徐 軍 王玉玉 王 康 曾慶飛 張 敏 張 歡

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072; 2. 北京林業(yè)大學(xué)生態(tài)與自然保護(hù)學(xué)院, 北京 100083; 3. 中國(guó)科學(xué)院南京地理與湖泊研究所, 南京 210008; 4. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 武漢 430070; 5. 南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 南昌 330031)

穩(wěn)定同位素分析是確定生態(tài)系統(tǒng)食物網(wǎng)中生物營(yíng)養(yǎng)級(jí)和能量流動(dòng)途徑的重要技術(shù)[1—4]。通過(guò)分析、模擬與比較生物營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位與營(yíng)養(yǎng)關(guān)系的變化可以了解人為干擾如何影響能量從食物網(wǎng)底層到頂級(jí)捕食者的流動(dòng)[5,6]。然而, 對(duì)營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位的長(zhǎng)時(shí)間尺度或大空間對(duì)比的研究較為困難。一方面, 營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位研究可能來(lái)自不同研究人員、不同采樣和處理方法, 這種不一致性增加了生物樣品分析結(jié)果的不確定性, 妨礙了調(diào)查結(jié)果的比較; 另一方面, 使用已存檔的生物樣本進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位研究有助于研究人員獲得生態(tài)系統(tǒng)生物營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位基準(zhǔn)特征, 對(duì)認(rèn)識(shí)不同時(shí)間格局下生物在食物網(wǎng)中功能具有重要意義。然而, 由于同位素分析自身的特點(diǎn), 樣本的儲(chǔ)存(凍干、烘干或防腐劑保存)本身可能會(huì)更改同位素特征, 進(jìn)而影響對(duì)營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位的評(píng)價(jià)[7]。

就碳、氮穩(wěn)定同位素而言, 其隨營(yíng)養(yǎng)級(jí)的變化通常分別0.4‰和3.4‰[3], 而已有研究報(bào)道的樣品處理與保存的同位素變異許多已經(jīng)超出了營(yíng)養(yǎng)級(jí)間的變異[8,9]。此外, 許多研究也發(fā)現(xiàn)較小的同位素變異與重要的食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)與功能改變相關(guān)聯(lián)。例如, Vander Zenden[10]發(fā)現(xiàn)外來(lái)魚(yú)類引起湖泊食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)的改變, 進(jìn)而導(dǎo)致土著捕食魚(yú)類碳、氮穩(wěn)定同位素發(fā)生了1.8‰和0.6‰的變化。Perga和Gerdeaux[11]也報(bào)道了Lake Geneva在恢復(fù)其寡營(yíng)養(yǎng)水平的過(guò)程中,Coregonus lavaretus(L.)的碳穩(wěn)定同位素每十年平均改變僅為1‰。這些研究均表明, 生態(tài)系統(tǒng)干擾在短時(shí)間內(nèi)不一定會(huì)導(dǎo)致在生物營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位發(fā)生巨大改變。因此, 準(zhǔn)確認(rèn)識(shí)樣品采集、處理與保存過(guò)程中影響穩(wěn)定同位素分析的可能因素,并避免這類差異, 對(duì)準(zhǔn)確評(píng)估食物網(wǎng)中生物營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位及正確理解人類活動(dòng)引起的食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)與功能變化就有重要意義[12]。

基于上述可能由于樣品采集、處理與保存所導(dǎo)致的樣品穩(wěn)定同位素的變化, 本文主要目的為:(1)通過(guò)同位素質(zhì)量平衡模型的模擬, 直觀展示由于樣品采集、處理與保存引起的潛在同位素變異對(duì)評(píng)價(jià)生物營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位的影響, 并分析這種不確定性的效應(yīng); (2)綜合現(xiàn)有水域生態(tài)系統(tǒng)研究中常見(jiàn)類群的常用樣品采集、處理與保存的思路與技術(shù)手段,探討各種因素引起同位素變異的原因與差異; (3)確定適用性較強(qiáng)的樣品采集、處理與保存程序, 用于多空間尺度、長(zhǎng)時(shí)間系列的同位素生態(tài)學(xué)比較研究的對(duì)比、校驗(yàn)與修正。

