侯秀秀 朱欣 凌志強(qiáng) 朱栩杭 許敏達(dá) 趙智翔 葛明華

涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma,SACC）是較常見的涎腺惡性上皮源性腫瘤，可發(fā)生于任何大小的涎腺，由于發(fā)病隱匿，且具有局部浸潤性和沿神經(jīng)血管擴(kuò)散的特性，邊界難以控制，術(shù)后易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，多數(shù)患者預(yù)后不良[1-2]。研究表明，SACC發(fā)生、發(fā)展與多種分子機(jī)制有關(guān)，其中DNA甲基化在SACC致癌及進(jìn)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]，如AQP1基因[4]、E-CAD基因[5]、SBSN 基因[6]、RASSF1A 基因[7]、RUNX3 基因[8-10]。近年來，相關(guān)基因DNA甲基化與SACC發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性也成為研究熱點(diǎn)。信號(hào)素分子3G（Semaphorin 3G，SEMA3G）是一種重要的分泌型糖蛋白，屬于信號(hào)素家族成員，可通過神經(jīng)菌毛素 2（neuropilin-2，NRP-2）受體、神經(jīng)叢蛋白（Plexin）與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）結(jié)合參與血管生成[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)SEMA3G在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)不同程度的缺失和表達(dá)下調(diào)，并且通過多種信號(hào)通路發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長、增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的作用[13]。然而，SEMA3G與SACC的相關(guān)研究不多。本研究通過免疫組化法檢測(cè)SEMA3G在SACC組織中的表達(dá)水平，采用實(shí)時(shí)熒光定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative methylation-specific PCR,qMSP）檢測(cè)SEMA3G基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平，探討其與SACC患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2002年2月至2013年12月在中國科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（浙江省腫瘤醫(yī)院）接受手術(shù)、術(shù)前未行放化療、病例資料保存完整的SACC患者55例，其中男22例，女33例；年齡24～78歲，中位年齡52歲。收集其SACC組織標(biāo)本，并取相對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織作為對(duì)照。由3名病理科醫(yī)師對(duì)SACC作診斷分類，其中篩狀型30例，腺管型11例，實(shí)體型14例；肌層浸潤22例，無肌層浸潤33例；累及神經(jīng)24例，未累及神經(jīng)31例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移5例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移50例；根據(jù)國際抗癌聯(lián)合會(huì)（UICC）2002年第6版TNM分期：Ⅰ～Ⅲ期24例，Ⅳ期31例。本研究經(jīng)中國科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（浙江省腫瘤醫(yī)院）倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集患者的一般資料及臨床病理特征，包括性別、年齡、腫瘤部位、TNM分期、組織類型、是否侵犯鄰近組織、是否累及神經(jīng)、是否肌層浸潤、是否復(fù)發(fā)等。手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片行病理學(xué)檢查。采用電話回訪，統(tǒng)計(jì)生存和死亡情況，如電話隨訪3次無回音，或地址所在派出所查詢無此人信息，則定為失訪。

1.2.2 SACC組織與癌旁正常組織SEMA3G表達(dá)水平檢測(cè) 采用免疫組化SP法。所有組織切片（4 μm厚）用二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，采用EDTA緩沖液高溫微波抗原修復(fù)，5%過氧化氫溶液清除內(nèi)源性過氧化物酶，SEMA3G一抗（英國Abcam公司）4℃冰箱靜置孵育過夜，二抗室溫孵育30 min，DAB顯色、蘇木素染核、促藍(lán)液染質(zhì)、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，由3名病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片打分，取平均值為最終值。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用半定量法：高倍鏡下評(píng)估細(xì)胞染色強(qiáng)度：未著色為陰性（0分）、淡黃色為弱陽性（1分）、黃色為陽性（2分）、棕褐色為強(qiáng)陽性（3分）；低倍鏡下評(píng)估細(xì)胞陽性染色百分比：0%～1%為 0分，1%～10%為 1分，10%～50%為2分，50%～80%為3分，＞80%為4分。最終免疫組化染色得分=染色強(qiáng)度×陽性染色百分比。陰性0～4分，陽性 5～12 分。

