劉玉紅，孫彩霞*，宗侃侃，趙學平，張岑容

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所，浙江 杭州 310021； 2.磐安縣中藥材研究所，浙江 磐安 322300)

浙貝母(Fritillariathunbergii)是百合科貝母屬多年生草本植物，其成熟期干燥鱗莖供入藥所用，具有清熱化痰、散結(jié)消癰的效用，歷版《中國藥典》均有收載[1-3]。浙江省是我國浙貝母主要種植區(qū)，種植面積和產(chǎn)量占全國90%左右，種植面積約0.333萬hm2，是當?shù)剞r(nóng)戶致富的主導產(chǎn)業(yè)[4]。磐安縣作為浙江省浙貝母的主產(chǎn)區(qū)，其浙貝母產(chǎn)量占全國的60%以上。近年由于浙貝母無性繁殖、連作障礙和土壤微肥力難以把控等問題，導致其產(chǎn)量下降、品質(zhì)參差不齊，尤其是老產(chǎn)區(qū)品質(zhì)退化現(xiàn)象更為突出，嚴重影響了外界對于浙貝母療效的評價[5-6]。傳統(tǒng)的浙貝母成品質(zhì)量評價主要以外觀為依據(jù)，以鱗葉肥厚、質(zhì)硬而脆、富粉性、斷面色白者為佳，近年則多以浙貝母有效成分含量高低作為品質(zhì)評價的內(nèi)在指標[7]。浙貝母的藥用有效成分是生物堿，其中貝母素甲和貝母素乙含量較高，且具有止咳平喘、鎮(zhèn)痛抗炎和清熱潤肺等多種藥理作用，成為評價其有效成分的主要指標[8-10]?！吨袊幍洹吩u價浙貝母質(zhì)量主要是通過測定貝母素甲和貝母素乙的總含量。HPLC-ELSD(蒸發(fā)光散射檢測器)分析是檢測貝母有效成分的一種有效方法，已用于多種貝母屬植物的檢測[11-13]，但鮮見在浙貝母上的報道。通過運用此法對磐安縣抽檢的浙貝母的干樣和鮮樣的貝母素甲和貝母素乙含量進行檢測，以期引起相關(guān)部門對浙貝母品質(zhì)把控的重視。

1 材料與方法

1.1 供試材料

浙貝母藥材購自浙江磐安種植戶，經(jīng)浙江省中藥研究所鑒定為浙貝母的鱗莖。貝母素甲和貝母素乙對照品購自中國藥品生物制品檢定所(批號分別為110750～201612、110751～201110)。

1.2 儀器與試劑

Agilent 1100系列高效液相色譜儀及Agilent化學工作站(美國Agilent公司)；Alltech 3300蒸發(fā)光散射檢測器(美國Alltech公司)。

乙腈(色譜純，韓國Honeywell公司)；二乙胺(分析純，上海麥克林生化科技有限公司)；甲醇(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)；三氯甲烷(分析純，杭州高晶精細化工有限公司)；水為超純水，經(jīng)杭州永潔達凈化科技有限公司UPWS-Ⅰ-10(二級)超純水器過濾。

1.3 前處理方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為美國ES CaprisilC18-AQ(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%二乙胺溶液(65∶35)，流速為1 mL·min-1，柱溫為30 ℃；ELSD參數(shù)為漂移管溫度90 ℃，氮氣流速為1.5 mL·min-1，進樣量20 μL。理論板數(shù)按貝母素甲峰計算應不低于2 000。

1.3.2 對照品溶液制備

精密稱取干燥至恒重的貝母素甲和貝母素乙對照品適量，置容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至適當濃度，搖勻，制成每1 mL含0.240 mg貝母素甲和0.186 mg貝母素乙的溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

1.3.3 供試品溶液的制備

取本品粉末(過四號篩)約2 g，精密稱定，置燒瓶中，加濃氨試液4 mL浸潤1 h，精密加入三氯甲烷-甲醇(4∶1)的混合液40 mL，稱定重量，混勻，置80 ℃水浴中加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合液補足減失的重量，濾過。精密量取續(xù)濾液10 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣加甲醇溶液溶解并轉(zhuǎn)移至2 mL容量瓶中，加甲醇溶液至刻度，搖勻，濾過，即得。