1 水域生態(tài)系統(tǒng)中同位素特征與不確定性分析

1.1 影響因素的復(fù)雜性與多樣性

隨著穩(wěn)定同位素質(zhì)譜的出現(xiàn)和發(fā)展, 科學(xué)家得以精確地測(cè)量某種元素的穩(wěn)定性同位素比值在不同物質(zhì)中的含量, 并結(jié)合穩(wěn)定性同位素獨(dú)特的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì), 例如同位素質(zhì)量平衡效應(yīng)(Equilibration)以及同位素分餾效應(yīng)(Fractionation), 探討生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)規(guī)律[13]。在水域生態(tài)系統(tǒng)中, 影響浮游植物、底棲藻類與水生高等植物等初級(jí)生產(chǎn)者的穩(wěn)定同位素特征的因素非常多, 例如葉綠素、磷和CO2濃度、光強(qiáng)和水的流速、地下水的上涌、水華的爆發(fā)和洪水、無(wú)機(jī)碳源, 以及微生物碳源[14]。在光合作用過(guò)程中, 植物葉片表層周圍的CO2擴(kuò)散作用也會(huì)影響植物的穩(wěn)定性同位素比率, 例如底棲藻類通常處于一種CO2限制的條件中, 所以底棲藻類區(qū)分12CO2和13CO2的能力較差。而相對(duì)于底棲藻類, 浮游藻類處于一種CO2相對(duì)充足的條件中, 所以浮游藻類可以選擇性地吸收更易于進(jìn)行光合作用的12CO2。因此, 相對(duì)于浮游藻類, 底棲藻類的δ13C較高[15]。生物化學(xué)過(guò)程是影響消費(fèi)者與其食物之間同位素分餾的主要因素。例如呼吸作用所產(chǎn)生的二氧化碳中13C含量相對(duì)動(dòng)物自身的13C組成較低[16], 因而可用于解釋消費(fèi)者相對(duì)食物碳穩(wěn)定性同位素比率增大的現(xiàn)象[16]。存在于成脂過(guò)程中丙酮酸氧化反應(yīng)中對(duì)13C的重同位素歧視作用[16]導(dǎo)致了生物體內(nèi)脂類含量相對(duì)較高的組織比脂類含量低的組織碳穩(wěn)定性同位素比率低。動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)谷氨酸和天冬氨酸之間的轉(zhuǎn)氨作用過(guò)程中,14NH2比15NH2快1.0083倍, 這導(dǎo)致了食物缺乏的情況下動(dòng)物組織15N的增加[17]。與食物相比, 消費(fèi)者的氮穩(wěn)定性同位素比率約增加3‰—5‰,這可能是因?yàn)橄M(fèi)者的排泄物中尿素和氨的氮穩(wěn)定性同位素相對(duì)較低, 從而導(dǎo)致了高營(yíng)養(yǎng)級(jí)生物的氮穩(wěn)定性同位素相對(duì)較高[18]。此外生物體內(nèi)的穩(wěn)定性同位素特征還受到不同水域生態(tài)系統(tǒng)類型、寄主和宿主之間的特殊營(yíng)養(yǎng)關(guān)系、生物個(gè)體或種群水平食性轉(zhuǎn)變、代謝機(jī)能、棲息地、餌料的質(zhì)量等一系列因素的影響[14,19]。

