馮庭輝，賈巧君，郭暉，金美艷，陳喜良，劉峰，梁宗鎖*

(1.浙江理工大學 生命科學與醫(yī)藥學院，浙江 杭州 310018； 2.新鄉(xiāng)學院 生命科學學院，河南 新鄉(xiāng) 453000；3.浙江萬壽康生物科技有限公司，浙江 武義 321200； 4.陜西步長制藥集團公司，陜西 西安 710000)

黃精藥材為天門冬科(Asparagaceae Juss.)黃精屬(PolygonatumMill.)黃精(PolygonatumsibiricumRed.)的干燥根莖。黃精是傳統(tǒng)的藥食同源中藥[1-2]，味甘、性平、無毒，主要分布于甘肅和陜西，特別是在秦嶺地區(qū)蘊藏量極大[3]。黃精的藥用歷史已有2 000多年，其根入藥性平而潤，味甘而淡，可補中益氣、定肝膽、潤心肺[4-5]?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，黃精具有提高免疫系統(tǒng)功能、抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、強心、降血脂等藥理作用[6-10]。在我國古代，黃精就被作為“長生不老”和“延年益壽”的藥用植物而被使用和認知[11]。

目前，關于黃精化學成分的研究主要集中在多糖上[12]，對黃精多酚的研究報道較少[13-15]。植物多酚具有抗氧化、預防心血管疾病、抗癌、抗菌消炎、抗病毒等作用[16-19]。目前，黃精多酚的提取多以乙醇為溶劑，采用超聲波輔助提取的工藝報道較少見[20-21]，且不同研究的黃精多酚得率相差較多:吳其國等[20]研究了安徽不同產(chǎn)地野生與栽培多花黃精的總酚含量，在3.46～5.22 mg·g-1；焦劼等[21]報道不同產(chǎn)地黃精總酚含量呈正態(tài)分布。但在本研究范圍內(nèi)，關于黃精總酚提取工藝中各項參數(shù)對提取效果的影響尚未見報道。

響應面分析法通過建立數(shù)學模型能夠精確地計算出各個因素對研究目標的響應值[22]，被越來越多的中藥材成分提取優(yōu)化研究所使用，如解紅霞等[23]利用響應面法優(yōu)化芹葉鐵線蓮中總皂苷的提取工藝等。本研究在單因素試驗基礎上，選取溫度、超聲時間和超聲次數(shù)3個主要因素，采用響應面分析法，以黃精總酚得率為響應值，對其提取工藝進行優(yōu)化，以期為黃精多酚的提取研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃精藥材，陜西略陽黃精GAP(中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范)基地提供，經(jīng)浙江理工大學生命科學與醫(yī)藥學院浙江次生代謝重點實驗室鑒定為天門冬科植物黃精的干燥根莖。

無水乙醇，杭州高晶精細化工有限公司；沒食子酸，上海源葉生物科技有限公司；福林酚顯色劑，北京索萊寶科技有限公司；Na2CO3，杭州高晶精細化工有限公司。所有分離用有機溶劑均為分析純。

全自動酶標儀，美國BioTek；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；400g搖擺式高速中藥粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司；精密可編程熱風循環(huán)烘箱，立德泰勀(上海)科學儀器有限公司；純水儀。

1.2 黃精總酚的提取與測定

精確稱取黃精細粉0.5 g于試管中，加入一定量不同體積分數(shù)的乙醇，超聲(250 W，40 kHz)提取一定時間，離心，分離上清液與底部黃精粉，在剩余黃精粉中加入70%(體積分數(shù))乙醇，進行下一次超聲提取。反復提取3次，合并濾液。準確吸取40 μL，依次加入3.2 mL蒸餾水、200 μL福林酚顯色劑，充分振蕩后靜置6～8 min，加入500 μL 15%(質(zhì)量分數(shù))Na2CO3溶液，搖勻后在室溫下避光放置，反應2 h，在765 nm波長處測定吸光值。

1.3 單因素試驗設計

1.3.1 料液比對提取率的影響

在乙醇體積分數(shù)為70%、提取溫度為30 ℃、超聲30 min、超聲次數(shù)為3次的條件下，將料液比分別設定為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80，探索料液比對黃精總酚提取率的影響。

