李依琳 張義兵

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

近20多年來, 識(shí)別病毒感染信號(hào)的細(xì)胞受體的發(fā)現(xiàn), 加深了我們?cè)诜肿铀缴蠈?duì)干擾素(Interferon, IFN)抗病毒免疫反應(yīng)機(jī)制的理解。病毒在細(xì)胞中復(fù)制產(chǎn)生的病毒核酸, 稱為病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs), 能快速被宿主細(xì)胞表達(dá)的受體分子, 稱為模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors, PRRs)所識(shí)別, 然后激活一連串的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng), 最后誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞IFN、促炎因子和其他下游效應(yīng)蛋白的表達(dá), 清除病毒在細(xì)胞中的感染[1]。機(jī)體IFN介導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)需要適度啟動(dòng)和激發(fā), 因此在應(yīng)對(duì)病毒感染時(shí), 在不同的細(xì)胞類型、不同的感染時(shí)間都受到不同機(jī)制參與的精確調(diào)控。

1 RLR介導(dǎo)的IFN抗病毒免疫通路

哺乳類細(xì)胞主要表達(dá)兩類模式識(shí)別受體, 用于感知病毒RNA誘導(dǎo)IFN抗病毒免疫反應(yīng): 表達(dá)于內(nèi)吞體(Endosome)膜上的TLR3/7/8/9(Toll-like receptor 3, 7, 8, 9)和表達(dá)于胞漿中的RLR受體。前者識(shí)別細(xì)胞內(nèi)吞病毒后產(chǎn)生的病毒RNA, 后者識(shí)別病毒復(fù)制時(shí)在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生的RNA。RLR受體家族有三個(gè)成員: RIG-Ⅰ (Retinoic acid-inducible gene Ⅰ)、MDA5 (Melanoma differentiation-associated protein 5)和LGP2(Laboratory of genetics and physiology 2)。TLR受體一般在免疫細(xì)胞中表達(dá), 而RIG-Ⅰ和MDA5在大多數(shù)細(xì)胞類型中都表達(dá), 只是在沒有病毒入侵時(shí)表達(dá)量很低, 但在病毒感染后被大量誘導(dǎo)表達(dá)[1]。因此, 在IFN抗病毒免疫反應(yīng)中RLR信號(hào)受到更多的關(guān)注和研究。RIG-Ⅰ和MDA5蛋白包含兩個(gè)N端半胱天冬酶激活和募集結(jié)構(gòu)域(Caspase activation and recruitment domain, CARD), 主要負(fù)責(zé)將受體感知信號(hào)傳導(dǎo)到下游分子; 此外, 還有一個(gè)中央DExD/H-box解旋酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C末端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain, CTD), 在識(shí)別和結(jié)合病毒RNA中發(fā)揮重要作用[2]。與RIG-Ⅰ和MDA5相比,LGP2缺乏N端的CARD結(jié)構(gòu)域, 通常被認(rèn)為在RLR信號(hào)傳導(dǎo)中起調(diào)節(jié)作用[3]。

自2003年在斑馬魚中首次鑒定出第一個(gè)魚類ifn基因后, 魚類干擾素介導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)研究獲得了重要進(jìn)展[4—6]。魚類同樣存在RLR介導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)途徑[7—9]。盡管還缺乏很多直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù), 但是目前的研究表明, 魚類RIG-Ⅰ和MDA5一旦結(jié)合了病毒RNA之后, 就會(huì)與定位于線粒體上的關(guān)鍵接頭蛋白MAVS (Mitochondrial antiviral-signaling, 也被稱為VISA, CARDIF和IPS-1)結(jié)合。MAVS作為一個(gè)信號(hào)平臺(tái), 繼續(xù)招募并激活蛋白激酶TBK1(TANK binding kinase 1), 激活后的TBK1隨即磷酸化激活轉(zhuǎn)錄因子IRF3(IFN regulatory factor 3)和IRF7, 并促使IRF3/7從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入到細(xì)胞核與ifn基因啟動(dòng)子結(jié)合, 從而啟動(dòng)ifn基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。表達(dá)的IFN蛋白分泌到細(xì)胞外, 然后通過自分泌和旁分泌途徑, 與感染病毒的細(xì)胞和未感染細(xì)胞的細(xì)胞膜上的IFN受體結(jié)合, 激活下游的JAKSTAT(Janus kinase-Signal Transducer and Activator of Transcription)信號(hào)通路, 最終誘導(dǎo)下游干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes, ISGs)的表達(dá)。有些ISG編碼抗病毒蛋白, 如Mx、PKR和ISG15等, 直接發(fā)揮抗病毒作用[10—13]; 而有些ISG編碼蛋白依據(jù)其被病毒誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)空規(guī)律, 在不同細(xì)胞中和不同感染階段, 對(duì)RLR介導(dǎo)的IFN抗病毒反應(yīng)發(fā)揮調(diào)控作用[14,15], 適時(shí)協(xié)調(diào)機(jī)體觸發(fā)的IFN反應(yīng)水平與病毒感染程度達(dá)到最佳平衡狀態(tài)。一方面避免因IFN反應(yīng)不足導(dǎo)致病毒不易消除干凈, 另一方面也避免因過度反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生自身免疫性疾病的情況發(fā)生。因此, RLR介導(dǎo)的IFN信號(hào)途徑受到多方面的嚴(yán)格調(diào)控, 其中就包括由泛素化和去泛素化介導(dǎo)的翻譯后修飾調(diào)控。

