張 丹，岳 磊

(鄭州市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州 450006)

炎可寧片由黃柏、大黃、黃芩、板藍(lán)根、黃連5味中藥組成，具有清熱瀉火、消炎止痢的功效，用于急性扁桃體炎、細(xì)菌性肺炎等[1]。目前，炎可寧片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較多，但鑒別專屬性較差，無(wú)含量測(cè)定；或僅有針對(duì)個(gè)別藥味的鑒別和含量測(cè)定，未包含所有藥味。炎可寧片中含有多個(gè)藥味，每個(gè)藥味又含有多種化學(xué)成分[2-6]，藥品質(zhì)量需要全面控制。采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法來(lái)控制中成藥質(zhì)量，可同時(shí)測(cè)定多種成分，可不要求被測(cè)成分完全分離，且具有更高的專屬性和靈敏度[7-9]。本研究采用UPLC-MS/MS法對(duì)炎可寧片中黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、腺苷、大黃素的含量測(cè)定方法進(jìn)行考察和優(yōu)化，大大提高了檢測(cè)效率和準(zhǔn)確度，為炎可寧片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供了有力支撐。

1 藥品、試劑與儀器

炎可寧片為吉林吉春制藥股份有限公司產(chǎn)品(批號(hào)150703，161001，161002)、四川省三星堆制藥有限公司產(chǎn)品(批號(hào)160909，170207，170211)、四川省旺林堂藥業(yè)有限公司產(chǎn)品(批號(hào)161202，170201)、太極集團(tuán)四川綿陽(yáng)制藥有限公司產(chǎn)品(批號(hào)1609003)、遼寧金丹藥業(yè)有限公司產(chǎn)品(批號(hào)20160401)。黃芩苷對(duì)照品(純度93.5%，批號(hào)110715-201619，)、鹽酸小檗堿對(duì)照品(純度86.7%，批號(hào)110713-201814)、鹽酸黃柏堿對(duì)照品(純度93.9%，批號(hào)111895-201202)、腺苷對(duì)照品 (純度100%，批號(hào)110879-200202)、大黃素對(duì)照品(純度98.7%，批號(hào)110756-201512)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純，均為德國(guó)默克公司產(chǎn)品；甲酸為質(zhì)譜純，美國(guó)Fisher公司產(chǎn)品；水為純凈水。ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；4000 QTrap 質(zhì)譜分析儀，美國(guó)Absciex公司產(chǎn)品；XS205DU電子分析天平，瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEN C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-體積分?jǐn)?shù)1 mL /L甲酸溶液(B)，體積流量0.3 mL/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量1 μL。梯度洗脫程序：0-3 min，20%→90%A；3-4 min，90%A；4-4.5 min，90%→20%A。

2.1.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)，正、負(fù)離子切換模式掃描，多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)，源噴射電壓：5 500 V(正離子模式)，-4 500 V(負(fù)離子模式)；源溫度550 ℃；霧化氣(GAS1,GAS2)壓力50 psi，氣簾氣壓力(CAD)20 psi，碰撞反應(yīng)氣為氮?dú)狻?個(gè)待測(cè)成分的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、腺苷和大黃素的質(zhì)譜參數(shù)

2.2 混合對(duì)照品溶液制備

精密稱取黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、腺苷、大黃素對(duì)照品適量，分別置于適合的量瓶中；取適量體積置同一個(gè)10 mL量瓶中，加甲醇制成混合對(duì)照品貯備溶液。精密量取上述混合對(duì)照品貯備溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，制成混合對(duì)照品溶液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為19.578 9,2.049 6,0.245 3,0.050 9 ,0.050 9 mg/L。

2.3 供試品溶液制備

取本品10片，除去包衣，研細(xì)，取約0. 1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)700 mL/L甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲30 min，放至室溫，再稱定質(zhì)量，用700 mL/L 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，得到供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照溶液制備

將空白輔料，按炎可寧片的處方比例混合，按照炎可寧片的制備工藝制得陰性對(duì)照樣品，按2.3項(xiàng)下的方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.5 專屬性試驗(yàn)

按2.1項(xiàng)下的色譜與質(zhì)譜條件，分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各1 μL，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示：陰性對(duì)照溶液在各成分提取離子流圖的相應(yīng)位置上沒(méi)有干擾，專屬性強(qiáng)。

1.腺苷；2.鹽酸黃柏堿；3.黃芩苷； 4.鹽酸小檗堿； 5.大黃素 A.對(duì)照品溶液； B.供試品溶液；C .陰性對(duì)照溶液 圖1 5種成分的提取離子流圖

2.6 線性關(guān)系考察

精密量取2.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品貯備溶液0.1，0.5，1，5 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇定容，制成系列濃度對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析。以對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，再分別以信噪比S/n=3、S/n=10時(shí)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為檢測(cè)限和定量限，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明：各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗(yàn)