1.3.2 乙醇體積分數(shù)對提取率的影響

在提取溫度為30 ℃、料液比為1∶50、超聲30 min、超聲次數(shù)為3次的條件下，將乙醇體積分數(shù)分別設定為40%、50%、60%、70%、80%、90%，探索乙醇體積分數(shù)對黃精總酚提取率的影響。

1.3.3 提取溫度對提取率的影響

在料液比為1∶50、乙醇體積分數(shù)為70%、超聲時間為30 min、超聲次數(shù)為3次的條件下，將提取溫度分別設定為20、30、40、50、60 ℃，探索提取溫度對黃精總酚提取率的影響。

1.3.4 超聲時間對提取率的影響

在超聲溫度為30 ℃、料液比為1∶50、乙醇體積分數(shù)為70%、超聲次數(shù)為3次的條件下，將超聲時間分別設定為20、30、40、50、60 min，探索超聲時間對黃精總酚提取率的影響。

1.3.5 超聲次數(shù)對提取率的影響

在超聲溫度為30 ℃、料液比為1∶50、乙醇體積分數(shù)為70%、超聲時間為30 min的條件下，將超聲次數(shù)分別設定為1、2、3、4、5次，探索超聲次數(shù)對黃精總酚提取率的影響。

1.4 響應面試驗設計

根據(jù)中心復合設計原理，結(jié)合上述單因素試驗結(jié)果，以黃精總酚提取率為響應值Y(%)，選取提取溫度(X1)、超聲次數(shù)(X2)、超聲時間(X3)這3個影響黃精總酚提取率的主要因素，在單因素試驗結(jié)果的基礎上，開展3因素3水平的響應面分析。各因素3個水平的設計值如下:X1，30 ℃(-1，代表水平，下同)，40 ℃(0)，50 ℃(1)；X2，2次(-1)，3次(0)，4次(1)；X3，20 min(-1)，30 min(0)，40 min(1)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)整理，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken響應面試驗設計和結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對提取率的影響

由圖1可知，隨著料液比增加，黃精總酚提取率先逐漸增大，當料液比為1∶50時黃精總酚提取率達到最大值，隨后黃精總酚的提取率呈下降趨勢。因此，選擇料液比為1∶50。

圖1 料液比對黃精總酚提取率的影響

2.1.2 乙醇體積分數(shù)對提取率的影響

由圖2可知，當乙醇體積分數(shù)由40%增長到70%時，黃精總酚的提取率逐漸升高，且在乙醇體積分數(shù)在40%～50%和60%～70%的區(qū)間內(nèi)黃精總酚提取率增長較快，而在50%～60%區(qū)間增長較為平緩，當乙醇體積分數(shù)為70%時黃精總酚提取率達到最高值。主要原因是，當乙醇體積分數(shù)為40%～60%時，提取物表面會出現(xiàn)一層無色透明物質(zhì)，該物質(zhì)隨著乙醇體積分數(shù)的升高而逐漸減少，至70%時無該物質(zhì)。該物質(zhì)疑似多糖，阻隔了乙醇與黃精藥材的接觸，影響了黃精總酚的提取。生產(chǎn)過程中同樣會遇到此問題。當乙醇體積分數(shù)進一步增大到80%～90%時，黃精總酚提取率逐漸下降。這可能與黃精總酚在不同體積分數(shù)乙醇中的溶解度有關。綜上，選擇乙醇體積分數(shù)為70%。

圖2 乙醇體積分數(shù)對黃精總酚提取率的影響

2.1.3 提取溫度對提取率的影響

由圖3可知:當提取溫度為20～30 ℃時，黃精總酚的提取率較高，且呈上升趨勢；當提取溫度為30～50 ℃時，黃精總酚的提取率明顯下降；當提取溫度進一步增加到60 ℃時，黃精總酚的提取率較50 ℃時上升。綜上，選擇提取溫度為30 ℃。