2 泛素化與去泛素化修飾

泛素(Ubiquitin, Ub)是20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)的一個(gè)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮調(diào)控作用的小蛋白分子。泛素分子可以通過E1-泛素活化酶(Ubiquitin-activating enzyme, E1)、E2-泛素結(jié)合酶(Ubiquitin-conjugating enzyme, E2)、E3-泛素蛋白連接酶(Ubiquitinligation enzyme, E2) 等三種酶參與的級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)底物蛋白進(jìn)行泛素化修飾、以及在去泛素化酶(deubiquitinases, DUBs)的參與下發(fā)生底物蛋白的去泛素化。這種以可逆、可誘導(dǎo)的方式對(duì)底物蛋白進(jìn)行的泛素化和去泛素化修飾幾乎能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)所有重要的生命活動(dòng)[16,17]。泛素可以單分子或以多分子形成聚合物鏈的形式附著于底物蛋白的賴氨酸殘基上, 稱為泛素化修飾。在聚合物鏈中, 連續(xù)的泛素分子通過特定的肽鍵連接。多聚泛素鏈的形成依賴于泛素蛋白的賴氨酸殘基。泛素蛋白由76個(gè)氨基酸組成, 其N端第一個(gè)氨基酸蛋氨酸(M1)和所有7個(gè)賴氨酸(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)都可以作為受體位點(diǎn), 在E1-泛素活化酶和E2-泛素結(jié)合酶的作用下聚合成不同類型的泛素鏈。E3-泛素蛋白連接酶則決定泛素鏈與特異性底物的結(jié)合, 從而改變底物蛋白的細(xì)胞定位以及蛋白活性[16,17]。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中, 目前已發(fā)現(xiàn)2個(gè)E1(Uba1,又稱Ube1和Uba6), 40多個(gè)E2以及600多個(gè)E3。E3泛素連接酶按照結(jié)構(gòu)特點(diǎn)主要有四類: RING(Really interesting new gene)結(jié)構(gòu)域家族、HECT結(jié)構(gòu)域家族(Homologous to E6-associated protein Cterminus)、RBR蛋白家族(RING-in-between RING)和RING拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)類似的U-box蛋白家族(UFD2 homology)。RING E3泛素連接酶可以細(xì)分為單分子RING E3和多亞基E3復(fù)合物, 如SCF、APC/C、Cullin 2/Elongin B/C/VHL等均屬于多亞基E3復(fù)合物。目前研究得比較清楚的是, K63位聚合泛素鏈(K63-linked polyubiquitination)修飾底物通?；罨孜? 而K48位泛素化修飾則導(dǎo)致底物降解。因?yàn)榉核鼗鶊F(tuán)可以通過泛素分子中的八個(gè)殘基位點(diǎn)進(jìn)行連接, 因此為多聚泛素鏈種類的多樣性提供了無限可能[16], 導(dǎo)致底物蛋白產(chǎn)生各種不同的泛素化修飾, 從而對(duì)IFN抗病毒免疫反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)精確調(diào)控。

人類去泛素化酶基因有近100種, 可分為以下六種類型: 泛素特異型加工蛋白酶家族(Ubiquitinspecific processing enzymes, UBPs或Ubiquitin-specific proteases, USPs, 共54個(gè)家族成員), 泛素羧基末端水解酶家族(Ubiquitin C-terminal hydrolases,UCHs, 4個(gè)成員), Josephin結(jié)構(gòu)域蛋白酶家族(4個(gè)成員), 卵巢腫瘤相關(guān)蛋白酶家族(Ovarian tumor protein, OUT, 16個(gè)成員), MINDY家族(the motif interacting with ubiquitin (MIU)-containing novel DUB family, 4個(gè)成員), 以及JAMM金屬蛋白酶家族(Zndependent JAB1/MPN/MOV34 metalloprotease, 也稱為MPN+, 16個(gè)成員)。去泛素化酶通過水解泛素羧基末端的酯鍵、肽鍵或異肽鍵, 將泛素分子特異性地從鏈接有泛素的蛋白質(zhì)或者前體蛋白水解下來, 也就是對(duì)底物蛋白的泛素化進(jìn)行反向調(diào)節(jié), 最終影響蛋白功能。

3 RLR通路中的泛素化修飾調(diào)控

3.1 RIG-Ⅰ

哺乳類RIG-Ⅰ的泛素化修飾調(diào)控2004年,RIG-Ⅰ被鑒定是一個(gè)重要的識(shí)別胞漿病毒核酸的模式識(shí)別受體[18]。RIG-Ⅰ的磷酸化和泛素化之間存在著串?dāng)_互作, 直接調(diào)節(jié)RIG-Ⅰ介導(dǎo)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在正常細(xì)胞中, RIG-Ⅰ的CARD和CTD結(jié)構(gòu)域受到強(qiáng)烈磷酸化, RIG-Ⅰ處于“自身抑制”的無活性狀態(tài), 此時(shí)RIG-Ⅰ的泛素化修飾程度也最低。在病毒感染的細(xì)胞中, RIG-Ⅰ的DExD/H-box和CTD結(jié)構(gòu)域與病毒RNA結(jié)合, 很快發(fā)生去磷酸化, 隨及觸發(fā)RIG-Ⅰ的K63位泛素化修飾, 導(dǎo)致RIG-Ⅰ被激活, 從而將病毒感染信號(hào)通過MAVS向下游途徑傳遞, 最終誘導(dǎo)IFN及ISG的表達(dá)。Oshiumi等[19]認(rèn)為兩個(gè)E3泛素連接酶 TRIM25(Tripartite motif 25)和Riplet(又稱為RNF135, ring finger protein 135, 或REUL, RIG-Ⅰ E3 ubiquitin ligase)參與了RIG-Ⅰ的泛素化激活(圖 1)。TRIM25的功能在2007年由Gack等[20]首次發(fā)現(xiàn)。鑒于RIG-Ⅰ在無病毒感染時(shí)N端的2個(gè)CARD結(jié)構(gòu)被C端結(jié)構(gòu)域所掩藏, RIG-Ⅰ處于一種“自身抑制”的無活性狀態(tài), Gack等[20]用GST-RIG-Ⅰ(2CARD)(即只有N端的2個(gè)CARD結(jié)構(gòu)域)來代替全長(zhǎng)的RIG-Ⅰ開展實(shí)驗(yàn)。他們由此發(fā)現(xiàn)TRIM25介導(dǎo)RIG-Ⅰ蛋白的第二個(gè)CARD結(jié)構(gòu)域中的K172氨基酸發(fā)生K63泛素化, 且發(fā)現(xiàn)RIG-Ⅰ(2CARD)必須先產(chǎn)生泛素化修飾后才能被激活,然后啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[21]。隨后Zeng等[22]通過體外的生化重構(gòu)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TRIM25能泛素化激活RIG-Ⅰ( 2CARD)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的事實(shí)。