1.4 測定方法

分別精密吸取對照品溶液5、10、15 μL，供試品溶液5～15 μL，注入液相色譜儀，測定，用外標兩點法對數(shù)方程分別計算貝母素甲、貝母素乙的含量，即得。

1.5 方法學考察

1.5.1 線性關(guān)系

精密吸取對照品溶液3、6、9、12、15 μL，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標，以對照品進樣量(μg)為橫坐標，分別繪制標準曲線，并計算回歸方程，貝母素甲回歸方程為Y=2 313.083X-1 211.220，r=0.994 7；貝母素乙回歸方程為Y=2 001.971X-842.860，r=0.995 2。結(jié)果表明，貝母素甲在0.720～3.600 μg呈良好的線性關(guān)系，貝母素乙在0.558～2.790 μg呈良好的線性關(guān)系。

1.5.2 精密度試驗

精密吸取貝母素甲和貝母素乙對照品溶液，重復進樣6次，每次5 μL。結(jié)果顯示，貝母素甲平均峰面積為2 322.8，相對標準偏差(RSD)為2.78%(n=6)；貝母素乙平均峰面積為1 499.4，RSD為2.93%(n=6)。

1.5.3 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，依上述色譜條件，分別在0、4、6、8 h進樣5 μL測定。結(jié)果顯示，貝母素甲平均峰面積為2 243.2，RSD為4.29%(n=4)；貝母素乙平均峰面積為1 492.7，RSD為4.38%(n=4)。表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.5.4 重復性試驗

分別取同一批號的浙貝母粉末樣品7份，按供試品溶液的制備方法制備，照上述色譜條件各進樣5 μL測定，依上述條件測定貝母素甲和貝母素乙含量，結(jié)果浙貝母藥材中，貝母素甲平均含量為0.111 4%，RSD為1.79%(n=7)；貝母素乙平均含量為0.072 3%，RSD為2.58%(n=7)。

1.5.5 加樣回收率試驗

取6份已知含量的供試品約1 g，精密稱定，分別添加貝母素甲對照品溶液(0.412 mg·mL-1)和貝母素乙對照品溶液(濃度為0.372 mg·mL-1)各2 mL，按擬定的方法制成供試品溶液，依供試品測定方法進行測定。

1.5.6 水分檢測

依據(jù)《中國藥典》2015年版四部通則0832第二法烘干法。取浙貝母藥材約2 g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，打開瓶蓋在105 ℃烘5 h，根據(jù)減失的重量，計算浙貝母藥材中含水量。按上述條件測定浙貝母干樣和鮮樣中貝母素甲和貝母素乙的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分析

由圖1可知，在此色譜條件下，貝母素甲和貝母素乙與其他成分能較好地分離。

圖1 對照品和樣品溶液的HPLC譜圖

2.2 加樣回收率試驗

表1表明，貝母素甲平均回收率為99.03%，RSD為2.96%(n=6)；貝母素乙平均回收率為95.47%，RSD為2.43%(n=6)。

表1 浙貝母中貝母素甲和貝母素乙的回收率

2.3 貝母素甲和貝母素乙含量

根據(jù)《中國藥典》標準，貝母素甲和貝母素乙總量不得少于0.080%，水分不得超過18%。在磐安縣調(diào)研的10個鮮樣和10個干樣測定結(jié)果(表2)表明，鮮樣的貝母素甲和貝母素乙的總含量均超過0.080%，達到《中國藥典》要求。但抽檢的農(nóng)戶自行干燥的10個浙貝母干樣里，有5個樣品的貝母素甲和貝母素乙的總含量未達標，有些甚至只有《中國藥典》所要求的一半。

表2 浙貝母干樣和鮮樣中貝母素甲和貝母素乙的含量

3 討論與小結(jié)