1.2.3 SACC組織與癌旁正常組織SEMA3G基因啟動(dòng)子甲基化水平檢測(cè) 采用qMSP法。所有組織標(biāo)本取3～5張7 μm厚的連續(xù)石蠟切片，行HE染色，37℃烘箱中干燥過夜，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，將上述切片置于光學(xué)顯微鏡下，用27G注射針頭小心挑取SACC細(xì)胞和癌旁正常細(xì)胞（約3 000～5 000個(gè)），嚴(yán)格按照QIAampDNA抽提試劑盒（德國Qiagen公司）中提供的操作說明提取和純化微量DNA。采用EpiTectDNA亞硫酸氫鹽修飾試劑盒（德國Qiagen公司），按照說明書中的操作步驟對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾及純化。根據(jù)SEMA3G基因序列設(shè)計(jì)CpG島特異性的甲基化和非甲基化引物，采用ABI 7500 PCR儀對(duì)亞硫酸氫鈉法修飾的DNA進(jìn)行qMSP分析。SEMA3G相關(guān)引物序列（生工生物有限公司）如下：SEMA3G（M）-F：5′-AATTATAATCGGCGGTTAGCGG-3′，SEMA3G（M）-R：5′-CCGCAAACGAAACACACTAAAAC-3′；SEMA3G（U）-F：5′-AATTATAATTGGTGGTTAGTGGGA TTAG-3′，SEMA3G（U）-R：5′-ACCACAAACAAAACACACTAA AACCA-3′。使用SYBRPremix Ex TaqTM試劑盒（日本TaKaRa公司）按操作步驟進(jìn)行PCR反應(yīng)。55例樣本組織分別進(jìn)行甲基化PCR擴(kuò)增和非甲基化PCR擴(kuò)增，根據(jù)所得的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中DNA甲基化的相對(duì)百分比率，甲基化率計(jì)算公式：甲基化率（M%）=[甲基化DNA拷貝數(shù)（/甲基化DNA拷貝數(shù)+非甲基化DNA拷貝數(shù)）]×100%。M%＜20%：0分；20%～40%：1分；40%～60%：2分；60%～80%：3分；＞80%：4分。本研究將0分定義為無甲基化，其余歸類于有甲基化，其中1～3分為部分甲基化，4分為完全甲基化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SACC組織與癌旁正常組織SEMA3G表達(dá)水平比較 SEMA3G主要在細(xì)胞核中陽性表達(dá)，見圖1（插頁）。SACC組織與癌旁正常組織SEMA3G表達(dá)陽性率分別為43.64%（24/55）、96.36%（53/55），SEMA3G 在SACC組織中表達(dá)較在癌旁正常組織中明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。

圖1 涎腺腺樣囊性癌（SACC）組織與癌旁正常組織中信號(hào)素分子3G（SEMA3G）的表達(dá)（a、b：篩狀型SACC組織陰性、陽性表達(dá)；c、d：腺管型SACC組織陰性、陽性表達(dá)；e、f：實(shí)體型SACC組織陰性、陽性表達(dá)；g、h：癌旁正常組織陰性、陽性表達(dá)；免疫組化染色，×400）

2.2 SACC組織與癌旁正常組織SEMA3G基因甲基化水平比較 SACC組織SEMA3G基因甲基化率為87.27%（48/55），其中完全甲基化率 49.10%（27/55），部分甲基化率38.18%（21/55）；癌旁正常組織SEMA3G基因甲基化率為9.09%（5/55），均為部分甲基化。SACC組織SEMA3G基因甲基化水平高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 SACC患者SACC組織SEMA3G表達(dá)水平、基因甲基化水平與臨床病理特征的關(guān)系 T1～3級(jí)SACC患者SEMA3G表達(dá)水平高于T4級(jí)患者，而SEMA3G甲基化水平低于T4級(jí)患者（均P＜0.05）。TNM分期Ⅰ～Ⅲ期患者SEMA3G表達(dá)陽性水平高于Ⅳ期患者，而SEMA3G甲基化水平低于Ⅳ期患者（均P＜0.05）。無肌層浸潤的SACC患者SEMA3G表達(dá)水平高于有肌層浸潤患者（P＜0.05）。未復(fù)發(fā)的SACC患者SEMA3G表達(dá)水平高于復(fù)發(fā)SACC患者（P＜0.05）。SEMA3G基因甲基化水平與SACC患者T分級(jí)、TNM分期有關(guān)（均P＜0.05）。而不同性別、年齡、腫瘤位置、組織類型、是否侵犯鄰近組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)累及、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的SACC患者SACC組織SEMA3G表達(dá)水平及基因甲基化水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

2.4 SACC患者SACC組織SEMA3G表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系 55例患者2例失訪，隨訪5～145個(gè)月，中位隨訪時(shí)間56個(gè)月。SEMA3G表達(dá)陽性的24例患者中死亡4例，SEMA3G表達(dá)陰性的31例患者中死亡12例。不同SEMA3G表達(dá)水平的患者無進(jìn)展生存期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），生存曲線見圖2。

3 討論

圖2 信號(hào)素分子3G（SEMA3G）陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者生存曲線比較