圖1 魚類和哺乳類RLR介導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)的泛素化修飾調(diào)控Fig. 1 (De) ubiquitination-mediated regulation of antiviral immune RLR-signaling pathway in mammal and fish

需要指出的是, 由于轉(zhuǎn)染RIG-Ⅰ的N端CARD結(jié)構(gòu)域就能成功模擬RIG-Ⅰ介導(dǎo)IFN反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程, 因此, 泛素化修飾的研究最初使用的是截短的N端CARDs, 而不是野生型的全長(zhǎng)RIG-Ⅰ[19—22]。然而, 這種研究方式的缺陷逐漸顯露出來。后續(xù)的比較研究發(fā)現(xiàn), 過量表達(dá)TRIM25能激活全長(zhǎng)RIG-Ⅰ蛋白介導(dǎo)的IFN信號(hào), 但是激活的信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)小于激活RIG-Ⅰ( 2CARD)介導(dǎo)的信號(hào), 而且發(fā)現(xiàn)另外一種E3泛素連接酶Riplet/RNF135在TRIM25激活全長(zhǎng)RIG-Ⅰ的信號(hào)通路中發(fā)揮作用[19]。與TRIM25結(jié)合并泛素化RIG-Ⅰ的CARD不同, Riplet/RNF135直接結(jié)合并泛素化RIG-Ⅰ蛋白的C端RD結(jié)構(gòu)域(735—925 aa), 從而釋放RIG-Ⅰ蛋白 RD(Repression domain)對(duì)CARDs的自我抑制[19]。Riplet能促進(jìn)TRIM25與全長(zhǎng)RIG-Ⅰ蛋白之間的互作, 因?yàn)镽IG-Ⅰ蛋白K788R位點(diǎn)的突變不僅削弱Riplet介導(dǎo)的RIG-Ⅰ泛素化, 而且嚴(yán)重影響TRIM25與全長(zhǎng)RIG-Ⅰ蛋白之間的互作。因此, Oshiumi等[19]認(rèn)為,Riplet介導(dǎo)的RIG-Ⅰ蛋白C端RD的聚泛素化修飾是TRIM25激活RIG-Ⅰ的先決條件。然而, 在2019年的一項(xiàng)研究中, Cadena等[23]發(fā)現(xiàn)野生型全長(zhǎng)RIG-Ⅰ蛋白的泛素化修飾激活絕對(duì)依賴于Riplet而不是TRIM25?；蚯贸龑?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), TRIM25有無對(duì)于全長(zhǎng)RIG-Ⅰ信號(hào)傳導(dǎo)沒有影響, 僅對(duì)GST-2CARD的信號(hào)傳導(dǎo)有中等刺激作用。鑒于Riplet基因缺失不影響GST-2CARD介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo), 因此, GST-2CARD介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制完全不同于全長(zhǎng)RIG-Ⅰ蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[23]。

質(zhì)譜分析表明, RIG-Ⅰ蛋白CRAD的結(jié)構(gòu)域中K99、K169、K172、K181、K190和K193位點(diǎn)都存在K63泛素化修飾[20]。除TRIM25外, TRIM4[24]和MEX3C[25]也通過K63泛素化修飾CARD結(jié)構(gòu)域活化RIG-Ⅰ。此外, RIG-Ⅰ還受到其他泛素連接酶的修飾調(diào)控。如RNF125介導(dǎo)RIG-Ⅰ的K48泛素化,導(dǎo)致RIG-Ⅰ通過蛋白酶體途徑降解, 以免宿主產(chǎn)生過度IFN反應(yīng)引起自身免疫性疾病[26]。RNF122對(duì)K115和K146氨基酸位點(diǎn)的K48泛素化修飾最終驅(qū)動(dòng)RIG-Ⅰ蛋白的降解[27]。TRIM40與RIG-Ⅰ和MDA5蛋白靶向結(jié)合, 通過E3連接酶活性促進(jìn)K27和K48連接的多聚泛素化, 導(dǎo)致靶定蛋白通過蛋白酶體途徑降解。因此, TRIM40缺失則增強(qiáng)宿主的抗病毒免疫反應(yīng)[28]。有報(bào)道E3連接酶CHIP[29]、STUB-1[30]和c-Cbl[31]也通過K48泛素化修飾底物RIG-Ⅰ蛋白、促進(jìn)后者降解。

RIG-Ⅰ也受到了由去泛素化酶介導(dǎo)的去泛素化修飾的調(diào)節(jié)作用。CYLD(Cylindromatosis, 頭帕腫瘤綜合征蛋白)[32]和USP14[33]是一種去泛素化酶,能特異性去除RIG-Ⅰ蛋白的K63位泛素化鏈, 因此是一種調(diào)控RIG-Ⅰ信號(hào)的負(fù)調(diào)節(jié)因子。在poly(I:C)處理和VSV感染的細(xì)胞中, USP3被招募與RIG-Ⅰ結(jié)合, 特異性消除RIG-Ⅰ的K63位泛素化鏈[34]。在沒有病毒感染時(shí), USP21能結(jié)合RIG-Ⅰ并消除蛋白中已發(fā)生的K63位泛素修飾[35]。此外, USP4則靶向RIG-Ⅰ發(fā)生K48泛素化介導(dǎo)的蛋白降解作用, 通過消除K48泛素化、穩(wěn)定細(xì)胞RIG-Ⅰ的表達(dá)[36]。