1.2 不確定性對(duì)食物來(lái)源貢獻(xiàn)的敏感性分析

為了舉例說(shuō)明樣品采集、處理與保存所導(dǎo)致的穩(wěn)定同位素變化對(duì)評(píng)價(jià)生物營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位的影響,我們首先定義穩(wěn)定同位素不確定性為真值與檢測(cè)值之間的同位素差異, 即由于樣品采集、處理和保存引起的生物穩(wěn)定同位素變化(圖 1a)。這張圖反映的是消費(fèi)者樣品采集的不確定性(U)與樣品真值(T)之間的穩(wěn)定同位素變異, 以及不確定性的度量與二者的關(guān)系; 在此基礎(chǔ)上, 我們進(jìn)一步定義了一個(gè)基于穩(wěn)定同位素的食物網(wǎng), 包括一個(gè)消費(fèi)者(T)及4個(gè)潛在食物來(lái)源(數(shù)字, 圖 1b), 其中A、B、C、D分別為定義的四種不確定性條件。通過(guò)使用基于同位素質(zhì)量平衡建立的Isosource模型[20]對(duì)該食物網(wǎng)中生物營(yíng)養(yǎng)來(lái)源模擬。從圖 2可以看出, 生物的4種食物來(lái)源相對(duì)比例在真實(shí)條件和其他不同的不確定性條件下的變化。由于D這種極端情形已經(jīng)分布在食物來(lái)源的同位素范圍之外, 因此無(wú)法給出其分布頻次特征圖。

以上4個(gè)案例反映了在一個(gè)簡(jiǎn)單食物網(wǎng)中捕食者對(duì)4種食物來(lái)源利用的特征。通過(guò)IsoSource模型的模擬和預(yù)測(cè), 我們可以看到由于捕食者自身同位素特征的不確定性對(duì)評(píng)價(jià)食物來(lái)源幅度和方向均會(huì)產(chǎn)生一定水平的影響。這種對(duì)生物營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位的判別不確定性取決于生物穩(wěn)定同位素組成變異的幅度, 同樣也受到食物自身的穩(wěn)定同位素變異的影響。因此, 由于樣品采集、處理與保存所導(dǎo)致的樣品穩(wěn)定同位素的不確定性會(huì)影響對(duì)所研究的系統(tǒng)不同生物營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位的判斷。通過(guò)減小樣品采集、處理與保存所導(dǎo)致的樣品穩(wěn)定同位素的不確定性對(duì)于減小評(píng)判生物營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位的變異至關(guān)重要; 同時(shí)也有助于同位素?cái)?shù)據(jù)的解釋和對(duì)食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)與功能的正確認(rèn)識(shí)。

2 生物樣品的采集

2.1 樣品采集與保存的容器

由于穩(wěn)定同位素分析所需樣品量非常少, 樣品受到污染的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較高[21]。因此所有樣品采集裝置及樣品容器(例如Eppendorf管、錫紙和玻璃管等)都應(yīng)預(yù)先使用10%HCl浸泡30min, 用去離子水反復(fù)清洗3次, 然后干燥備用。此外, 玻璃器皿(抽濾裝置、過(guò)濾漏斗和小玻璃瓶等)應(yīng)在在馬弗爐中450℃預(yù)燒4h備用。這兩種處理方法主要用于消除無(wú)機(jī)和有機(jī)碳和氮的影響[7]。樣品容器的標(biāo)簽通常包含以下信息, 如樣品編號(hào)、取樣時(shí)間、取樣地點(diǎn)、取樣類型、分析項(xiàng)目、現(xiàn)場(chǎng)處理方式和采樣人, 并且與采樣現(xiàn)場(chǎng)記錄和其他樣品記錄相對(duì)應(yīng),例如坐標(biāo)、天氣、水體理化特征等。

圖1 不確定性度量及消費(fèi)者與四種食物來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)關(guān)系定義Fig. 1 Measurement of uncertainty and the defined trophic system composed of one consumer and its four potential food sources

圖2 消費(fèi)者四種食物來(lái)源不同情境下的分布頻次特征Fig. 2 Frequency of consumer’s four food sources in different contexts