SACC是口腔頜面部較常見的惡性腫瘤，具有血管浸潤性及神經(jīng)侵襲性，常導(dǎo)致腫瘤浸潤范圍較廣，手術(shù)不能完全切除，預(yù)后較差，即使術(shù)后合并放化療等綜合治療效果仍不令人滿意[1]。近些年臨床研究者致力于篩選與SACC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的生物標(biāo)志物，希望為更好地篩選、診斷及治療SACC提供思路。信號(hào)素家族成員是一類高度保守的分泌型或跨膜型糖蛋白，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。SEMA3G通過與NRP-2受體和Plexin受體結(jié)合形成復(fù)合體，介導(dǎo)下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)腫瘤細(xì)胞生長、血管形成有不同程度的抑制作用[13]。相關(guān)研究顯示SEMA3G能夠明顯抑制胰腺癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移；將穩(wěn)定表達(dá)SEMA3G的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435接種到裸鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)腫瘤生長體積及重量受到了明顯抑制；將其轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞系中腫瘤抑制依然存在，同時(shí)發(fā)現(xiàn)SEMA3G對(duì)該腫瘤的血管形成也具有明顯的抑制作用[11-15]。SEMA3G高表達(dá)可以抑制黑色素瘤的生長及血管形成[13]；SEMA3G的表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致VEGF相關(guān)的惡性間皮瘤中血管生成和腫瘤生長抑制活動(dòng)的喪失[11]。同時(shí)SEMA3G也可抑制U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2的表達(dá)，從而減弱神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力，發(fā)揮抑癌基因的作用[15]，人腦膠質(zhì)瘤中SEMA3G的表達(dá)水平同患者預(yù)后生存期存在相關(guān)性，SEMA3G可以作為腦膠質(zhì)瘤的一個(gè)預(yù)后評(píng)估指標(biāo)[12,15]。本研究結(jié)果顯示43.64% SACC組織中SEMA3G表達(dá)陽性，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于SEMA3G在癌旁正常對(duì)照組織中的表達(dá)陽性率，其中T4級(jí)及TNM分期Ⅳ期SACC組織中SEMA3G表達(dá)水平明顯低于T1～3分級(jí)及Ⅰ～Ⅲ分期SACC組織；有肌層浸潤及復(fù)發(fā)的SACC組織中SEMA3G表達(dá)水平明顯低于無肌層浸潤及無復(fù)發(fā)的組織；而SEMA3G表達(dá)水平與SACC患者的性別、年齡、腫瘤位置、組織類型、有無侵犯鄰近組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)累及、肌層浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系。Kaplan-Meier分析顯示，SEMA3G表達(dá)陰性患者預(yù)后較差。上述結(jié)果提示SEMA3G表達(dá)陰性可能是SACC疾病進(jìn)展過程中的危險(xiǎn)因素，SEMA3G基因在SACC發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因的作用。

表1 SACC患者SACC組織SEMA3G表達(dá)水平、基因甲基化水平與臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

表觀遺傳學(xué)中DNA甲基化與人類常見的惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)異常高甲基化可導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄失活，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[3]。本研究采用了qMSP法檢測(cè)了55例SACC組織和配對(duì)癌旁正常組織中SEMA3G基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況，結(jié)果顯示87.27%的SACC組織中存在SEMA3G基因啟動(dòng)子5′-CpG島甲基化，其中完全甲基化水平達(dá)49.10%；而癌旁正常組織甲基化水平僅為9.09%，提示DNA甲基化可能是SEMA3G在SACC組織中低表達(dá)的原因之一。與臨床病理特征的關(guān)系分析表明，T4分級(jí)及TNMⅣ期SACC組織中SEMA3G甲基化水平達(dá)100%，相比于T1-3分級(jí)及TNM分期Ⅰ～Ⅲ期組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而SEMA3G基因甲基化水平與SACC患者的性別、年齡、腫瘤位置、組織類型、有無侵犯鄰近組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)累及、肌層浸潤、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)無明顯關(guān)系。本研究初步評(píng)估了SEMA3G基因在SACC組織中的甲基化水平，后續(xù)筆者將在SACC細(xì)胞中檢測(cè)SEMA3G的甲基化水平及5-氮雜-2′-脫氧胞苷處理后的去甲基化狀態(tài)下SEMA3G的表達(dá)水平，并完善相關(guān)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，SEMA3G基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化可能是其在SACC組織中表達(dá)下調(diào)的原因之一，并參與了SACC的發(fā)生與預(yù)后，但SEMA3G在SACC中的具體分子機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究，SEMA3G在SACC診斷和預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值仍需更多大樣本臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。