魚類RIG-Ⅰ的泛素化修飾調(diào)控魚類RIG-Ⅰ同樣受到E3泛素連接酶的修飾調(diào)控。最近的一份研究認(rèn)為斑馬魚中也存在一個(gè)Riplet/RNF135同源基因, 在斑馬魚的不同組織中廣泛表達(dá), poly(I:C)模擬病毒感染能誘導(dǎo)斑馬魚該基因的表達(dá)上調(diào)。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)該斑馬魚基因編碼蛋白能與RIG-Ⅰ結(jié)合。在體外培養(yǎng)細(xì)胞中, 過量表達(dá)該基因?qū)е掳唏R魚RIG-Ⅰ的K63連鎖泛素化, 同時(shí)也促進(jìn)斑馬魚RIG-Ⅰ介導(dǎo)的IFN啟動(dòng)子的激活。這些研究結(jié)果表明, 斑馬魚RNF135同源基因具有保守的功能, 通過調(diào)節(jié)斑馬魚RIG-Ⅰ信號(hào)通路參與了先天免疫應(yīng)答[37]。我們分析目前版本的斑馬魚基因組后,發(fā)現(xiàn)斑馬魚Riplet/RNF135基因的編碼蛋白與人Riplet/RNF135基因的一個(gè)缺少RING結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄剪切體相似。斑馬魚Riplet/RNF135基因只編碼一個(gè)由262氨基酸組成的蛋白, 與人和小鼠Riplet/RNF135編碼蛋白長(zhǎng)度為433個(gè)和417個(gè)氨基酸相比,斑馬魚Riplet/RNF135蛋白缺少N端的RING結(jié)構(gòu)域(該結(jié)構(gòu)域通常賦予蛋白的E3泛素連接酶活性), 而人Riplet/RNF135蛋白如果缺失RING結(jié)構(gòu)域, 不能泛素化修飾全長(zhǎng)RIG-Ⅰ蛋白, 但依然能中等激活RIG-Ⅰ介導(dǎo)的IFN信號(hào)[23]。斑馬魚TRIM25有與哺乳類TRIM25相似的功能。在哺乳類中，TRIM25泛素化修飾RIG-Ⅰ蛋白的CARD結(jié)構(gòu)域[21], 而在斑馬魚中體外實(shí)驗(yàn)表明, TRIM25通過K63泛素化修飾RIG-Ⅰ蛋白的CARD和RD結(jié)構(gòu)域, 上調(diào)干擾素介導(dǎo)抗病毒免疫信號(hào)[38]。考慮到Riplet和TRIM25對(duì)哺乳類RIG-Ⅰ蛋白泛素化活化存在矛盾認(rèn)識(shí), 進(jìn)一步開展魚類RIG-Ⅰ的泛素化研究非常有必要。

3.2 MDA5

哺乳類MDA5的泛素化修飾調(diào)控作用于RIG-Ⅰ的E3泛素連接酶TRIM40, 同樣也結(jié)合MDA5, 并發(fā)生K27和K48連接的多聚泛素化修飾、促進(jìn)MDA5通過蛋白酶體降解。RNF125也能誘導(dǎo)MDA5的K48連接的泛素化并使其降解, 因此負(fù)調(diào)控RLR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[26]。TRIM65與MDA5結(jié)合, 并在MDA5蛋白的K743位點(diǎn)上發(fā)生K63泛素化修飾。這種修飾僅對(duì)RLR受體中的MDA5的寡聚化和激活至關(guān)重要, 因?yàn)槿笔RIM65消除了腦心肌炎病毒(EMCV)誘導(dǎo)的IRF3激活和IFN的產(chǎn)生,但對(duì)RIG-Ⅰ和TLR3介導(dǎo)的信號(hào)沒有影響[39]。作為一種E3泛素連接酶, TRIM13抑制MDA5介導(dǎo)的IFN產(chǎn)生?；蚯贸龑?shí)驗(yàn)表明, EMCV感染的TRIM13-/-小鼠分泌更多的Ⅰ型IFN, 具有更強(qiáng)的病毒抵抗力, 因此獲得更高的存活率[40]。TRIM25除介導(dǎo)RIG-Ⅰ蛋白N端CARD的外, 也K63泛素化修飾MDA5蛋白的CARD結(jié)構(gòu)域[41]。

MDA5的去泛素化調(diào)控研究表明, USP13能消除RIG-Ⅰ和MDA5的K63位泛素化鏈修飾, 從而負(fù)調(diào)控RLR介導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)[34]。體外實(shí)驗(yàn)表明USP17是一種去泛素化酶, 能抑制RIG-Ⅰ、MDA5、MITA、MAVS、IKKε和TRAF3等RLR信號(hào)分子的泛素化水平, 促進(jìn)仙臺(tái)病毒Sev激活的干擾素反應(yīng)[42]。但機(jī)制是否因抑制K48泛素化修飾驅(qū)動(dòng)RIG-Ⅰ和MDA5蛋白的降解還有待研究。

魚類MDA5的泛素化修飾調(diào)控石斑魚(Epinephelus coioides)的幾個(gè)TRIM家族基因已被成功鑒定, 如TRIM13和TRIM62基因的同源物[43,44]。過量表達(dá)TRIM13或TRIM62能抑制MDA5介導(dǎo)的IFN信號(hào), 也能促進(jìn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒(RGNNV)在培養(yǎng)細(xì)胞中的復(fù)制。由于TRIM家族蛋白的N端具有RING(Really interesting new gene)結(jié)構(gòu)域, 該結(jié)構(gòu)域一般賦予TRIM蛋白有E3泛素連接酶活性, 因此推測(cè)TRIM13和TRIM62的負(fù)調(diào)控作用可能與其E3泛素連接酶活性有關(guān)。事實(shí)上, RING結(jié)構(gòu)域的缺失導(dǎo)致TRIM13負(fù)調(diào)控作用的喪失[43]。但是否因TRIM13和TRIM62的E3泛素連接酶活性直接導(dǎo)致魚類MDA5的泛素化修飾還沒有實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

3.3 MAVS

哺乳類MAVS的泛素化修飾調(diào)控2005年,四個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)鑒定MAVS基因?yàn)镽LR受體轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的重要接頭蛋白, 因此該基因有4個(gè)不同名稱,MAVS、Cardif、IPS-1和VISA[1]。MAVS是一個(gè)由540個(gè)氨基酸組成的蛋白, 包含N端的CARD結(jié)構(gòu)域,中間的脯氨酸富集結(jié)構(gòu)域(Proline-rich domain)和C端的跨膜結(jié)構(gòu)域(Transmembrane domain)。跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)AVS蛋白錨定于線粒體外膜, CARD結(jié)構(gòu)域與RIG-Ⅰ和MDA-5分子的CARD互作使它們被結(jié)合在一起, 隨后MAVS繼續(xù)招募TRAF(TNF receptor associated factor)和TBK1等下游信號(hào)蛋白,活化轉(zhuǎn)錄因子IRF3和NF-κB, 進(jìn)而誘導(dǎo)下游抗病毒基因的表達(dá)[45]。