研究表明，有效成分已成為道地藥材品質(zhì)評價的重要指標[14]。中藥材的加工干燥是其藥性形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[15-18]，因此，加工方式對浙貝母的有效成分有直接影響。據(jù)文獻記載[19]，浙貝母生品的加工主要有5種:貝殼粉吸法、生切脫水法、冷凍干燥法、微波干燥法和硫黃熏蒸法。其中，貝殼粉吸法需擦去表皮，會損失較多的表皮生物堿，且此法需要攤曬多日，易受氣候因素的制約，產(chǎn)能效率低，已不再適用；生切片法不會造成表皮生物堿損失，但切片較薄，質(zhì)地較脆，不利于運輸，且加工能耗大。近年來冷凍和微波加工技術(shù)興起，逐漸引起人們的關(guān)注[20]。雖然干燥樣品的品質(zhì)與形態(tài)俱佳，但設備昂貴，不適用于大批量浙貝母起土時加工。劉青梅等[21]利用熱風-微波聯(lián)合干燥技術(shù)，優(yōu)化浙貝母加工工藝，即通過縮短熱風干燥時間，降低能耗，同時解決了由于微波干燥失水速率過快而導致的浙貝母品質(zhì)較差等問題，由于此法對設備要求高，目前尚未普及使用。硫黃熏制法是延長中藥材保存時間的一種傳統(tǒng)加工方法，具有外觀增色，以及防腐、防蛀等優(yōu)勢，但硫黃熏制后，會導致浙貝母中的有效成分發(fā)生變化，而殘留的硫黃成分對人體不利，此法已經(jīng)逐漸被淘汰[22-23]。因此，還需進一步完善發(fā)展浙貝母的加工技藝。

通過調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前磐安縣主要通過切片烘干方式對浙貝母進行加工。根據(jù)《中國藥典》標準，貝母素甲和貝母素乙總量不得少于0.080%，水分不得超過18%。在磐安縣調(diào)研的10個鮮樣測定結(jié)果表明，貝母素甲和貝母素乙的總含量均超過0.080%，達到《中國藥典》要求。但抽檢的農(nóng)戶自行干燥的10個浙貝母干樣里，有5個樣品的貝母素甲和貝母素乙的總含量未達標，有些甚至只有《中國藥典》所要求的一半。通過調(diào)研發(fā)現(xiàn)，部分農(nóng)戶會選擇80 ℃左右的高溫干燥浙貝母，以此縮短干燥時間，提高經(jīng)濟效益。由此推斷，干燥溫度可能是影響貝母素含量的一大因素。陳雪濤等[24]研究了不同溫度干燥浙貝母，然后測定其貝母素甲和貝母素乙的含量，結(jié)果顯示，60 ℃熱風干燥浙貝母中活性成分含量最高，80 ℃干燥雖然用時短，但活性成分較低，因此，60 ℃熱風干燥是浙貝母的最佳干燥溫度，這與本試驗一致。金玉琴等[25]研究表明，由于浙貝母生物堿不耐高溫的因素，建議采用低溫干燥技術(shù)加工浙貝母。值得注意的是，在達到《中國藥典》標準的鮮樣里，部分樣品的貝母素甲和貝母素乙的總含量仍然偏低，這將影響外界對磐安縣浙貝母品質(zhì)的評價。

產(chǎn)地環(huán)境等條件是道地藥材品質(zhì)的重要外在因素，會直接影響到道地藥材的生長發(fā)育及其有效成分的形成和積累[26]。宋林強[27]研究表明，不同施鉀量下浙貝母生物量、產(chǎn)量存在顯著差異，這說明土壤肥力對浙貝母的有效成分有著明顯的影響。近年來，雞糞作為農(nóng)家肥的替代品，作為浙貝母的肥料廣泛應用。盧曉等[28]試驗發(fā)現(xiàn)，以有機雞糞作基肥有利于提高浙貝母的產(chǎn)量，但高肥不利于有效成分的積累，菇渣覆蓋有助于提升貝母素甲和貝母素乙的含量。綜合考慮產(chǎn)量和質(zhì)量，提出把有機雞糞+菇渣的組合推薦作為生產(chǎn)上的施肥措施。

磐安縣浙貝母質(zhì)地優(yōu)良，粉性足，深受國內(nèi)外客商的歡迎。浙貝母的品質(zhì)下降將影響磐安縣浙貝母產(chǎn)業(yè)的長遠發(fā)展，應引起高度重視，而樹立磐安縣作為“中國藥材之鄉(xiāng)”的新形象，提高道地藥材質(zhì)量就顯得尤為重要。貝母素甲和貝母素乙是浙貝母藥材中的主要活性生物堿，其含量易受干燥溫度和產(chǎn)地環(huán)境的影響。為了提高磐安縣浙貝母的品質(zhì)，建議盡量避免散戶單獨干燥處理，選擇合適的烘干溫度進行集中加工、規(guī)范化管理，同時采用合理的施肥措施，確保浙貝母有效成分的形成和積累。