吳冬梅,潘開瑞

(1.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

腎臟組織中的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分的過度沉積造成腎纖維化幾乎是所有腎臟疾病的必經(jīng)途徑[1-4]，也是腎臟疾病發(fā)展到終末期的重要病理表現(xiàn)。因此，積極探索抑制腎纖維化的藥物和治療方法對(duì)于治療腎臟疾病、延緩腎功能衰竭的進(jìn)展有至關(guān)重要的作用。近年研究[5]表明,P38 MAPK信號(hào)通路在腎臟纖維化過程中起一定作用。金匱腎氣丸藥性平穩(wěn)，建立在治療腎虛的腎氣丸的基礎(chǔ)上，具有良好的抗纖維化作用。本研究采用大鼠單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)制備腎纖維化模型，觀察金匱腎氣丸對(duì)大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響，探討金匱腎氣丸治療腎纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

SD大鼠30只，SPF級(jí)，150～220 g，5～7周齡，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，批號(hào)為SCXK(豫)2015-0004，飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[SCXK(豫)2011-0013]，室溫(22±2)℃，相對(duì)濕度 40%～60%，自由攝食飲水。

1.2 藥品、試劑與儀器

金匱腎氣丸，購自北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號(hào)15010639；吡非尼酮，購自西格瑪奧德里奇生化科技公司,批號(hào)Y0001769；Masson三色染色試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20180716；兔抗大鼠上皮鈣黏素(E-cadherin，批號(hào)ab233611)，Ⅲ型膠原(批號(hào)ab184993)、肌動(dòng)蛋白α(alpha smooth muscle actin，α-SMA，批號(hào)ab5694)，均購自美國Abcam公司；SP免疫組化試劑盒(批號(hào)PV9003)、DAB顯色試劑盒(批號(hào)ZLI9017)，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒(批號(hào)208054)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)205311)、信使核糖核酸(RNA)提取試劑盒(批號(hào)74104)，均購自德國QIAGEN；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(批號(hào)A53225)，購自美國Pierce公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純。CX31光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、CHEMIDOC XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，均為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；ABI 7300熒光定量PCR儀，美國ABI公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組、模型的建立與給藥

將30只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、吡非尼酮組(100 μg/g)、金匱腎氣丸低劑量組(1.0 g/kg)、金匱腎氣丸高劑量組(2 g/kg)，每組6只。 按照董飛俠等[6]單側(cè)輸尿管結(jié)扎再通大鼠模型的建立方法制備模型。以 20 g/L戊巴比妥鈉按 2 μL/g 劑量麻醉大鼠，切開腹部，游離輸尿管，結(jié)扎左側(cè)輸尿管,建立UUO大鼠腎纖維化模型。假手術(shù)組對(duì)大鼠行腹部切口，游離輸尿管，不結(jié)扎，縫合。造模結(jié)束即灌胃給藥，各藥物組灌胃相應(yīng)藥物，假手術(shù)組和模型對(duì)照組灌胃質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 g/L的羧甲基纖維素鈉,1 d 1次，連續(xù) 14 d。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

末次給藥后 24 h，處死大鼠，取左側(cè)腎組織。

1.4.1 腎組織病理學(xué)表現(xiàn)

將腎組織置于40 g/L 的多聚甲醛組織固定液中室溫下固定 24 h，進(jìn)行常規(guī)脫水，石蠟包埋，厚切片，行蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)染色，在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)表現(xiàn)。

1.4.2 腎間質(zhì)損傷指數(shù)

腎組織處理方法同1.4.1。隨機(jī)選擇5個(gè)觀察視野，按腎間質(zhì)損傷程度8項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分[7]，用Image Pro Plus 6.0計(jì)算平均值。

1.4.3 腎組織膠原含量表達(dá)

腎組織石蠟包埋，厚切片，在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察其膠原程度。同時(shí)進(jìn)行馬松三色染色(masson-trichrome staining，Masson)，切片。隨機(jī)選擇20個(gè)觀察視野，藍(lán)色為膠原纖維，用Image Pro Plus 6.0對(duì) Masson 染色腎組織膠原含量進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算陽性表達(dá)占整個(gè)視野的百分比，取平均值。

1.4.4 腎組織Ⅲ型膠原、α-SMA和上皮鈣黏素的蛋白表達(dá)