2.2 初級(jí)生產(chǎn)者

懸浮顆粒有機(jī)物是水體中生物地球化學(xué)循環(huán)的重要組成部分, 是食物網(wǎng)底層最重要的物質(zhì)與能量提供者[22]。采集懸浮顆粒有機(jī)物樣品需使用玻璃纖維濾膜。濾膜孔徑大小根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案決定。因?yàn)椴煌瑏?lái)源或批次的濾膜可能包含大量且不同的碳或氮的污染, 所以采集前濾膜在馬弗爐中450℃預(yù)燒4h備用。水樣首先經(jīng)200—250 μm浮游生物網(wǎng)預(yù)過(guò)濾, 以避免懸浮顆粒有機(jī)物顆粒大小的非均質(zhì)性。預(yù)過(guò)濾水樣如果無(wú)法在采樣現(xiàn)場(chǎng)立即過(guò)濾, 則應(yīng)及時(shí)低溫避光運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室, 并在12h內(nèi)完成過(guò)濾。水樣過(guò)濾前搖勻使用。過(guò)濾后懸浮顆粒有機(jī)物濾膜直接烘干至恒重(60℃, 48h)或冷凍干燥。如不能及時(shí)干燥, 濾膜則需低溫保存(-20℃)。在懸浮顆粒有機(jī)物含量較低的情況下, 可以在濾膜烘干前或后將表面有機(jī)物剝離或刮離下來(lái), 這樣一方面可以降低濾膜本身對(duì)樣品中碳或氮含量的稀釋作用, 同時(shí)也可以延長(zhǎng)元素分析儀-同位素質(zhì)譜聯(lián)用儀中燃燒系統(tǒng)的使用壽命[23]。

應(yīng)在采樣地點(diǎn)用浮游生物網(wǎng)(根據(jù)實(shí)際需要選擇網(wǎng)孔大小)收集足夠的藻類材料。在顯微鏡下將非藻類顆粒物用毛吸管手動(dòng)吸出。將剩余部分過(guò)濾到孔徑為10—30 μm的濾膜上, 然后存儲(chǔ)在液態(tài)氮中。在實(shí)驗(yàn)室中用離心方法(1min, 10000×g)進(jìn)一步將藻類與其他有機(jī)顆粒分離。將離心管上部綠色部分分離鏡檢, 再次手動(dòng)移除非藻類物質(zhì), 并用去離子水沖洗, 如此反復(fù)3次。最后鏡檢記錄藻類樣品優(yōu)勢(shì)種組成[24]。浮游生物學(xué)家也設(shè)計(jì)了多種特殊的離心裝置來(lái)收集藻類細(xì)胞[25]; 同時(shí), 還有藻類群體色素特殊化合物的同位素分析[26]以及流式細(xì)胞分離耦聯(lián)同位素分析[27]等方法。這些方法需要特殊儀器設(shè)備, 生態(tài)系統(tǒng)研究中的應(yīng)用具有一定局限性。此外, 也有學(xué)者利用光誘導(dǎo)遷移方法分離沉積物底棲藻類, 但也受到生物類型以及牧食者對(duì)藻類攝食習(xí)性等因素的限制[23,28]。藻類樣品直接烘干至恒重(60℃, 48h)或冷凍干燥。如不能及時(shí)干燥, 濾膜則需低溫保存(-20℃)。

其他常見(jiàn)初級(jí)生產(chǎn)者包括水生維管束植物、附著藻類以及沉積物有機(jī)物等等。水生維管束植物的樣品相對(duì)較易獲得。取活體水生維管束植物的葉片或整株。將其表面附著藻刮洗后, 用去離子水反復(fù)沖洗3次。水生維管束植物樣品直接烘干至恒重(60℃, 48h)或冷凍干燥。如不能及時(shí)干燥, 濾膜則需低溫保存(-20℃)。附著藻類通常采集方法為現(xiàn)場(chǎng)刮取或刷洗水生植物、石頭或其他非生物表面的附著物獲得。用去離子水或現(xiàn)場(chǎng)過(guò)濾的水樣沖洗附著藻類3次, 直接烘干至恒重(60℃, 48h)或冷凍干燥。如生物量較低可過(guò)濾至預(yù)燒的濾膜上后進(jìn)行烘干或保存[28]。沉積物有機(jī)物采集方法為現(xiàn)場(chǎng)用沉積物采集器獲得表層或柱狀樣品, 用500目篩網(wǎng)過(guò)篩, 去除大型底棲動(dòng)物活體或殘骸, 以及大尺寸顆粒, 以便獲得均勻性較高的穩(wěn)定同位素樣品。樣品放入酸洗容器, 低溫運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室, 直接烘干至恒重(60℃, 48h)或冷凍干燥[28]。