與研究RIG-Ⅰ泛素化修飾調(diào)控的結(jié)果一致,MAVS被激活首先需要形成蛋白聚集體[45]。RIG-Ⅰ蛋白在N端CARD結(jié)構(gòu)域經(jīng)K63位泛素化鏈修飾后, 聚集形成帶有四個(gè)串聯(lián)CARDs的RIG-Ⅰ四聚體, 該四聚體進(jìn)而做為平臺(tái)起始MAVS聚集體的成核化[46]。多種泛素連接酶參與MAVS的泛素化修飾調(diào)控。如TRIM31催化MAVS蛋白K63連接的泛素化、促進(jìn)MAVS寡聚化激活以及下游蛋白激酶TBK1的招募[47]。 HECT(Homologous to the E6AP carboxyl terminus)E3泛素連接酶家族的AIP4(ADPribosylation factor-like 6 interacting protein 4, 也稱為ITCH, itchy E3 ubiquitin protein ligase)則催化MAVS的K48泛素化修飾, 導(dǎo)致MAVS通過蛋白酶體途徑降解[48]。同屬于HECT家族成員的Smurf1[49](SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1, Nedd4 家族四成員之一)和Smurf2[50]、以及MARCH5[membrane-associated ring finger (C3HC4) 5][51]也能介導(dǎo)MAVS的K48位泛素化鏈修飾影響MAVS蛋白的穩(wěn)定性。Sev病毒感染促進(jìn)RNF5(Ring finger protein 5)介導(dǎo)MAVS在K362和K461位點(diǎn)發(fā)生K48連接的泛素化修飾, 因此敲降RNF5基因能在早期逆轉(zhuǎn)Sev引起的MAVS蛋白水平下調(diào)[52]。此外, 抗病毒蛋白Tetherin [又稱BST2(Bone marrow stromal cell antigen 2)/CD317]通過募集E3泛素連接酶MARCH8, 介導(dǎo)MAVS的K27泛素化鏈修飾, 引導(dǎo)MAVS自噬降解, 從而抑制宿主過度的IFN反應(yīng)[53]。TRIM21介導(dǎo)MAVS的K27位泛素化和活化[54],TRIM29介導(dǎo)MAVS的K11位泛素化修飾和降解[55]。

有意思的是, TRIM25既通過K63泛素化修飾活化RIG-Ⅰ[22], 又誘導(dǎo)MAVS的K48位泛素化修飾和降解[56]。后續(xù)對(duì)宿主蛋白Cyclophilin A(CypA, 親環(huán)素A, 一種肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶)的研究似乎可以解釋TRIM25對(duì)RIG-Ⅰ和MAVS作用機(jī)理的不同。在Sev感染的細(xì)胞中, CypA與RIG-Ⅰ互作, 增強(qiáng)RIG-Ⅰ與TRIM25之間的結(jié)合、促進(jìn)TRIM25介導(dǎo)的RIG-Ⅰ的K63泛素化、招募更多的RIG-Ⅰ與線粒體上的MAVS結(jié)合, 同時(shí)通過與TRIM25競(jìng)爭(zhēng)性地與MAVS結(jié)合, 抑制TRIM25介導(dǎo)的MAVS的K48泛素化, 從而正向調(diào)控Ⅰ型干擾素反應(yīng)[57]。

關(guān)于MAVS的去泛素化調(diào)控, 最新研究鑒定了一個(gè)與MAVS相互作用的OUT 家族成員OTUD4(OTU deubiquitinase 4)[58]。在病毒感染時(shí), OTUD4的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子IRF3/7的調(diào)控增強(qiáng), 與MAVS互作并消除MAVS的K48位多泛素鏈, 從而維持MAVS的穩(wěn)定性, 促進(jìn)宿主IFN抗病毒信號(hào)。反之,敲除OTUD4削弱VSV病毒觸發(fā)的IRF3和NF-κB的激活以及其下游靶基因的表達(dá), 導(dǎo)致VSV復(fù)制增強(qiáng)[58]。OUT家族另外一個(gè)成員YOD1, 也能消除MAVS蛋白的K63位泛素化修飾, 抑制MAVS的聚集活化以及向下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[59]。

魚類MAVS的翻譯后修飾調(diào)控中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所在魚類MAVS介導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)的泛素化修飾調(diào)控中作出了開創(chuàng)性的工作。pVHL (Protein von Hippel-Lindau) 作為VHL-延伸蛋白B/C E3連接酶復(fù)合物的組成部分, 以往的研究通常關(guān)注其在腫瘤抑制中的功能。利用斑馬魚模型敲除vhl基因發(fā)現(xiàn): 在病毒感染后, 與野生型斑馬魚胚胎中低水平表達(dá)的MAVS相比,vhl基因敲除的斑馬魚胚胎的MAVS表達(dá)水平很高, 與敲除基因胚胎的強(qiáng)抗病毒能力直接相關(guān)[60]。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn), pVHL靶向MAVS的K420殘基, 通過催化形成K48連接的聚泛素鏈, 引導(dǎo)MAVS通過蛋白酶體途徑降解, 從而抑制斑馬魚的IFN抗病毒免疫反應(yīng)[60]。研究人員在研究SVCV的免疫逃避中發(fā)現(xiàn), SVCV病毒的N蛋白能促進(jìn)MAVS的K48位泛素化修飾,導(dǎo)致MAVS降解、抑制斑馬魚IFNφ1的產(chǎn)生, 從而達(dá)到免疫逃避的目的[61]。但是其中MAVS如何發(fā)生K48泛素化修飾的機(jī)制不清楚。

3.4 MITA/STING

哺乳類MITA蛋白的泛素化修飾調(diào)控MITA(Mediator of IRF3 activation; 也稱為STING, ERIS和MYPS)介導(dǎo)的IFN信號(hào)通路通常被認(rèn)為由DNA病毒感染所觸發(fā), 而MAVS信號(hào)則由RNA病毒感染誘導(dǎo)。特異識(shí)別病毒DNA的模式識(shí)別受體(如cGAS等)激活的MITA信號(hào)同樣能激活蛋白激酶TBK1,進(jìn)而激活I(lǐng)RF3介導(dǎo)IFN抗病毒免疫反應(yīng)[1]。但是Ishikawa等[62]用RNA病毒VSV和SeV感染MITA基因敲除的MEFs細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn), MITA缺陷也導(dǎo)致該兩株RNA病毒觸發(fā)的IFN抗病毒信號(hào)的減弱。因此,MITA可能在特定的細(xì)胞中, 對(duì)某些RNA病毒介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的信號(hào)通路也發(fā)揮作用[63]。

