薛元強，劉思敏，韓立娟,2，齊玉堂,2，賀軍波,2，張維農(nóng),2

(1.武漢輕工大學 食品科學與工程學院，武漢 430023; 2.湖北省油脂精細化工工程技術(shù)研究中心，武漢 430023)

油脂中的不飽和脂肪酸在光、熱、酶等條件作用下易與氧氣發(fā)生自由基鏈式反應(yīng)，導致脂肪酸分解，生成一級氧化產(chǎn)物氫過氧化物，氫過氧化物極不穩(wěn)定，很容易再次裂解產(chǎn)生二級氧化產(chǎn)物如醛、烴、酮和環(huán)氧化物[1]。油脂氧化產(chǎn)物對于油脂或含油脂食品的氣味及安全性具有不利影響[2-3]，甚至還具有致癌作用[4]。因此，抑制油脂的氧化對于食用油或含油脂食品的安全性具有重要的意義。

研究表明，溫度、光照、酶、抗氧化劑和促氧化劑等因素能夠影響油脂的氧化[5]。然而最近的研究表明，油脂中微量成分同樣能夠顯著影響油脂的氧化[6-9]。甘二酯(DAG)是油脂中主要的微量成分，主要來源于甘三酯或磷脂在植物體內(nèi)的不完全合成以及油脂在加工、儲藏、運輸過程中發(fā)生的水解，含量通常在0.8%～5.8%[6,10]。DAG對油脂的促氧化作用[11]、抗氧化作用[12]均有報道，亦有研究表明DAG對油脂氧化穩(wěn)定性并無明顯影響[13]。造成DAG對油脂氧化穩(wěn)定性影響的不確定性可能與以下幾點因素有關(guān)：①在以往的研究中多以二油酸甘油酯為實驗原料，但是不飽和DAG中同時具有羥基和不飽和鍵，由于兩者的聯(lián)合作用導致了結(jié)果的不確定性；②DAG可能與抗氧化劑存在著聯(lián)合作用，由于不同油脂中的抗氧化劑種類和含量存在差異，導致結(jié)果不確定。

考慮到不飽和DAG可能帶來的影響，以及DAG影響油脂氧化穩(wěn)定性的原因是其在油脂中形成了反相膠束[7]，本文選擇sn-1,3-棕櫚酸甘二酯為原料，測定DAG在油脂體系中形成反相膠束的臨界濃度，并在反相膠束體系中研究其對菜籽油氧化穩(wěn)定性及對γ-生育酚、叔丁基對苯二酚(TBHQ)、丁基羥基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)4種抗氧化劑活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菜籽油，當?shù)爻?；sn-1,3-棕櫚酸甘二酯(純度99%)，實驗室自制；硅膠(300～400目)、活性炭(>200目)、7,7,8,8-四腈基-對苯醌二甲烷(TCNQ，純度95%)、叔丁基對苯二酚(TBHQ，純度98%)、2,6-二叔丁基對甲酚(BHT，純度99%)、丁基羥基茴香醚(BHA,純度98%)，阿拉丁試劑有限公司；正己烷、氯仿、冰乙酸、碘化鉀，均為分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司；γ-生育酚(純度97%)，百靈威試劑有限公司。

分析天平；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；循環(huán)水真空泵；DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器；TGL-16G臺式離心機；Lambda25型紫外/可見分光光度計，PerkinElmer有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菜籽油的純化

根據(jù)Boon等[14]的方法稍作改進。稱取88 g硅膠和12 g活性炭，在110℃鼓風干燥箱中干燥20 h。取尺寸為30 cm×4 cm的層析柱，通過干法裝柱的方式依次填充44 g硅膠、12 g活性炭以及剩余的44 g硅膠。取100 g菜籽油溶解在100 mL正己烷中，裝入層析柱，然后用400 mL正己烷洗脫，收集所有洗脫液，并通過旋蒸(38℃)去除洗脫液中的溶劑，最后通過氮吹去除殘留的痕量溶劑，即得純凈菜籽油，儲存在-20℃的冰箱中，待測。