取2.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果：黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、腺苷、大黃素峰面積的RSD分別為1.37%、2.21%、2.42%、4.59%、4.33%。結(jié)果表明：該方法的精密度符合要求。

表2 線性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號(hào)為150703的炎可寧片細(xì)粉各6分，平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果測(cè)得黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、腺苷、大黃素的平均含量依次為1.080，1.800，0.342，0.0091，0.048 mg/片，其RSD依次為2.12%、2.38%、2.58%、4.87%、3.66%。結(jié)果表明：本方法重復(fù)性符合要求。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份批號(hào)為150703的供試品溶液，在室溫下放置0,2,4,6,8,10,12 h后測(cè)定。結(jié)果:黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、腺苷、大黃素峰面積的RSD依次為2.30%、2.62%、2.76%、4.03%、2.59%。結(jié)果表明：該供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批炎可寧片(批號(hào)150703)，分別精密稱取6份0.05 g細(xì)粉，分別精密加入混合對(duì)照品貯備溶液適量，平行制備6份加標(biāo)供試品溶液，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果：黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、腺苷、大黃素的平均加樣回收率依次為96.63%、96.70%、93.16%、87.58%、90.27%，其RSD依次為2.42%、2.56%、3.12%、2.95%、2.84% 。

2.11 供試品含量測(cè)定

分別取10批炎可寧片，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，通過(guò)回歸方程計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 供試品中黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、 腺苷、大黃素含量的測(cè)定結(jié)果n=6，mg·片-1

3 討 論

3.1 目標(biāo)化合物的選擇

炎可寧片現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較多，但在鑒別和含量測(cè)定中均未涉及板藍(lán)根中的化學(xué)成分，即未對(duì)炎可寧中板藍(lán)根這一藥味進(jìn)行質(zhì)量控制。本試驗(yàn)考察了板藍(lán)根中的多個(gè)指標(biāo)性成分?！吨袊?guó)藥典》2015版一部中含有板藍(lán)根的中成藥將(R,S)-告依春作為指標(biāo)性成分，但炎可寧片中(R,S)-告依春的含量非常小。靛玉紅是板藍(lán)根中的主要成分，但水溶性較差，在炎可寧片中的含量也極低。腺苷等核苷類成分在板藍(lán)根中的含量比較高，對(duì)板藍(lán)根及其制劑的品質(zhì)影響較大，因此選取了腺苷作為指標(biāo)性成分。本實(shí)驗(yàn)從炎可寧片每一味中藥中選取了一種指標(biāo)選成分，這5種化合物包含了黃酮、生物堿、核苷和蒽醌類4種結(jié)構(gòu)類型，對(duì)炎可寧片進(jìn)行較全面的質(zhì)量控制研究。

3.2 供試品提取方法的考察

本研究分別對(duì)提取方式、提取溶劑、提取時(shí)間進(jìn)行研究和優(yōu)化。對(duì)于提取方式，筆者分別考察了超聲和回流，鑒于兩者的提取率差異不大，超聲提取的操作較簡(jiǎn)便，故選擇超聲的提取方式。對(duì)于提取溶劑，筆者分別考察了甲醇、500 mL/L甲醇、700 mL/L甲醇、900 mL/L甲醇，結(jié)果以700 mL/L甲醇的提取率較高。對(duì)于提取時(shí)間，筆者分別考察了20 min、30 min、40 min，結(jié)果顯示30 min的提取率明顯高于20 min，但與40 min的無(wú)明顯差異。為了節(jié)省時(shí)間，筆者選擇提取時(shí)間為30 min。最終確定供試品提取方法是700 mL/L 甲醇超聲提取30 min。

3.3 色譜條件的優(yōu)化

對(duì)于流動(dòng)相，筆者分別采用相同比例的甲醇-水、甲醇-1 mL/L甲酸、乙腈-水、乙腈-1 mL/L甲酸進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示，乙腈比甲醇的洗脫能力更強(qiáng)，各化合物的保留時(shí)間較合適。與純水相比，一定體積分?jǐn)?shù)的甲酸溶液可使這5種化合物的信號(hào)響應(yīng)明顯增強(qiáng)，且使峰形更加對(duì)稱。對(duì)甲酸的體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，顯示：當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為1 mL/L時(shí)，流動(dòng)相的洗脫能力更強(qiáng)，信號(hào)響應(yīng)更高。采用梯度洗脫方式是考慮到其可有效提高洗脫能力和分離效率，縮短分析時(shí)間。因此，選擇乙腈-1 mL/L甲酸作為流動(dòng)相，采用梯度洗脫方式進(jìn)行試驗(yàn)。

綜上所述，本研究建立了UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定炎可寧片中5個(gè)成分含量的方法。該方法靈敏度高，重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)，測(cè)定迅速，結(jié)果準(zhǔn)確。與現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相比，該方法能提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確度，可為炎可寧片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步完善提供可靠依據(jù)。