狄春光 王麗萍 王慧 王功發(fā) 王毅 朱琴

時(shí)差成像系統(tǒng)（time-lapse imaging system，TLI）為非侵入胚胎評(píng)估系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)常規(guī)體外受精（in vitro fertilization，IVF）周期中培養(yǎng)過(guò)程中的胚胎連續(xù)觀察，獲得胚胎發(fā)育的時(shí)間參數(shù)，從而準(zhǔn)確評(píng)估其發(fā)育潛能[1]。TLI克服了傳統(tǒng)評(píng)估方法對(duì)胚胎發(fā)育觀察不夠全面、缺少可量化指標(biāo)等缺點(diǎn)。胚胎暴露于大量光源中不利于胚胎的發(fā)育，而TLI對(duì)胚胎的總光源暴露量明顯低于IVF實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)倒置顯微鏡觀察所需[2]。研究表明采用TLI觀察胚胎不會(huì)對(duì)胚胎發(fā)育產(chǎn)生不利影響，是安全的[3-5]。已有研究者利用TLI與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)評(píng)估方法結(jié)合，建立了一系列較為科學(xué)的胚胎評(píng)估體系用于挑選最具妊娠潛能的胚胎，以改善臨床妊娠結(jié)局[6-7]。未成熟卵母細(xì)胞體外成熟（in vitro maturation，IVM）是一項(xiàng)新的輔助生殖技術(shù)，用于治療難治性多囊卵巢綜合征不孕和誘導(dǎo)排卵周期中卵巢反應(yīng)不良的患者。因IVM技術(shù)在體外進(jìn)行，卵母細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境發(fā)生改變會(huì)導(dǎo)致其成熟機(jī)制也發(fā)生改變，進(jìn)而會(huì)影響后續(xù)胚胎的發(fā)育潛能，有研究表明未成熟卵母細(xì)胞IVM后形成胚胎（IVM胚胎）發(fā)育潛能較正常胚胎發(fā)育潛能差[8]。目前，IVM胚胎的臨床妊娠率為35%～40%，低于正常胚胎妊娠率[9]。因此，如何提高IVM胚胎的臨床妊娠率是一個(gè)迫切需要解決的問(wèn)題。目前國(guó)內(nèi)外利用TLI評(píng)估正常IVF周期胚胎發(fā)育潛能提高臨床妊娠率的研究不少，但利用TLI選擇高發(fā)育潛能的IVM胚胎的報(bào)道不多。本研究旨在探討如何利用TLI選擇高發(fā)育潛能的IVM胚胎，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2016年2月至2019年5月在嘉興市婦幼保健院生殖中心接受體外受精-胚胎移植治療患者的525枚未成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行IVM；同時(shí)收集周期中正常成熟卵母細(xì)胞207枚，進(jìn)行體外培養(yǎng)。IVM成熟卵細(xì)胞及正常成熟卵細(xì)胞均行卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI），受精所用精子均來(lái)自患者丈夫，受精后的胚胎在TLI系統(tǒng)中觀測(cè)培養(yǎng)。排除艾滋、梅毒、乙型病毒性肝炎抗原陽(yáng)性患者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有納入對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 IVM培養(yǎng)液準(zhǔn)備 G-2 plus胚胎培養(yǎng)液（瑞典Vitrolife公司），75 U/L促卵泡生成素和150 U/L人絨毛膜促性腺激素（瑞士 Serono公司），0.2 μg/ml 17β-雌二醇（美國(guó)Sigma公司）。

1.2.2 未成熟卵母細(xì)胞收集和培養(yǎng) 患者按本中心常規(guī)方案進(jìn)行促排卵，在陰道超聲引導(dǎo)下取卵。ICSI前拆除卵母細(xì)胞周圍的大部分顆粒細(xì)胞，經(jīng)倒置顯微鏡觀察卵母細(xì)胞的成熟程度，未成熟卵母細(xì)胞（GV期或MI期）為本研究觀察對(duì)象。將未成熟卵母細(xì)胞移入IVM培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24～40 h，如果卵細(xì)胞成熟則行ICSI，受精卵在TLI觀測(cè)下培養(yǎng)。

1.2.3 TLI使用和胚胎培養(yǎng) 研究使用Primo Vision（瑞典 Vitrolife公司）的TLI，圖像采集1次/5 min，共連續(xù)培養(yǎng)6 d。所有胚胎均采用9孔培養(yǎng)皿（瑞典Vitrolife公司），卵裂期胚胎培養(yǎng)液為37℃6% CO2平衡過(guò)夜的G-1 plus胚胎培養(yǎng)液（瑞典Vitrolife公司）。囊胚培養(yǎng)為37℃ 6% CO2平衡過(guò)夜的G-2 plus胚胎培養(yǎng)液（瑞典Vitrolife公司）培養(yǎng)液，培養(yǎng)過(guò)程中均有Primo Vision成像系統(tǒng)采集圖像，并作胚胎發(fā)育的時(shí)間參數(shù)與卵裂模式分析。

