陳 靜，劉元法，李進(jìn)偉

(1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122； 2.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種常見的與代謝相關(guān)的慢性肝病[1]，被認(rèn)為是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)[2-3]。NAFLD是指在沒有過量飲酒的情況下，肝臟組織中的脂肪含量大于肝臟質(zhì)量5%或肝細(xì)胞中甘油三酯浸潤大于肝細(xì)胞體積5%的病理狀況[4]。

人們普遍認(rèn)為脂肪組織與肝臟的肥胖及胰島素抵抗(IR)導(dǎo)致肝臟內(nèi)游離脂肪酸(FFA)通量增加，過量的脂肪酸氧化誘導(dǎo)活性氧(ROS)水平升高，ROS通過靶向生物膜上膜磷脂和脂蛋白中多不飽和脂肪酸(PUFA)的雙鍵引發(fā)脂質(zhì)過氧化，從而造成細(xì)胞損傷[5]。同時，很多證據(jù)表明氧化應(yīng)激(OS)是NAFLD發(fā)展過程中最重要的病理事件，是單純脂肪變性向非酒精性脂肪性肝炎(NASH)發(fā)展的標(biāo)志[6]。因此，減少肝臟氧化應(yīng)激對于預(yù)防和治療NAFLD至關(guān)重要。

油酰乙醇酰胺(OEA)是過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)的高親和力配體，在治療肥胖和其他肥胖相關(guān)的代謝并發(fā)癥方面表現(xiàn)出很多的藥理學(xué)特性[7]。美國FDA已經(jīng)批準(zhǔn)OEA用作膳食補(bǔ)充劑。研究發(fā)現(xiàn)，OEA能夠通過改善氧化應(yīng)激，對原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)損傷模型[8]和脂多糖誘導(dǎo)的大鼠額葉皮層[9]起到保護(hù)作用。OEA還可以降低小鼠肝臟中硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)和總谷胱甘肽水平，從而改善氧化應(yīng)激[10]。此外，OEA處理能夠顯著降低高脂血癥模型大鼠肝臟中的丙二醛(MDA)含量，并同時提高肝臟谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性[11]。研究表明OEA可能是改善氧化應(yīng)激的有效成分，但其作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究致力于探究OEA對人肝細(xì)胞系LO2細(xì)胞內(nèi)脂肪酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的作用及潛在機(jī)制，為OEA改善肝臟氧化應(yīng)激以治療NAFLD提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

LO2細(xì)胞，中科院上海細(xì)胞庫。油酸鈉、棕櫚酸鈉和油酰乙醇酰胺，美國Sigma公司；無脂肪酸牛血清白蛋白(FFA-free BSA)，美國Equitech-Bio公司；RPMI 1640培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；澳洲胎牛血清，烏拉圭Lonsera公司；100 X青霉素-鏈霉素溶液和0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，美國Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)、CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、活性氧檢測試劑盒、總SOD活性檢測試劑盒、過氧化氫酶檢測試劑盒、脂質(zhì)氧化(MDA)檢測試劑盒和總谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；UNlQ-10柱式總RNA抽提試劑盒、AMV第一鏈cDNA合成試劑盒和2×SG Fast qPCR Master Mix試劑盒，上海生工生物工程股份有限公司；Nrf2、HO-1和β-actin抗體，沈陽萬類生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，超凈工作臺，低速離心機(jī)，高速冷凍離心機(jī)，倒置熒光顯微鏡，SpectraMax190酶標(biāo)儀，流式細(xì)胞儀，Quickdrop超微量分光光度計，RT-PCR儀，BIO-RAD電泳儀，C-DiGit數(shù)碼化學(xué)發(fā)光成像儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

1.2.1.1 0.2 g/mL BSA-PBS溶液

稱取6 g BSA于50 mL離心管中，添加30 mL預(yù)先加熱的PBS溶液，配制成0.2 g/mL的母液，于離心機(jī)中4 000 r/min離心10 min，得到棕黃色澄清溶液。

1.2.1.2 脂肪酸混合溶液

本實驗采用油酸和棕櫚酸(摩爾比為2∶1)混合物誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激。稱取0.243 6 g油酸鈉和0.111 4 g棕櫚酸鈉于50 mL離心管中，添加30 mL超純水，配制成濃度為40 mmol/L的母液，置于75℃水浴中充分溶解至溶液澄清透明。實驗前與0.2 g/mL BSA-PBS溶液按比例混合，使培養(yǎng)液中脂肪酸混合溶液終濃度為0.4 mmol/L，BSA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%。

1.2.1.3 OEA溶液

稱取1 g OEA，添加30.719 mL DMSO，配制成終濃度為100 mmol/L的母液。實驗前按比例添加，使培養(yǎng)液中DMSO 體積分?jǐn)?shù)為0.1%。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