作為重要的接頭蛋白, MITA的功能同樣受到泛素化修飾的調(diào)控。Sev病毒感染促進(jìn)E3 泛素連接酶 RNF5與MITA的互作, 并靶向MITA在K150位點(diǎn)發(fā)生K48泛素化鏈修飾, 引導(dǎo)MITA通過蛋白酶體途徑降解、進(jìn)而負(fù)調(diào)控宿主的抗病毒免疫反應(yīng)[64]。TRIM家族成員TRIM29和TRIM30α與RNF5功能類似[65,66]。而同為TRIM家族的TRIM32則催化MITA在K20/150/224/236位點(diǎn)處的K63泛素化修飾,激活MITA信號(hào)通路[67]。TRIM56靶向MITA的K63連接泛素化修飾誘導(dǎo)MITA的二聚化, 進(jìn)而激活下游TBK1-IFN信號(hào)[68]。此外, 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白AMFR/INSIG1(Autocrine motility factor receptor/ insulin induced gene 1)復(fù)合體(一種E3 泛素連接酶復(fù)合體)能催化MITA發(fā)生K27位多聚泛素化, 促進(jìn)TBK1的招募和活化[69]。值得一提的是, RNF26在K150上促進(jìn)MITA的K11泛素化修飾, 而RNF5同樣靶向MITA的K150位點(diǎn)促進(jìn)K48連接的泛素化鏈修飾, 表明RNF26和RNF5的博弈可能協(xié)同調(diào)控了MITA介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素表達(dá)[70]。

在MITA的去泛素化研究中, 發(fā)現(xiàn)USP18通過招募 USP20特異性消除MITA上綴合的K48多聚泛素鏈, 阻斷MITA蛋白的降解途徑, 從而促進(jìn)天然抗病毒免疫反應(yīng)[71]。另一個(gè)去泛素化酶USP13, 主要消除MITA蛋白上的K27連接的泛素化鏈修飾, 而不是K63或K2連接的多聚泛素化鏈[72]。因此, USP13實(shí)際上削弱了MITA對(duì)蛋白激酶TBK1招募。在HSV-1感染的細(xì)胞中, 去泛素化酶CYLD選擇性地消除M I T A蛋白的K 4 8位泛素化鏈修飾穩(wěn)定MITA蛋白[73], 而USP21 和USP49水解MITA蛋白的K63泛素化鏈[74,75], 抑制MITA蛋白的激活。

魚類MITA蛋白的泛素化修飾調(diào)控有關(guān)魚類MITA和MAVS的功能研究初步顯示, 這兩個(gè)接頭蛋白在病毒感染的魚類細(xì)胞中都能發(fā)揮促進(jìn)IFN抗病毒免疫反應(yīng)的功能。由于沒有直接基因敲除實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證, 現(xiàn)在還難以區(qū)分魚類MITA和MAVS是否同哺乳類的同源基因一樣, 分別在RNA病毒和DNA病毒感染誘發(fā)的信號(hào)通路中發(fā)揮作用[76,77]。最近有報(bào)道, IHNV病毒的N蛋白靶向MITA導(dǎo)致MITA的泛素化降解, 盡管其中機(jī)制不清楚, 但是也表明魚類MITA在抑制病毒感染中的重要作用[78]。另外, 在石斑魚中鑒定了finTRIM家族基因如TRIM82能抑制MITA介導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng), 但其中的分子機(jī)制不清楚[79]。同一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)石斑魚TRIM35能抑制MAVS、MITA和TBK1介導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng), 但是對(duì)MDA5的抗病毒免疫反應(yīng)沒有調(diào)控作用[80]。雖然TRIM家族蛋白的RING結(jié)構(gòu)域可能賦予它們具有E3泛素連接酶活性, 但是石斑魚TRIM82和TRIM35是否具有E3酶活性, E3酶活性是否與其負(fù)調(diào)控有關(guān)還有待更深入研究。

3.5 TBK1

哺乳類TBK1的泛素化修飾調(diào)控TBK1(TANK binding kinase-1)最初被鑒定為與TANK(TRAF family member-associated NF-κB activator)相互作用的蛋白激酶。在RLR信號(hào)通路中, 活化的MAVS形成prion-like聚集物, 然后通過TRAF3招募TBK1和IKKi(IκB-Kinase-i, 又稱為IKKε), 磷酸化激活轉(zhuǎn)錄因子IRF3和IRF7, 激活后的IRF3/7從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)合在IFN基因啟動(dòng)子上, 啟動(dòng)IFN基因的轉(zhuǎn)錄[1,45]。

研究表明, E3泛素連接酶RNF128和Nrdp1(Neuregulin receptor degradation protein-1, 又稱RNF 41)都通過催化TBK1的K63泛素化來促進(jìn)IFN抗病毒免疫[81,82]。NLRP4(NLR family pyrin domain containing 4)則負(fù)調(diào)控Ⅰ型IFN反應(yīng), 機(jī)制是招募E3連接酶DTX4(Deltex E3 ubiquitin ligase 4)對(duì)底物TBK1通過K48泛素化靶向的蛋白酶體降解; 敲除DTX4基因降低TBK1蛋白K48泛素化修飾介導(dǎo)的降解, 增強(qiáng)TBK1和IRF3 的磷酸化激活[83]。同樣,TRIP(TRAF-interacting protein)也通過介導(dǎo)TBK1的K48泛素化, 促進(jìn)TBK1降解、從而負(fù)調(diào)控IFNβ的產(chǎn)生[84]。另外, 凝集素家族成員Siglec1(Sialic acid binding Ig-like lectin 1)抑制抗病毒免疫反應(yīng)的機(jī)制是: 首先與DAP12(DNAX-activating protein of 12 kD;又稱TYROBP, transmembrane immune signaling adaptor)互作以募集并激活SHP2(又稱PTPN11, protein tyrosine phosphatase non-receptor type 11), 激活的SHP2再招募E3泛素連接酶 TRIM27, TRIM27靶向TBK1蛋白在K251和K372處發(fā)生K48泛素化作用促進(jìn)TBK1 降解[85]。SOCS3(Suppressor of cytokine signaling 3)是一種IFN反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子, 該蛋白與elongins B/C、cullin5和RBX-1一起構(gòu)成E3泛素連接酶復(fù)合物。該復(fù)合物在與TBK1相互作用的過程中, SOCS3與TBK1結(jié)合并介導(dǎo)TBK1在K341和K344上的K48泛素化, 從而促進(jìn)TBK1降解并抑制VSV和甲型流感病毒對(duì)IRF3的激活[86]。