采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)。按照SP免疫組化試劑盒說明書，檢測(cè)大鼠腎組織Ⅲ型膠原、α-SMA和上皮鈣黏素的蛋白表達(dá)情況。鏡下觀察棕褐色區(qū)域?yàn)殛栃詤^(qū)域。隨機(jī)選取20個(gè)視野拍照，采用Image Pro Plus 6.0分析陽性面積百分比，取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4.5 腎組織Ⅲ型膠原、α-SMA和上皮鈣黏素的mRNA表達(dá)

采用熒光定量PCR檢測(cè)。根據(jù)RNA提取試劑盒說明書提取100 mg腎臟組織的總RNA。查詢Genebank中大鼠Ⅲ型膠原、α-SMA和上皮鈣黏素的RNA序列，β-actin為內(nèi)參，在CDS區(qū)設(shè)計(jì)引物。引物序列見表1。

表1 引物名稱及引物序列

按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)總體積為20 μL，組分如下：RCR預(yù)混試劑 10 μL，上下游引物各0.5 μL，5倍稀釋的cDNA 1 μL，雙蒸水 8 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果用2-△△CT法分析統(tǒng)計(jì)相對(duì)基因表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腎組織病理學(xué)表現(xiàn)對(duì)比

HE染色顯示：假手術(shù)組腎組織病理形態(tài)學(xué)無明顯改變；模型對(duì)照組腎小管擴(kuò)張明顯，間質(zhì)內(nèi)成纖維細(xì)胞顯著增生、膠原纖維表達(dá)增多；金匱腎氣丸低、高劑量組和吡非尼酮組的上述病變明顯改善。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理學(xué)表現(xiàn)對(duì)比(HE染色，×200)

2.2 各組大鼠腎間質(zhì)損傷指數(shù)對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組的腎間質(zhì)損傷指數(shù)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比,各藥物組腎間質(zhì)損傷指數(shù)均降低(P<0.05)。 金匱腎氣丸高劑量組與吡非尼酮組之間腎間質(zhì)損傷指數(shù)對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均低于金匱腎氣丸低劑量組(P<0.05)。見表2。

2.3 各組大鼠腎組織膠原含量表達(dá)對(duì)比

Masson染色顯示：模型對(duì)照組腎間質(zhì)損傷嚴(yán)重，膠原增多；各藥物組的膠原表達(dá)有不同程度降低。見圖2。

表2 各組大鼠腎間質(zhì)損傷指數(shù)對(duì)比

圖2 各組大鼠腎組織病理學(xué)表現(xiàn)對(duì)比(Masson染色，×200)

模型對(duì)照組腎間質(zhì)膠原表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。吡非尼酮組和金匱腎氣丸低、高劑量組的膠原相對(duì)面積與模型對(duì)照組對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腎組織膠原相對(duì)面積對(duì)比

2.4 各組大鼠腎組織Ⅲ型膠原、α-SMA和上皮鈣黏素的蛋白表達(dá)對(duì)比

免疫組化圖片顯示：模型對(duì)照組大鼠腎組織呈棕褐色；假手術(shù)組免疫染色較弱,幾乎無淺棕色；藥物組膠原的表達(dá)從染色強(qiáng)度到面積均明顯減輕。見圖3。

定量分析結(jié)果顯示：與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組的Ⅲ型膠原和α-SMA的蛋白表達(dá)升高，上皮鈣黏素蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型對(duì)照組對(duì)比，3個(gè)藥物組的Ⅲ型膠原、α-SMA的蛋白表達(dá)均降低，上皮鈣黏素的蛋白表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

A. 假手術(shù)組：Ⅲ型膠原表達(dá)強(qiáng)度弱。 B. 模型對(duì)照組：Ⅲ型膠原表達(dá)強(qiáng)度明顯增加。 C.吡非尼酮組：Ⅲ型膠原表達(dá)較模型對(duì)照組減少。 D.金匱腎氣丸低劑量組：Ⅲ型膠原表達(dá)較模型對(duì)照組減少。 E.金匱腎氣丸高劑量組：Ⅲ型膠原表達(dá)較模型對(duì)照組減少。 F.假手術(shù)組：α-SMA表達(dá)強(qiáng)度弱。 G.模型對(duì)照組：α-SMA表達(dá)明顯增加。 H.吡非尼酮組：α-SMA表達(dá)較模型對(duì)照組減少。 I.金匱腎氣丸低劑量組：α-SMA表達(dá)較模型對(duì)照組減少。 J.金匱腎氣丸高劑量組：α-SMA表達(dá)較模型對(duì)照組減少。 K.假手術(shù)組：上皮鈣黏素表達(dá)強(qiáng)度高。 L.模型對(duì)照組：上皮鈣黏素表達(dá)明顯減少。 M.吡非尼酮組：上皮鈣黏素表達(dá)較模型對(duì)照組增多。 N.金匱腎氣丸低劑量組：上皮鈣黏素表達(dá)較模型對(duì)照組增多。 O.金匱腎氣丸高劑量組：上皮鈣黏素表達(dá)較模型對(duì)照組增多。

