/mL時，對ROS自由基的清除率達到(53.67±2.33)%，對自由基清除率變化不大，從而達到一個平臺期.

黃芪多糖濃度/(mg·mL-1)

2.2.3 黃芪多糖對H2O2損傷的SH-SY5Y細胞活力的影響

為了考察黃芪多糖對H2O2損傷SH-SY5Y細胞的活力作用情況，本文用黃芪多糖分別在0、10、25、50、75、100 mg/mL的濃度下，分別預處理SH-SY5Y細胞3 h、6 h和12 h之后，用H2O2作用SH-SY5Y細胞24 h之后，使用MTT檢測其細胞活力，結果見圖5.圖5表明在濃度75、100 mg/mL處理3 h后細胞活力均高于其他濃度和處理時間的細胞活力，其中濃度在75 mg/mL下細胞活力最高；兩者與其對照組相比較具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，表明對H2O2損傷的細胞具有一定的保護作用，這與黃芪多糖清除細胞內(nèi)活性氧結果相對應，而其他濃度預處理3 h、6 h和12 h的細胞活力與其各自的對照組相比較，沒有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.05)表明對細胞無保護作用，這可能是由于黃芪多糖長時間處理細胞會產(chǎn)生一定的毒性.

黃芪多糖濃度/(mg·mL-1)

3 結 論

任何產(chǎn)生未成對電子的原子或原子團就會成為自由基，而自由基在細胞內(nèi)會損壞一些重要的生物大分子，從而引起一系列的疾病[9-11].因此尋找一些抗氧化清除自由基的天然藥物很重要.在人體中，氧衍生的自由基是非常主要的自由基來源.例如超氧陰離子和羥基自由基[12]，通常統(tǒng)稱為活性氧(ROS)，H2O2是活性氧(ROS)的主要成分之一，可以跨膜擴散進入到細胞內(nèi)，是目前比較常用的細胞氧化應激的誘導劑，常用來誘導細胞氧化應激損傷模型的建立[13-14].現(xiàn)有的研究已經(jīng)證明，黃芪多糖具有一定的抗氧化能力，同時認為在清除自由基方面高于公認的維生素C[15]，在本文中黃芪多糖不僅能夠降低細胞內(nèi)的活性氧，而且能夠對H2O2氧化損傷的細胞具有一定的保護力，這說明黃芪多糖具有開發(fā)成抗氧化清除自由基藥物的潛力.

本試驗對黃芪多糖在體外和細胞內(nèi)的抗氧化清除自由基的能力進行了研究，研究表明黃芪多糖在體外抗氧化清除自由基的最佳濃度為75 mg/mL.在對H2O2損傷的SH-SY5Y細胞保護作用研究中，發(fā)現(xiàn)75 mg/mL 作用3 h保護作用最佳.