將LO2細(xì)胞與含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的RPMI培養(yǎng)基在濕潤的5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)。與脂肪酸混合溶液孵育24 h誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激，同時加入不同濃度的OEA溶液。

1.2.3 細(xì)胞活力測定

采用CCK-8法測定細(xì)胞活力。將LO2細(xì)胞以1.0×104個/孔的密度種植在96孔板中貼壁培養(yǎng)24 h。加入0.4 mmol/L脂肪酸混合溶液和不同濃度的OEA溶液共同培養(yǎng)22 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液繼續(xù)孵育2 h。采用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光值。

1.2.4 ROS水平測定

在實驗中，使用活性氧檢測試劑盒檢測LO2細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。按照試劑盒說明，將細(xì)胞種植于6孔板中，培養(yǎng)結(jié)束后，倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液，4℃的PBS洗滌1次。加入1 mL稀釋好的2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA，按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋，使DCFH-DA終濃度為10 μmol/L)，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育20 min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，最后使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。

1.2.5 MDA含量及抗氧化酶活性測定

將細(xì)胞種植于6 cm2培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)結(jié)束后，倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液，4℃的PBS洗滌1次。加入200 μL Western及IP細(xì)胞裂解液，適當(dāng)吹打以充分裂解細(xì)胞。4℃條件下12 000g離心5 min，取上清液作為待測樣品。根據(jù)試劑盒說明，使用脂質(zhì)氧化(MDA)檢測試劑盒測定樣品MDA水平，總SOD活性檢測試劑盒測定樣品SOD活性，過氧化氫酶檢測試劑盒測定樣品過氧化氫酶(CAT)活性，總谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒檢測樣品谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性，樣品蛋白濃度通過BCA蛋白濃度測定試劑盒測定。

1.2.6 RT-qPCR分析

使用UNlQ-10柱式總RNA抽提試劑盒提取LO2細(xì)胞總RNA，通過Quickdrop超微量分光光度計檢測總RNA濃度和純度，使用AMV第一鏈cDNA合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-20℃。最后使用2×SG Fast qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。實驗用引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成(如表1所示)，以β-actin為參照基因，結(jié)果用2-ΔΔCt表示。

表1 引物序列

1.2.7 免疫印跡分析

收集細(xì)胞并用Western及IP細(xì)胞裂解液裂解，4℃條件下12 000g離心10 min，然后用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定上清液中蛋白質(zhì)含量。SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離等量(30 μg)蛋白樣品，再將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜與Nrf2、HO-1以及β-actin抗體4℃孵育過夜，再與二抗室溫孵育1 h。最后通過特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測蛋白條帶，并通過Image J軟件對光密度進(jìn)行定量分析。

1.2.8 統(tǒng)計分析

所有實驗至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。使用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用Origin 9.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 OEA對細(xì)胞活性的影響

本實驗通過添加油酸和棕櫚酸混合物(摩爾比為2∶1)誘導(dǎo)LO2細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激。首先采用CCK-8法檢測0.4 mmol/L脂肪酸和不同濃度的OEA對細(xì)胞活性的影響，結(jié)果見表2。表2中空白組為僅添加0.1% DMSO和0.4% BSA的LO2細(xì)胞，對照組為添加0.1% DMSO和0.4 mmol/L脂肪酸混合溶液的LO2細(xì)胞(下同)，實驗組為添加0.4 mmol/L脂肪酸混合溶液和不同濃度OEA的LO2細(xì)胞。由表2可知，0.1～10 μmol/L的OEA處理24 h后對細(xì)胞活性無明顯影響，25 μmol/L和50 μmol/L的OEA則使細(xì)胞活性分別降至空白組的93.42%和82.27%。通常認(rèn)為活性高于90%對細(xì)胞不具有明顯的毒性影響[12]，因此選擇0.1～25 μmol/L的OEA進(jìn)行后續(xù)實驗。

表2 不同濃度OEA對LO2細(xì)胞活性的影響

2.2 OEA對細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA含量的影響

研究表明，過量的氧化應(yīng)激可能導(dǎo)致線粒體呼吸異常和功能障礙，最終導(dǎo)致NAFLD發(fā)展[12]。因此，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和相應(yīng)的抗氧化酶對治療NAFLD是非常重要的。按照1.2.4方法測定不同組別細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度表示細(xì)胞內(nèi)ROS水平，得到不同濃度OEA對LO2細(xì)胞ROS含量的影響，結(jié)果見表3。不同濃度OEA對細(xì)胞MDA含量的影響見表4。