圖3 提取溫度對黃精總酚提取率的影響

2.1.4 超聲時間對提取率的影響

由圖4可知:當超聲時間為20～30 min時，黃精總酚提取率隨超聲時間延長而升高，當超聲時間為30 min時，黃精總酚提取率最高；當超聲時間升至40 min時，黃精總酚提取率大幅下降；當超聲時間延長至50～60 min時，黃精總酚提取率有所回升，但仍低于超聲時間為20～30 min時的黃精總酚提取率。綜上，選擇超聲時間為30 min。

圖4 超聲時間對黃精總酚提取率的影響

2.1.5 超聲次數(shù)對提取率的影響

由圖5可知:當超聲次數(shù)由1次增至3次的過程中，黃精總酚提取率相應增高；當超聲次數(shù)進一步增加至4～5次時，黃精總酚的提取率并未能進一步增加?？赡苁且驗楫敵暣螖?shù)過多時，試驗過程中產(chǎn)生的損耗愈明顯，造成黃精總酚提取率下降。綜上，選擇超聲次數(shù)為3次。

圖5 超聲次數(shù)比對黃精總酚提取率的影響

2.2 黃精總酚提取工藝優(yōu)化

根據(jù)Design-Export 8.0軟件進行Box-Behnken試驗設計，結(jié)果詳見表1。

表1 黃精總酚提取的響應面分析方案和結(jié)果

根據(jù)試驗結(jié)果，進行回歸擬合:

對擬合的模型進行回歸分析，結(jié)果顯示，模型達極顯著水平，沒有失擬度，決定系數(shù)R2=0.996 4，調(diào)整值為0.991 7，擬合度較高，預測值與實際值具有較高的相似度，變異系數(shù)為2.15%。以上結(jié)果說明，用該響應面模型來預測和優(yōu)化黃精總酚的提取工藝具備可行性。從回歸系數(shù)的檢驗值可以看出，各因子對黃精總酚提取率的影響從高到低依次為提取溫度(X1)>超聲次數(shù)(X2)>超聲時間(X3)，其中，提取溫度的影響達到極顯著水平。

響應曲面圖可以直觀地表示各個試驗因素不同水平與響應值的函數(shù)關系，比較直觀地反映不同因素間的交互關系。等值線圖越圓，表明兩因素的交互影響越??；等值線圖越扁，表明兩因素的交互影響越大。由圖6～8可知，提取溫度與超聲次數(shù)的斜面最陡，等線圖較扁，具有最高點，說明兩者交互作用最大；提取溫度與超聲時間的交互作用次之，其斜面較陡，底部等高線呈橢圓、閉合，有最高點，交互作用明顯；超聲次數(shù)與超聲時間的斜面較緩和，但等值線圖最扁，且有最高點，說明這兩者有較大的交互作用。

圖6 提取溫度與超聲次數(shù)對黃精總酚提取率的影響

圖7 提取溫度與超聲時間對黃精總酚提取率的影響

圖8 超聲次數(shù)與超聲時間對黃精總酚提取率的影響

通過軟件Design-Expert 8.0.6求解方程，得出最優(yōu)提取工藝條件:提取溫度為37.48 ℃，超聲次數(shù)為2.81 次，超聲時間為29.88 min，此時黃精總酚的提取率可達6.860 69 mg·g-1。

為提高黃精總酚的提取率，考慮到實際生產(chǎn)加工操作和節(jié)能需求，將黃精總酚的提取工藝條件優(yōu)化為提取溫度37 ℃、超聲次數(shù)3次、超聲時間30 min。經(jīng)3次重復驗證，此條件下黃精總酚的提取率為7.003 35 mg·g-1，與理論預測值基本吻合，比單因素試驗下的最高提取率高出0.399 mg·g-1。

3 小結(jié)

本研究在單因素試驗的基礎上，選出對黃精總酚提取率影響較大的3個因素，并通過Box-Benhnken響應面法優(yōu)化了超聲輔助提取黃精總酚的工藝參數(shù):料液比為1∶50，乙醇體積分數(shù)為70%，提取溫度為37 ℃，超聲次數(shù)為3次，超聲時間為30 min。在此條件下，黃精總酚的提取率可達7.003 35 mg·g-1。