表4 各組大鼠腎組織III型膠原、α-SMA和上皮鈣黏素的蛋白表達(dá)對(duì)比 灰度值

2.5 各組大鼠腎組織Ⅲ型膠原、α-SMA和上皮鈣黏素的mRNA表達(dá)對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組Ⅲ型膠原和α-SMA的mRNA升高，上皮鈣黏素的mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，3個(gè)藥物組的Ⅲ型膠原和α-SMA的mRNA表達(dá)降低，上皮鈣黏素的mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠腎組織Ⅲ型膠原、α-SMA和上皮鈣黏素的mRNA表達(dá)對(duì)比

3 討 論

絕大多數(shù)慢性腎病都會(huì)導(dǎo)致腎纖維化，炎癥是慢性腎病的基本病理表現(xiàn)，也是腎纖維化的啟動(dòng)因素之一。在治療措施中，通常一類是針對(duì)原發(fā)腎病病因的治療，一類是針對(duì)腎纖維化的治療。目前在腎臟的多項(xiàng)病理參數(shù)中，腎小管萎縮和腎纖維化改變是判斷疾病發(fā)展、預(yù)后的重要因子[8]。吡非尼酮作為治療腎間質(zhì)纖維化及局灶階段性腎小球硬化已用于Ⅳ期臨床，作為抗纖維化藥物，其可減弱纖維細(xì)胞中趨化因子2和趨化因子12的產(chǎn)生,其中抗氧化作用是治療纖維化的重要的機(jī)制之一。P38 MAPK信號(hào)通路的激活所導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞凋亡以及腎纖維化起到重要作用[9]。

目前有大量的中藥對(duì)腎纖維化影響的研究，從單味中藥、單體、提取物到傳統(tǒng)方、經(jīng)驗(yàn)方，以及成品藥，研究?jī)?nèi)容從基因水平、蛋白水平、代謝水平到細(xì)胞基質(zhì)、信號(hào)通路、細(xì)胞因子、蛋白活性等。方、藥主要以活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)、補(bǔ)益正氣等為主。中醫(yī)藥治療腎纖維化、延緩病情進(jìn)展有一定療效。金匱腎氣丸來源于《金匱要略》，是補(bǔ)益正氣、活血化瘀的代表方，是最早的補(bǔ)腎方劑。研究[10]顯示，金匱腎氣丸通過抑制單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、α-SMA、膠原Ⅰ、膠原Ⅲ的表達(dá)來減輕腎間質(zhì)纖維化。

本研究采用單側(cè)輸尿管梗阻方法制備UUO腎纖維化模型，以作用機(jī)制明確的吡非尼酮作為陽性對(duì)照藥物，觀察金匱腎氣丸對(duì)其腎間質(zhì)纖維化的影響。結(jié)果顯示：金匱腎氣丸高劑量同吡非尼酮的療效相似，能有效改善腎小管上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制腎間質(zhì)纖維的表達(dá)，減輕炎癥的發(fā)生，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而低劑量雖有改善腎間質(zhì)纖維化的作用，但效果不顯著。因此，應(yīng)將金匱腎氣丸劑量?jī)?yōu)化納入處方的考量中。此外，金匱腎氣丸和吡非尼酮均可減輕腎臟纖維化，各藥物組的膠原面積明顯低于UUO模型對(duì)照組(P<0.05)，其中金匱腎氣丸高劑量組、吡非尼酮組的腎間質(zhì)損傷指數(shù)較低，療效較好。金匱腎氣丸和吡非尼酮還可顯著下調(diào)E-cadherin、Ⅲ型膠原和α-SMA的表達(dá)水平。

綜上所述，金匱腎氣丸可有效減輕腎間質(zhì)的損傷，減少膠原沉積，降低腎組織中的膠原蛋白的表達(dá)。作為中藥，金匱腎氣丸能通過有效保護(hù)腎間質(zhì)，減輕膠原沉積來發(fā)揮治療腎間質(zhì)纖維化的作用。