表3 不同濃度OEA對LO2細(xì)胞ROS含量的影響

表4 不同濃度OEA對細(xì)胞MDA含量的影響

由表3可知，0.4 mmol/L脂肪酸顯著增加了細(xì)胞內(nèi)ROS含量，OEA處理以濃度依賴性方式降低了由脂肪酸引起的ROS生成。

由表4可知，0.4 mmol/L脂肪酸顯著增加了細(xì)胞內(nèi)MDA含量，而OEA處理表現(xiàn)出顯著的抑制作用。

2.3 OEA對細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性的影響(見表5)

由表5可知，相比于空白組，0.4 mmol/L脂肪酸處理顯著降低了細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT和GPx的活性，而OEA處理后，細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性均以濃度依賴性方式增加。這些數(shù)據(jù)表明OEA能夠顯著抑制脂肪酸導(dǎo)致的抗氧化酶活性下降，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力。

表5 不同濃度OEA對細(xì)胞3種抗氧化酶活性的影響 U/mg

2.4 OEA對氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白和基因的影響

為了研究OEA改善氧化應(yīng)激的作用機(jī)制，利用蛋白免疫印跡和RT-qPCR檢測了氧化應(yīng)激關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子(Nrf2和HO-1)的水平，結(jié)果分別見圖1、圖2。由圖1可知，與僅0.4 mmol/L脂肪酸處理的LO2細(xì)胞相比，OEA處理的細(xì)胞Nrf2和HO-1蛋白水平隨OEA濃度增大而顯著上升。由圖2可知，在OEA處理的細(xì)胞中，Nrf2和HO-1 mRNA的表達(dá)也在增加。這些結(jié)果表明，對于脂肪酸誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞氧化應(yīng)激，OEA處理可通過激活抗氧化關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子Nrf2和HO-1來增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力。

注：與空白組相比，#p<0.05，##p<0.01；與對照組相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。下同。

圖2 不同濃度OEA對抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.5 討論

NAFLD是一種以肝脂肪變性為特征的慢性肝病，盡管其發(fā)病機(jī)制尚未完全了解，但氧化應(yīng)激在NAFLD從單純性脂肪變性到NASH的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用[13]。過量的ROS會誘發(fā)線粒體功能障礙，從而加重脂肪變性和肝損害，甚至導(dǎo)致肝臟發(fā)炎。因此，抑制肝臟氧化應(yīng)激可用于預(yù)防和治療NAFLD。本研究探究了OEA對脂肪酸誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。首先通過CCK-8法選擇OEA作用濃度，結(jié)果表明在0.4 mmol/L脂肪酸誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞中，0.1～25 μmol/L的OEA不會對細(xì)胞產(chǎn)生明顯毒性作用。

很多證據(jù)表明ROS在氧化應(yīng)激中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物之一，被用作細(xì)胞和組織氧化損傷的指標(biāo)。實驗結(jié)果表明，0.4 mmol/L脂肪酸誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS水平上升，并進(jìn)一步促進(jìn)MDA產(chǎn)生，OEA處理以濃度依賴性方式逆轉(zhuǎn)了脂肪酸引起的上述效應(yīng)，這與先前在體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中的研究結(jié)果相似[8]。Nrf2是關(guān)鍵的抗氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子，激活狀態(tài)下Nrf2移位進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)各種抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄以消除ROS，發(fā)揮抗氧化作用[15-16]。本研究結(jié)果顯示，脂肪酸誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞內(nèi)Nrf2和HO-1蛋白及mRNA水平較空白組顯著降低，OEA通過上調(diào)這兩種基因和蛋白的表達(dá)，提高細(xì)胞內(nèi)3種重要抗氧化酶(SOD、CAT和GPx)的活性，從而抵抗脂肪酸誘導(dǎo)的應(yīng)激狀態(tài)。

總之，OEA可激活與氧化應(yīng)激相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而提高抗氧化酶及降低細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA水平，從而顯著抑制細(xì)胞內(nèi)因脂肪酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。本研究可以為與氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的治療提供一定的科學(xué)依據(jù)。

3 結(jié) 論

0.4 mmol/L的脂肪酸混合物(油酸和棕櫚酸摩爾比2∶1)和0.1～25 μmmol/L OEA均對LO2細(xì)胞無明顯毒性作用，而當(dāng)OEA濃度增大到50 μmmol/L時，細(xì)胞活性低于90%，因此選擇0.1～25 μmmol/L作為后續(xù)處理的OEA濃度。OEA能夠抑制脂肪酸誘導(dǎo)的活性氧生成增加，并且能降低細(xì)胞內(nèi)MDA含量。此外，OEA還能夠通過增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化酶活性來提高細(xì)胞抵御脂肪酸的能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，OEA通過激活抗氧化關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子Nrf2和HO-1來增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力。