1.2.2 菜籽油理化指標及微量成分測定

酸價的測定參照GB 5009.229—2016，過氧化值的測定參照GB 5009.227—2016，生育酚及甾醇含量的測定參照文獻[15]。

1.2.3 菜籽油脂肪酸組成的測定

取0.1 g左右樣品于甲酯化管，加入2 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液，渦旋混勻，在65℃水浴下反應(yīng)30 min后加入2 mL三氟化硼-甲醇，65℃水浴3 min，冷卻后加入2 mL正己烷，振蕩，靜置分層，取上層清液，供GC分析。

GC條件：Sopelco sp-2560石英毛細管色譜柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm)；載氣為高純氮氣，恒壓模式，壓力215.87 kPa；分流比20∶1，進樣口溫度250℃；檢測器溫度250℃；柱溫100℃保持4 min，以3℃/min升至230℃，保持20 min(總分析時間67.33 min)。

1.2.4 菜籽油單甘酯、DAG含量的測定

單甘酯及DAG含量參照AOCS Cd 11d-96方法進行測定。

1.2.5 DAG臨界膠束濃度的測定

DAG臨界膠束濃度根據(jù)Chen等[7]的方法測定。將0.1%、0.2%、0.5%、1%的DAG溶解在純凈菜籽油中，并在40℃下攪拌12 h。分別取上述樣品5 g于10 mL樣品瓶中，加入5 mg TCNQ，混合攪拌5 h，過量的TCNQ通過6 500 r/min離心20 min除去。通過分光光度法測定所有樣品在480 nm的吸光度，繪制DAG含量對數(shù)與吸光度的曲線。DAG臨界膠束濃度為低DAG含量的點組成的直線與高DAG含量的點組成的直線的交點。

1.2.6 加速氧化實驗

取純凈菜籽油20 g，分別加入1%DAG、1%DAG+0.02%γ-生育酚、0.02%γ-生育酚、1% DAG+0.02%TBHQ、0.02%TBHQ、1% DAG+0.02%BHT、0.02%BHT、1% DAG+0.02%BHA、0.02%BHA，并以無添加的純凈菜籽油作為對比樣。所有樣品在60℃鼓風干燥箱中加速氧化，并在1、2、3、4、5、6、7 d取樣測定過氧化值。所有樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 純化前后菜籽油的指標變化

菜籽油中除了甘油三酯成分，還含有少量的單甘酯、DAG、甾醇、生育酚、色素等物質(zhì)，為了避免這些少量成分對實驗的干擾，本文通過硅膠和活性炭吸附去除油脂中的上述物質(zhì)，得到純凈的菜籽油。對純化前后菜籽油的相關(guān)指標進行測定，結(jié)果見表1。

表1 菜籽油純化前后相關(guān)指標變化

由表1可知，經(jīng)過柱層析純化后的菜籽油與未經(jīng)純化的菜籽油脂肪酸組成無明顯變化，同時色素、生育酚、甾醇、單甘酯、DAG、游離脂肪酸及過氧化物除去得較為徹底，因此通過柱層析的方法得到的純凈菜籽油適合用于加速氧化研究。

2.2 DAG臨界膠束濃度

具有表面活性的物質(zhì)溶解在弱極性的體系(如甘油三酯)中，隨著表面活性劑濃度增大到一定的值時，體系的理化性質(zhì)(如表面張力、溶解度、滲透壓、導電度、可溶性、增容等)會發(fā)生跳躍性變化，此時的濃度稱為臨界膠束濃度，并且在等于或大于該濃度時，會形成反相膠束。TCNQ脂溶性差，且分散在非極性溶劑時在480 nm處沒有吸收。當表面活性劑濃度高于臨界膠束濃度時，TCNQ可與表面活性劑發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移相互作用，并可吸收480 nm波長的光，通過檢測不同DAG濃度下菜籽油在480 nm處吸光度的變化，即可測定DAG臨界膠束濃度。按照1.2.5方法測得DAG臨界膠束濃度為0.5%。