1.2.4 胚胎發(fā)育時(shí)間參數(shù)和卵裂模式設(shè)定 將ICSI受精時(shí)間記為“0”點(diǎn)，原核消失時(shí)間標(biāo)記為PND（pronuclear disappearance），發(fā)育至2細(xì)胞時(shí)間為 t2，發(fā)育至3細(xì)胞時(shí)間為t3，以此類推為 t4、t5。2細(xì)胞發(fā)育至 3細(xì)胞所需時(shí)間為cc2，3細(xì)胞發(fā)育至4細(xì)胞所需時(shí)間為 s2。各時(shí)間點(diǎn)的命名方法參照Ciray標(biāo)準(zhǔn)。胚胎的卵裂模式包括正常卵裂及異常卵裂,其中異常卵裂模式包括不均、非軸性卵裂、大碎片、非二倍性卵裂、發(fā)育阻滯、非對(duì)稱卵裂、卵裂球碎裂及卵裂球融合。

1.2.5 胚胎評(píng)估標(biāo)準(zhǔn) 卵裂期胚胎評(píng)估參考 Peter標(biāo)準(zhǔn)，囊胚期胚胎評(píng)估參考Gardner標(biāo)準(zhǔn)。優(yōu)質(zhì)胚胎：細(xì)胞數(shù)7～12個(gè)，碎片≤20%；D3可利用胚胎：細(xì)胞數(shù)≥4個(gè)，碎片≤30%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。用四分位數(shù)法對(duì)時(shí)間參數(shù)進(jìn)行分類分析，以囊胚形成率為結(jié)局，計(jì)算各參數(shù)的優(yōu)勢(shì)時(shí)間段。采用logistic回歸分析時(shí)間參數(shù)與囊胚形成率的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IVM胚胎與正常胚胎培養(yǎng)結(jié)果比較 402枚未成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行IVM，共有315枚成熟，成熟率為78.4%；該315枚成熟卵細(xì)胞進(jìn)行ICSI后進(jìn)一步行TLI動(dòng)態(tài)觀察及囊胚培養(yǎng)。IVM胚胎D3可利用胚胎率、D3優(yōu)胚率、囊胚形成率均低于正常胚胎（均 P＜0.05），非二倍性卵裂率大于正常胚胎（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 IVM胚胎與正常胚胎培養(yǎng)結(jié)果比較[例（%）]

2.2 時(shí)間參數(shù)與胚胎發(fā)育潛能的關(guān)系 用四分位數(shù)法對(duì) IVM 胚胎各時(shí)間參數(shù)（PND、t2、t3、t4、t5、cc2 和 s2）進(jìn)行分段統(tǒng)計(jì),根據(jù)時(shí)間參數(shù)各段的囊胚形成率，將連續(xù)2段擁有囊胚形成率的時(shí)間定義為該時(shí)間參數(shù)的優(yōu)勢(shì)時(shí)間段。優(yōu)勢(shì)時(shí)間段：PND 為（18.08～25.25）h，t2 為（20.74～27.89）h；t3 為＜29.75 h，（29.75～36.36）h；t4為＜31.97 h，（31.97～37.53）h，t5 為 （37.50～52.68）h，cc2 為（5.05～12.02）h，s2 為≥1.03 h，見(jiàn)表 2。通過(guò) logistic回歸分析，顯示 t5（OR=1.029，95% CI：1.011～1.048）與形成囊胚最具相關(guān)性，見(jiàn)表3。

2.3 t5優(yōu)勢(shì)時(shí)間段內(nèi)胚胎的囊胚形成能力驗(yàn)證結(jié)果 用后期收集的123枚未成熟卵母細(xì)胞形成的IVM胚胎時(shí)間參數(shù)與囊胚形成率的關(guān)系驗(yàn)證t5的預(yù)測(cè)價(jià)值。123枚未成熟卵細(xì)胞經(jīng)IVM成熟92枚，受精后得到D3可移植胚胎43枚，經(jīng)囊胚培養(yǎng)形成13枚囊胚，其中在t5優(yōu)勢(shì)時(shí)間段內(nèi)D3可移植胚胎15枚形成囊胚9枚，囊胚形成率為60.0%,顯著高于非t5優(yōu)勢(shì)時(shí)間段內(nèi)囊胚形成率為14.3%（P＜0.05），證實(shí)t5優(yōu)勢(shì)時(shí)間段具有預(yù)測(cè)性。