2.3 消費(fèi)者

底棲動(dòng)物大型底棲動(dòng)物樣品通常用彼得森采泥器采集表層沉積物, 經(jīng)分樣篩原位手動(dòng)分檢,鑒定生活史階段及種屬特征[29]。分離樣品量需根據(jù)物種個(gè)體大小以及儀器分析精度來(lái)確定。在樣品收集過(guò)程中應(yīng)注意水體基本特征, 包括生境特征和底棲動(dòng)物生活史。以搖蚊幼蟲(chóng)為例, 幼蟲(chóng)期需要30—50個(gè)個(gè)體混合才能滿足一次穩(wěn)定同位素測(cè)試,混合樣品可以避免種間差異的影響; 而對(duì)于三、四齡幼蟲(chóng)也可以進(jìn)行個(gè)體測(cè)定, 一方面可以反映相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間的攝食特征, 同時(shí)也可以觀測(cè)個(gè)體食性的差異[30]。

浮游動(dòng)物浮游動(dòng)物樣品的收集可以根據(jù)實(shí)際情況選擇不同孔徑大小的浮游生物網(wǎng)進(jìn)行。在樣品收集后, 保持活體低溫保鮮(4℃)運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室, 進(jìn)行活體鏡鑒與分離。如果是為了獲取混合浮游動(dòng)物樣品, 則需通過(guò)鏡鑒出去肉眼可見(jiàn)的非浮游動(dòng)物物質(zhì), 例如碎屑。如果是為了獲得優(yōu)勢(shì)種類樣品, 則可以通過(guò)微毛細(xì)管, 在解剖鏡或顯微鏡下挑取分離。由于個(gè)體大小的差異, 分析所需單個(gè)測(cè)試樣品可能有數(shù)十個(gè)到幾百個(gè)組成。分離純化后的浮游動(dòng)物樣品放置在盛有去離子水的器皿中, 等待進(jìn)一步處理[31]。分離樣品3—5份待測(cè), 樣品的浮游動(dòng)物種類、大小等信息同步記錄[32]。

魚(yú)類就魚(yú)類樣品而言, 由于魚(yú)類個(gè)體的不同組織間同位素特征值有所不同, 因此選擇何種組織進(jìn)行分析將會(huì)影響對(duì)營(yíng)養(yǎng)關(guān)系的解釋。通常取魚(yú)類背部白色肌肉來(lái)指示個(gè)體穩(wěn)定同位素特征。如果魚(yú)類個(gè)體較小, 則取魚(yú)類整體(去除腸含物或內(nèi)臟)作為同位素分析對(duì)象。在許多情況下, 由于不能傷害魚(yú)類(如受保護(hù)魚(yú)類), 則采集魚(yú)類其他組織, 例如鰭條、血液、體表黏液和鱗片等等。由于不同組織的同位素周轉(zhuǎn)特征差異顯著, 可導(dǎo)致其同位素與個(gè)體同位素產(chǎn)生差異, 從而影響對(duì)數(shù)據(jù)的解釋。例如黏液穩(wěn)定同位素周轉(zhuǎn)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于其肌肉[33]。那么這些同位素周轉(zhuǎn)快的組織(如胰腺、血液、體表黏液等)通?？梢杂脕?lái)指示生物近期(數(shù)天至數(shù)周)的營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位; 而同位素周轉(zhuǎn)慢的組織(如肌肉和鱗片等)其同位素特征可以指示中長(zhǎng)期(數(shù)月至數(shù)年)的營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位[34]。需要注意的一點(diǎn)就是, 不同組織同位素特征的差異一方面是由于同位素周轉(zhuǎn)周期不同引起的, 另外一種因素就是不同組織脂類含量變化引起的。在同一個(gè)體的某一組織中, 脂類通常比蛋白質(zhì)和碳水化合物等物質(zhì)的碳穩(wěn)定同位素偏低。因此, 在同位素分析前對(duì)不同組織或器官進(jìn)行去脂處理(參見(jiàn)去脂部分)[35]。