2.3 加速氧化實驗結(jié)果

純凈菜籽油及添加1%DAG后過氧化值隨儲藏時間的變化如圖1所示。由圖1可看出，添加1%DAG的菜籽油在6 d前過氧化值均大于純凈菜籽油，且其在2 d時進入指數(shù)氧化階段，純凈菜籽油在3 d時進入指數(shù)氧化階段，因此添加1%DAG促進了純凈菜籽油的氧化。研究表明，反相膠束形成的微環(huán)境能夠加快反應(yīng)的速度[16]，本研究中DAG加快菜籽油氧化速率可能是因為反相膠束的存在為氧化反應(yīng)提供了場所，同時加快了氧化反應(yīng)。

圖1 純凈菜籽油及添加1%DAG后過氧化值隨儲藏時間的變化

圖2為純凈菜籽油添加γ-生育酚及1% DAG與γ-生育酚后過氧化值隨儲藏時間的變化。由圖2可看出：0～1 d時，同時添加1%DAG與γ-生育酚比僅添加γ-生育酚的菜籽油過氧化值上升速率快；1 d之后，僅添加γ-生育酚的菜籽油過氧化值快速上升，而添加1%DAG與γ-生育酚的菜籽油過氧化值上升速率緩慢；在3 d時，僅添加γ-生育酚的菜籽油過氧化值為14.53 mmol/kg，而同時添加γ-生育酚和1%DAG的菜籽油過氧化值僅為6.47 mmol/kg，原因可能是DAG的添加增加了γ-生育酚的活性。Chen等[13]研究二油酸DAG對生育酚的抗氧化活性影響，結(jié)果表明，添加0.5%～2.5%的DAG并未影響大豆油中生育酚的活性，同時也未觀測到反相膠束的形成。但以DOPC為原料制備出反相膠束后，大豆油中生育酚的活性得到了增強[8]，與本實驗得到的結(jié)果一致。綜上所述，反相膠束的存在對于抗氧化劑的活性有著重要的影響，許多觀點認為，反相膠束能夠增加抗氧化劑的溶解度，并使得抗氧化劑向反相膠束形成的部位聚集，最終因為濃度的增加而增大其清除自由基的能力。結(jié)合圖1結(jié)果，推測在本實驗中，DAG對γ-生育酚的影響機理為：在0～1 d，生育酚還沒有完全遷移到反相膠束部位，DAG仍然是主要作用因素，此時氧化速率更快;在1 d后，γ-生育酚已經(jīng)充分遷移到反相膠束部位，能夠與氫過氧化物充分接觸，從而發(fā)揮其抗氧化作用。

圖2 純凈菜籽油添加γ-生育酚及1%DAG與γ-生育酚后過氧化值隨儲藏時間的變化

圖3為純凈菜籽油添加TBHQ及1%DAG與TBHQ后過氧化值隨儲藏時間的變化。由圖3可看出，在儲藏過程中，添加1%DAG及TBHQ的菜籽油過氧化值始終大于僅添加TBHQ的菜籽油。在儲藏過程中，僅添加TBHQ的菜籽油過氧化值無明顯上升，但是添加1%DAG與TBHQ的菜籽油在6 d后就已超出GB 2716—2018規(guī)定的限量(9.85 mmol/kg)，因此DAG的加入抑制了TBHQ的抗氧化活性。