TBK1去泛素化修飾研究發(fā)現(xiàn), RNF11通過抑制TBK1的K63多聚泛素化修飾阻止抗病毒信號(hào)傳導(dǎo)。TAX1BP[Tax1 (Human T cell leukemia virus type Ⅰ) binding protein 1]和鋅指蛋白A20(Protein A20; 又稱TNFAIP3, TNF alpha induced protein 3等)通過破壞TBK1和IKKε的K63連鎖多聚泛素化作用終止抗病毒信號(hào)傳導(dǎo)[87]。USP38特異性地消除TBK1在K670位氨基酸的K33泛素化修飾, 導(dǎo)致隨后DTX4和TRIP在相同氨基酸位點(diǎn)的K48位泛素化修飾降解TBK1蛋白, 負(fù)調(diào)控IFN反應(yīng)[88]。

魚類TBK1的翻譯后修飾調(diào)控TBK1作為磷酸化轉(zhuǎn)錄因子激活I(lǐng)RF3/7的蛋白激酶, 常作為病毒抵御宿主免疫的靶標(biāo)。SVCV編碼的P蛋白能阻止TBK1對(duì)IRF3的磷酸化激活從而達(dá)到免疫逃避的目的[89]。還有研究發(fā)現(xiàn)GCRV感染體外培養(yǎng)細(xì)胞,導(dǎo)致細(xì)胞TBK1蛋白的K63泛素化修飾減弱, K48泛素化修飾增強(qiáng)[90], 但是其中的分子機(jī)制還有待揭示。我們實(shí)驗(yàn)室在研究魚類IFN反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制時(shí), 從鯽中鑒定了一個(gè)物種特異的基因, 該基因的編碼蛋白屬于E3泛素連接酶家族TRIM家族, 并且與僅在魚類中存在的一類TRIM亞家族finTRIM(fish novel TRIM)成員具有最高同源性, 因此命名為FTRCA1(finTRIMCarassius auratus1)[15]。該基因在近源物種中如銀鯽的基因組中都找不到直向同源基因(Ortholog), 但是表達(dá)調(diào)控分析表明,FTRCA1是一個(gè)典型的ISG, 表明其在鯽抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮某種功能。實(shí)驗(yàn)證實(shí)FTRCA1具有E3泛素連接酶活性, 功能研究發(fā)現(xiàn)FTRCA1通過溶酶體自噬途徑降解TBK1, 從而負(fù)調(diào)控病毒誘導(dǎo)宿主的IFN反應(yīng)。過量表達(dá)FTRCA1沒有增強(qiáng)TBK1的泛素化修飾程度, 但是缺失RING結(jié)構(gòu)域影響FTRCA1負(fù)調(diào)控功能的發(fā)揮, 表明FTRCA1的E3活性在其負(fù)調(diào)控TBK1介導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)中至關(guān)重要。雖然其中的機(jī)制還有待揭示, 但是, 由于FTRCA1是一個(gè)物種特異的finTRIM成員, 在其他魚類中找不到一一對(duì)應(yīng)的同源基因, 因此研究結(jié)果揭示了具有物種特異的魚類干擾素反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制[15]。類似于哺乳類, 大黃魚有E3泛素連接酶基因Nrdp1。盡管有證據(jù)顯示Nrdp1能與大黃魚TBK1發(fā)生互作, 但是缺乏后續(xù)的生理功能研究[91]。

3.6 IRF3/7

哺乳類IRF3/7的泛素化修飾調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子IRF3/7的磷酸化激活與機(jī)體天然抗病毒反應(yīng)息息相關(guān), 因此IRF3/7的磷酸化與泛素化修飾調(diào)控直接耦聯(lián)。與IRF3直接作用的相關(guān)E3泛素連接酶蛋白, 如TRIM26在病毒感染的細(xì)胞中移位到核, 與核中的磷酸化IRF3蛋白結(jié)合并促進(jìn)后者K48泛素化和降解[92]。HECT家族成員的RAUL具有K48位泛素化修飾IRF3/7、介導(dǎo)蛋白隨后降解的功能[93]。RLR信號(hào)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是另外一種抗病毒途徑,其機(jī)制是轉(zhuǎn)錄因子IRF3被目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)介導(dǎo)線性泛素鏈合成的E3泛素連接酶LUBAC介導(dǎo)發(fā)生線性化修飾, 被線性泛素鏈修飾的IRF3不參與誘導(dǎo)ISG的表達(dá), 而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)[94]。另外, 作用于MITA的蛋白R(shí)NF26雖然不能與IRF3直接互作, 也未能證實(shí)對(duì)IRF3有多聚泛素化修飾, 但實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示RNF26能介導(dǎo)IRF3通過自噬溶酶體途徑降解[70]。與IRF7直接作用的E3泛素連接酶蛋白, 目前有TRIM家族的TRIM8和TRIM28。TRIM8可以保護(hù)磷酸化激活的IRF7蛋白、避免通過蛋白酶體途徑降解, 從而促進(jìn)IRF7的功能[95]。而TRIM28則介導(dǎo)IRF7蛋白的SUMOylation(SUMO是一種與泛素非常同源的小分子, 也類似泛素分子一樣對(duì)底物蛋白進(jìn)行多聚化鏈修飾, 稱為SUMOylation, 是一種類泛素化修飾方式), 抑制IRF7蛋白的轉(zhuǎn)錄激活功能[96]。關(guān)于IRF3/7的去泛素化修飾,最近一份報(bào)道顯示: 在HSV-1和VSV感染的細(xì)胞中, OTUD1通過消除IRF3的K63位泛素化修飾,抑制IRF3與下游基因啟動(dòng)子的結(jié)合, 負(fù)調(diào)控IFN反應(yīng)[97]。