3 生物樣品的處理

3.1 腸道排空

腸含物對(duì)小個(gè)體生物穩(wěn)定同位素可能存在一定影響。通常在生產(chǎn)力較高的水體這種影響相對(duì)較高。因此, 浮游動(dòng)物與底棲動(dòng)物經(jīng)分離后需要在去離子水中暫養(yǎng)。暫養(yǎng)時(shí)間視個(gè)體大小而定。通常浮游動(dòng)物需要4h以上, 而底棲動(dòng)物需要12h以上。暫養(yǎng)結(jié)束后可通過(guò)顯微鏡鏡鑒確定是否完全排空[36,37]。本過(guò)程也適用于其他以個(gè)體為分析對(duì)象的小型生物。在暫養(yǎng)過(guò)程中, 需及時(shí)移除水體中的糞便, 以避免某些生物的自食糞便的特點(diǎn)。

3.2 酸化

由于有機(jī)樣品采集過(guò)程中易受到碳酸鹽的潛在影響而改變樣品的穩(wěn)定同位素特征[38]。因此需要對(duì)易受此類影響的樣品, 包括沉積物有機(jī)物、懸浮顆粒有機(jī)物、有機(jī)碎屑和大型水生植物等, 進(jìn)行酸化處理。由于酸化處理會(huì)在某種程度上改變氮同位素的含量[39], 因此建議酸化樣品前將樣品分為兩個(gè)部分, 一部分酸化后用于碳穩(wěn)定同位素的分析,另一部分不酸化用于其他同位素分析[38]。酸化采用1 mol/L HCl, 過(guò)量加入樣品后直至反應(yīng)結(jié)束氣泡消失, 用去離子水沖洗3次后待用[40]。

3.3 去脂

生物組織中脂類δ13C值相對(duì)于其他生物化學(xué)物質(zhì)較低, 其原因?yàn)樵谥惡铣蛇^(guò)程中丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶 A時(shí)存在重同位素歧視效應(yīng)[16]。此外, 動(dòng)物脂肪蓄積反映了生活史不同時(shí)期的能力需求, 受到生境、大小和生長(zhǎng)時(shí)期的多種因素影響。因此組織中脂類含量可以影響樣品δ13C, 并可能導(dǎo)致對(duì)生物營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位的錯(cuò)誤解釋。因此, 在分析樣品同位素之前在分析之前對(duì)樣品進(jìn)行脂類提取, 主要方法有chloroform-methanol[41]和hexane-isopropanol[42]。通常, 當(dāng)樣品C:N>4時(shí), 可參考使用脂類含量的校正公式[43—46]。通過(guò)比較脂類提取前后的白色肌肉組織的同位素比率, 研究人員發(fā)現(xiàn)由于白色肌肉組織脂類含量較低所以同位素變化無(wú)顯著差異[45]。但是脂類含量受到多種因素影響, 因此特定研究仍需要確定特定物種各生活時(shí)期的修正系數(shù), 以保證分析和解釋的準(zhǔn)確性[12]。

4 生物樣品的保存

樣品從采集、處理到檢測(cè)之前的需要經(jīng)過(guò)保存過(guò)程, 才可以在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析。此外, 博物館與各類科研機(jī)構(gòu)標(biāo)本館中也保存了大量的樣品。因此, 如果上述各類過(guò)程中保存技術(shù)會(huì)改變的樣品同位素特征, 那么也會(huì)導(dǎo)致隨后對(duì)生物營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位的誤判, 以及影響對(duì)食物網(wǎng)歷史變化特征的重建[8]。