圖3 純凈菜籽油添加TBHQ及1%DAG與TBHQ后過氧化值隨儲藏時間的變化

圖4為純凈菜籽油添加BHA及1%DAG與BHA后過氧化值隨儲藏時間的變化。由圖4可看出，與TBHQ的變化類似，添加1%DAG與BHA的菜籽油氧化穩(wěn)定性明顯弱于僅添加BHA的菜籽油，因此DAG抑制了BHA的抗氧化活性。通過比較DAG對TBHQ、BHA抗氧化活性的抑制率，發(fā)現(xiàn)1～7 d，DAG對TBHQ的平均抑制率(0.82)高于對BHA的平均抑制率(0.71)，說明與TBHQ相比，DAG對BHA的抑制強度更弱。

圖4 純凈菜籽油添加BHA及1%DAG與BHA后過氧化值隨儲藏時間的變化

圖5為純凈菜籽油添加BHT及1%DAG與BHT后過氧化值隨儲藏時間的變化。由圖5可看出：2 d前，添加1%DAG與BHT的菜籽油過氧化值上升速率高于僅添加BHT的菜籽油，2 d后，添加1%DAG與BHT的菜籽油比僅添加BHT過氧化值上升速率慢；在4 d時，僅添加BHT的菜籽油過氧化值為10.91 mmol/kg，已經(jīng)超過出GB 2716—2018規(guī)定的限量(9.85 mmol/kg)，而此時添加1%DAG與BHT的菜籽油過氧化值為8.33 mmol/kg。因此，DAG增強了BHT的抗氧化活性，這與DAG對γ-生育酚的變化趨勢類似。

圖5 純凈菜籽油添加BHT及1%DAG與BHT后過氧化值隨儲藏時間的變化

圖1～圖5結(jié)果表明，DAG對于不同抗氧化劑的影響趨勢存在差異，在本研究中，DAG能夠增加氧化速率，增強抗氧化劑γ-生育酚和BHT的活性，而對TBHQ和BHA的活性有抑制作用。TBHQ的抗氧化效果優(yōu)于BHT和BHA，但DAG對TBHQ的抑制作用更明顯，這可能與抗氧化劑在臨界膠束部位的分布有關(guān)。DAG達到臨界膠束濃度后可能會形成以水核為中心，四周包裹DAG的球形反相膠束，許多觀點認為，反相膠束可能是油脂氧化的場所，在該假設(shè)的基礎(chǔ)上，油脂氧化產(chǎn)物形成后，極性較弱的氫過氧化物會向反相膠束的外表面遷移，同時抗氧化劑會朝著DAG形成的部位遷移并聚集，由于不同極性的抗氧化劑在反相膠束的分布可能不一樣，極性較強的抗氧化劑更有可能進入水核而難以與氫過氧化物接觸，而極性較弱的抗氧化劑可能更容易聚集在反相膠束的表面和氫過氧化物接觸，從而充分發(fā)揮抗氧化活性。4種抗氧化劑的分子極性強弱關(guān)系為γ-生育酚

3 結(jié) 論

對sn-1,3-棕櫚酸甘二酯對純凈菜籽油氧化穩(wěn)定性的影響進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菜籽油中的sn-1,3-棕櫚酸甘油二酯臨界膠束濃度為0.5%，在反相膠束體系中DAG具有促氧化作用，且在該體系中DAG與γ-生育酚及其他抗氧化劑聯(lián)合作用，表現(xiàn)出了不同的效果：DAG增強了γ-生育酚及BHT的抗氧化活性，但是抑制了TBHQ和BHA的活性。本文初步闡明了DAG對油脂氧化穩(wěn)定性的影響情況，并且對于DAG多種不同的影響趨勢也有了一個合理的解釋：①DAG對于油脂氧化穩(wěn)定性的影響取決于其在油脂中的物理結(jié)構(gòu)，反相膠束可能是影響油脂氧化穩(wěn)定性的根本原因；②DAG形成反相膠束后，油脂的氧化穩(wěn)定性還取決于其加快氧化速率及增大抗氧化劑活性兩種反應(yīng)的平衡，同時也取決于抗氧化劑在反相膠束部位的分布。本研究對于油脂氧化研究以及尋找安全的抗氧化方法提供了新的思路。