魚類IRF3/7的泛素化修飾調(diào)控中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所在研究草魚呼腸孤病毒GCRV與魚類細(xì)胞互作機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn), GCRV病毒編碼蛋白VP56可能通過K48泛素化修飾介導(dǎo)TBK1激活的IRF7蛋白的降解從而負(fù)調(diào)控IFN反應(yīng)[98]。該研究團(tuán)隊(duì)在斑馬魚中也鑒定到兩個(gè)負(fù)調(diào)控因子RPZ5 (Rapunzel 5)和NDRG1a (N-myc downstream-regulated gene 1a), 分別通過相似的機(jī)制, 促進(jìn)磷酸化IRF7蛋白的K48泛素化修飾、然后經(jīng)蛋白酶體途徑降解、最后負(fù)調(diào)控IFN反應(yīng)[99,100]。這些研究揭示了GCRV感染魚類細(xì)胞存在免疫逃避機(jī)制, 也表明魚類細(xì)胞的IFN抗病毒免疫反應(yīng)存在自身調(diào)控。此外, 魚類也存在TRIM8基因, 同哺乳類同源基因一樣, 過量表達(dá)大黃魚TRIM8在體外能促進(jìn)IRF3/7基因的表達(dá)水平, 同時(shí)促進(jìn)ISRE啟動(dòng)子的活性[101]。需要指出的是, 在以上報(bào)道中, 無論是否存在魚類IRF3/7的泛素化修飾, 其中的調(diào)控機(jī)制還有待更深入的研究。

4 問題與展望

迄今為止, 大量的E3泛素連接酶和DUB被認(rèn)為是重要的免疫調(diào)節(jié)劑, 通過介導(dǎo)RLR信號(hào)分子的泛素化修飾和去泛素化修飾來調(diào)控宿主的IFN抗病毒反應(yīng)。綜合分析近年來的相關(guān)研究可以發(fā)現(xiàn), 針對(duì)K48位泛素化修飾和K63位泛素化修飾介導(dǎo)的蛋白降解和蛋白激活的研究較多, 其中的分子機(jī)制也較為清楚。但相比泛素化修飾密碼的復(fù)雜性, 目前的機(jī)制研究?jī)H揭示出冰山一角, 還有更多的泛素化修飾類型及它們介導(dǎo)的生理功能亟待發(fā)現(xiàn)。此外, 去泛素化相關(guān)的DUB的研究報(bào)道相對(duì)較少。

隨著魚類基因組數(shù)據(jù)及各種組學(xué)數(shù)據(jù)的增加,魚類基因的鑒定已經(jīng)不再是制約功能研究的障礙。事實(shí)上, 近十年來魚類干擾素抗病毒免疫分子的功能研究取得長(zhǎng)足進(jìn)展, 國(guó)內(nèi)的研究水平已經(jīng)處于世界前沿。不僅引領(lǐng)泛素化修飾的功能研究進(jìn)展, 而且也涉足類泛素化修飾在抗病毒免疫反應(yīng)中的調(diào)控研究, 如Neddylation[102]。但是相比哺乳類的研究深度和廣度, 魚類相關(guān)研究還剛剛起步, 還需要對(duì)揭示的功能表象開展更細(xì)致的機(jī)制研究。比如, 需要對(duì)參與泛素化修飾的相關(guān)酶進(jìn)行直接鑒定,還需要對(duì)泛素化類型和靶向氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行鑒定等。魚類種類多, 導(dǎo)致研究對(duì)象分散, 不得不對(duì)同一基因在不同研究對(duì)象中重復(fù)開展工作, 間接滯后了研究的深度。其次, 雖然在研究報(bào)道中已經(jīng)有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)出現(xiàn)[60,102], 但是目前相關(guān)的研究還多利用體外培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行, 缺乏基因敲除實(shí)驗(yàn)的證據(jù),這些缺陷可能導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)室取得不一致的結(jié)果,如關(guān)于魚類LGP2的功能研究就是一個(gè)典型例子。再次, 哺乳類相關(guān)的研究也是一個(gè)逐漸認(rèn)識(shí)的過程,如關(guān)于RIG-Ⅰ蛋白K63泛素化修飾激活的認(rèn)識(shí)一直處于修正之中[20—23]。這提示魚類方面的研究不僅是對(duì)哺乳類研究的一個(gè)補(bǔ)充和證實(shí), 而且對(duì)于保守的E3酶基因和去泛素化酶基因的功能研究, 也可能揭示出不同于哺乳類的、而特異于魚類的功能和作用機(jī)制。另外, 比較基因組學(xué)已經(jīng)揭示出魚類具有自身特有的一些基因, 如魚類TRIM家族就有一個(gè)亞家族稱為finTRIM, 該亞家族成員全部屬于魚類特有[103—105]。但是不同魚類的finTRIM亞家族的成員也不盡相同, 表明很多基因可能是魚類物種特異的基因。對(duì)這些基因的研究無疑將揭示出魚類物種特異的抗病毒免疫反應(yīng)調(diào)控機(jī)制[15]。最后,雖然許多魚類基因與哺乳類非常同源, 但是由于硬骨魚類存在普遍的基因組加倍事件, 因此導(dǎo)致基因拷貝數(shù)與哺乳類相比有差異, 或者基因編碼蛋白不完全類同。如在目前版本的斑馬魚基因組中注釋的Riplet/RNF135蛋白與人Riplet/RNF135蛋白相比可能缺少了N端RING結(jié)構(gòu)域。還比如TRIM家族成員之間序列同源性高, 而魚類TRIM家族因?yàn)閿U(kuò)增導(dǎo)致基因拷貝數(shù)劇增, 因此出現(xiàn)命名困難以致混淆錯(cuò)誤發(fā)生[15]。鑒于魚類基因的命名多根據(jù)哺乳類同源基因來命名, 因此, 對(duì)魚類基因的正確鑒定與正確命名以避免與哺乳類基因的功能認(rèn)知出現(xiàn)混淆非常重要。