4.1 冷凍與烘干

在樣品采集、處理與運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中冷凍、冷凍干燥和烘干保存是現(xiàn)階段最理想的方法[21]。盡管絕大多數(shù)報(bào)道均認(rèn)為冷凍或凍干不影響樣品的同位素組成[8,48—50], 也有報(bào)道表明冷凍在短期內(nèi)不影響同位素特征, 長(zhǎng)時(shí)間保存也會(huì)影響同位素特征, 特別是對(duì)于無(wú)脊椎動(dòng)物的保存(例如浮游動(dòng)物)[8,35]。其原因推測(cè)為在解凍處理過(guò)程中, 樣品細(xì)胞破裂導(dǎo)致部分同位素流失所引起的[35]。在過(guò)去的20年間, 樣品保存使用最多的方法就是低溫烘干的方法。通常采用60℃烘箱24—48h。這取決于樣品的大小與含水量, 其原則為烘干至恒重。近期研究表明魚(yú)類肌肉樣品烘干長(zhǎng)期保存對(duì)穩(wěn)定同位素組成沒(méi)有任何影響, 因此烘干可以作為首選的保存方法[51]。但是烘干對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物的保存效果, 仍需進(jìn)一步研究確定。我們建議使用60℃對(duì)樣品進(jìn)行烘干, 以保證烘干的穩(wěn)定性和結(jié)果的可比性[51,52]。

4.2 乙醇與福爾馬林

許多研究表明乙醇和福爾馬林保存會(huì)顯著影響樣品的穩(wěn)定同位素含量。主要可能的因素為乙醇和福爾馬林自身的碳可能會(huì)污染樣品本身從而影響他們的δ13C值, 加上乙醇和福爾馬林作為一種溶劑會(huì)溶解出樣品自身的一些有機(jī)物質(zhì), 例如脂類或蛋白質(zhì)[45,51]。因此, 這兩種保存方法并不適合用于穩(wěn)定同位素樣品的保存[8,47,53]。同時(shí), 福爾馬林對(duì)人體有危害作用, 乙醇由于易燃不適和長(zhǎng)途攜帶。但是由于博物館或標(biāo)本館中用此類方法保存了大量的生物樣本[45], 而實(shí)際上這兩種保存方法在一定時(shí)間后相對(duì)穩(wěn)定[8,48,51,54], 因此在分析此類長(zhǎng)期保存的樣本之前, 必須了解樣本的保存方法、時(shí)間、樣品類型, 進(jìn)而開(kāi)展保存實(shí)驗(yàn), 一起獲得合理的校正因子[8,48,51,54]。

4.3 腌漬

在許多偏遠(yuǎn)地區(qū)采樣過(guò)程中, 由于供電無(wú)法保證, 所以冷凍或烘干保存收到一定限制, 因此腌漬這種保存方法就顯得十分必要了。通常使用飽和氯化鈉水溶液保存樣品[8]。研究表明飽和氯化鈉水溶液保存對(duì)魚(yú)類肌肉穩(wěn)定同位素含量沒(méi)有顯著影響[54]。但直接用氯化鈉腌制則存在影響生物組織穩(wěn)定同位素的可能[8,54]。因此, 在使用此類方法是需要判斷樣品的類型對(duì)此類保存方法的響應(yīng)[49,54]。

4.4 進(jìn)樣前處理

進(jìn)行樣品同位素分析前, 第一, 對(duì)樣品中的結(jié)締組織進(jìn)行清理; 第二, 所有化學(xué)方法保存的樣品,均需用去離子水漂洗3次; 第三, 樣品研磨成均勻粉末, 避免研磨過(guò)程中的交叉污染; 第四, 樣品裝載到錫杯過(guò)程中, 對(duì)應(yīng)編號(hào)并記錄裝載量[8]。