3 討論

人類輔助生殖技術(shù)的成功目標(biāo)是獲得健康的胎兒，對(duì)于難治性多囊卵巢綜合征不孕和誘導(dǎo)排卵周期中卵巢的反應(yīng)不良的患者，IVM技術(shù)是治療此類患者最為有效的措施。但I(xiàn)VM后卵母細(xì)胞形成胚胎發(fā)育能力較差的問(wèn)題始終困擾著大家，胚胎發(fā)育是一個(gè)連續(xù)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，胚胎發(fā)育過(guò)程中任何非時(shí)間順序相關(guān)的不正常事件都會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常，如胚胎直接從1細(xì)胞卵裂為3細(xì)胞、卵裂球多核化、胚胎空泡化、碎片化等。TLI技術(shù)對(duì)胚胎不間斷地連續(xù)觀察，可連續(xù)獲取胚胎發(fā)育全過(guò)程的動(dòng)態(tài)影像，可對(duì)胚胎發(fā)育進(jìn)行更加全面和細(xì)致的記錄。以上所提到的異常事件及與胚胎發(fā)育潛能密切相關(guān)的生物學(xué)特征，如原核的形成及消失、卵裂時(shí)間等都可以幫助胚胎學(xué)家對(duì)胚胎發(fā)育有更深的理解，通過(guò)對(duì)胚胎發(fā)育相關(guān)時(shí)間參數(shù)的分析，可以更好的預(yù)測(cè)發(fā)育潛能高的胚胎。本研究中通過(guò)TLI對(duì)胚胎發(fā)育進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，將胚胎的卵裂模式及時(shí)間參數(shù)相結(jié)合，篩選發(fā)育潛能更高的胚胎進(jìn)行移植，提高IVM后胚胎移植的臨床妊娠率。

正常體外受精周期中，胚胎發(fā)育中異常卵裂事件中非二倍性卵裂胚胎的囊胚形成率和種植率都非常低，Athayde等[10]報(bào)道其囊胚形成率為11.7%，種植率更低只有3.7%，非二倍性卵裂胚胎發(fā)育潛能差可能與其具有較高的染色體異常發(fā)生率有關(guān)[11]。IVM卵細(xì)胞的成熟包括細(xì)胞核成熟和細(xì)胞質(zhì)成熟，它受多種因素影響，如培養(yǎng)時(shí)間、激素、顆粒細(xì)胞等，有研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)延長(zhǎng)IVM時(shí)間可促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟過(guò)程，提高卵母細(xì)胞的核成熟率，促性腺激素可促進(jìn)未成熟卵母細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的成熟，利于胚胎的后期發(fā)育[12]。未成熟卵母細(xì)胞在不成熟的IVM培養(yǎng)條件下，受各種因素影響，其細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的成熟肯定不如體內(nèi)成熟的卵細(xì)胞同步，因此其細(xì)胞核發(fā)育異常的可能性高于體內(nèi)成熟的卵細(xì)胞。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在IVM胚胎非二倍性卵裂胚胎發(fā)生率為正常胚胎的2倍多，筆者認(rèn)為這可能與IVM卵細(xì)胞核成熟異常有關(guān)，另外胚胎發(fā)育停滯的發(fā)生率也高于正常胚胎，這可能同樣與IVM卵細(xì)胞核成熟異常有關(guān)。Qi等[13]報(bào)道胚胎發(fā)育停滯往往伴有染色體異常，這從側(cè)面證實(shí)了筆者的推測(cè)。

表2 四分位數(shù)法分析囊胚形成情況

表3 logistic回歸分析時(shí)間參數(shù)與胚胎發(fā)育潛能的關(guān)系

人類的合子基因組激活發(fā)生4～8細(xì)胞階段，基因組的激活對(duì)桑椹胚、囊胚至關(guān)重要，因此筆者推測(cè)4～8細(xì)胞階段的時(shí)間參數(shù)對(duì)預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛能至關(guān)重要。在本研究中通過(guò)對(duì)IVM后卵母細(xì)胞胚胎時(shí)間參數(shù)與是否形成囊胚作單因素和多因素logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)t5與胚胎發(fā)育潛能最具相關(guān)性。另有研究同樣表明t5可以作為胚胎發(fā)育潛能的預(yù)測(cè)性參數(shù)[4，14]。Meseguer等[15]對(duì)285例ICSI周期患者胚胎的卵裂時(shí)間、卵裂球大小和多核等作了詳細(xì)的回顧性分析，總共移植了522枚胚胎，結(jié)果顯示 t5（ICSI后 48.8～56.6 h）、s2（≤0.76 h）、cc2（≤11.9 h）這三個(gè)時(shí)間參數(shù)可以作為囊胚形成潛能的預(yù)測(cè)性參數(shù)。因此如果篩選t5優(yōu)勢(shì)時(shí)間段內(nèi)的胚胎在發(fā)育第3天進(jìn)行移植，能加大獲得妊娠的可能性。但由于各中心的促排卵方案、培養(yǎng)環(huán)境及人員操作等差異可能造成各中心提取的共性參數(shù)有所不同。因此，各生殖中心應(yīng)該根據(jù)自己最適合的共性參數(shù)挑選優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植。