5 總體建議

在運(yùn)用穩(wěn)定同位素技術(shù)研究水域生態(tài)系統(tǒng)時(shí),首先要制訂科學(xué)的采樣計(jì)劃(圖 3)。根據(jù)采樣計(jì)劃對(duì)收集樣品的工具進(jìn)行處理(酸化或預(yù)燒, 消除收集樣品工具可能帶來(lái)的誤差)。使用處理后的工具收集相關(guān)樣品, 對(duì)于采集到的初級(jí)生產(chǎn)者, 需要根據(jù)大小和種類進(jìn)行分類, 然后進(jìn)行鏡檢、純化和均一化, 初級(jí)生產(chǎn)者樣品在測(cè)定碳同位素時(shí)需要對(duì)容易產(chǎn)生誤差的樣品進(jìn)行酸化處理(如濾膜樣品、表層沉積物樣品等); 對(duì)于采集到的浮游動(dòng)物和底棲動(dòng)物樣品, 需要根據(jù)種類、生活史和大小進(jìn)行分類,然后進(jìn)行鏡檢、純化和均一化, 接下來(lái)是排除腸含物;對(duì)于采集到的魚(yú)類樣品, 經(jīng)過(guò)鑒定和組織分離后,對(duì)于需要去脂的樣品進(jìn)行去脂處理。對(duì)于需要保存的樣品, 直接采集的樣品可以首先經(jīng)過(guò)60℃烘干或冷凍干燥, 然后保存在有干燥器的容器中待測(cè);也可以在-20℃冷凍保存至樣品處理。博物館等化學(xué)保存的樣品, 需要設(shè)計(jì)相關(guān)方法學(xué)實(shí)驗(yàn)計(jì)算出相關(guān)的校正系數(shù), 以便于得出準(zhǔn)確的結(jié)果。樣品進(jìn)入質(zhì)譜前, 需要將樣品60℃烘干至恒重, 然后在經(jīng)過(guò)酸化或者預(yù)燒過(guò)的工具中對(duì)樣品進(jìn)行研磨, 等待測(cè)試; 在這個(gè)過(guò)程中, 必須盡量防止對(duì)樣品的污染(包括樣品間的交叉污染)。

圖3 建議在穩(wěn)定同位素生態(tài)學(xué)中對(duì)水生生物樣品收集、處理和保存的步驟圖Fig. 3 Diagram of the logical steps suggested for sample collection, handling and preservation of aquatic organisms in stable isotope ecology

5.1 關(guān)于樣品采集的總體建議

(1)所有樣品采集裝置及樣品容器使用前必須進(jìn)行酸洗或高溫預(yù)燒;

(2)初級(jí)生產(chǎn)者樣品采集需依據(jù)研究目的進(jìn)行分類、清洗和鑒定, 并確保均一性;

(3)小個(gè)體消費(fèi)者樣品采集需依據(jù)研究目的進(jìn)行分類、清洗和鑒定, 并確保均一性; 大個(gè)體消費(fèi)者采集需區(qū)分樣品的生活史以及組織器官。

5.2 關(guān)于樣品處理的總體建議

(1)腸含物對(duì)小個(gè)體生物穩(wěn)定同位素可能存在一定影響, 因此采集后的小個(gè)體樣品需進(jìn)行腸道排空處理。

(2)由于有機(jī)樣品采集過(guò)程中易受到碳酸鹽的潛在影響, 因此需要對(duì)易受此類影響的樣品, 包括沉積物有機(jī)物、懸浮顆粒有機(jī)物、有機(jī)碎屑和大型水生植物等, 進(jìn)行酸化處理。

(3)生物組織中脂類δ13C值相對(duì)于其他生物化學(xué)物質(zhì)較低, 因此, 在分析樣品同位素之前在分析之前對(duì)樣品進(jìn)行脂類提取。

5.3 關(guān)于樣品保存的總體建議

(1)在樣品采集和處理與運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中冷凍、冷凍干燥和烘干保存是現(xiàn)階段最理想的方法;

(2)對(duì)于已經(jīng)用化學(xué)方法保存的樣品, 應(yīng)進(jìn)行保存方法的預(yù)試驗(yàn)研究, 確定同位素變異的大小; 對(duì)于穩(wěn)定變異的保存, 可以通過(guò)預(yù)試驗(yàn)獲得短期或長(zhǎng)期保存的校正系數(shù)。

致謝:

感謝華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院與湖北大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院部分實(shí)習(xí)學(xué)生幫助本文中部分資料的收集與整理。