許建建，王艷嬌，段玉，馬志敏，賓羽，周常勇，宋震

（西南大學/中國農業(yè)科學院柑桔研究所，重慶400712）

0 引言

【研究意義】柑橘脈突病毒（citrus vein enation virus，CVEV）是黃矮病毒科（Luteoviridae）豌豆耳突花葉病毒屬（Enamovirus）的一種正義單鏈RNA病毒[1]，可引起柑橘脈突病及木瘤病。目前，CVEV在亞洲的日本、印度、土耳其、伊朗，北美的美國，非洲的南非，南美的巴西、秘魯，歐洲的西班牙，大洋洲的澳大利亞等多個國家均有報道[1-7]，并對南美的秘魯柑橘產業(yè)造成了嚴重破壞[8]。我國于20世紀90年代在浙江省臺州市黃巖區(qū)首次檢測出該病毒[9]，隨后在浙江省其他柑橘產區(qū)以及四川也檢測到該病毒[10-11]。CVEV可以侵染大多數的柑橘品種，除通過嫁接傳播外，還可由多種蚜蟲如橘蚜（Toxopetera citricida）、棉蚜（Aphis gossypii）、桃蚜（Myzus pcrsicae）等以持久方式進行傳播[12-13]。這些蚜蟲在中國及世界范圍內分布廣泛，且種群數量大，因而致使CVEV具有較高的傳播流行風險。構建CVEV侵染性克隆將為深入解析其分子特性及致病機理打下基礎，對于CVEV的防控具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】1953年，WALLCE等在美國的California酸橙上首次發(fā)現(xiàn)柑橘脈突病，并初步證明該病由病毒引起。酸橙和墨西哥萊蒙感病后主要表現(xiàn)為葉片側脈和支脈產生耳狀小突起，葉背對應部位出現(xiàn)凹陷[14]。1959年，在澳大利亞發(fā)現(xiàn)一種能引起粗檸檬的根莖部出現(xiàn)木瘤的病害，初步證明該病和脈突病均由 CVEV引起[15-16]。CVEV基因組為正義單鏈RNA，包含5個開放閱讀框（open reading frame，ORF）、5′端 207 nt和 3′端 198 nt的兩個非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）。其中，ORF0嵌合于ORF1，編碼39 kD多肽（354 aa）；ORF1編碼100 kD蛋白（902 aa），包含S39肽酶家族特有的絲氨酸蛋白酶結構域和病毒末端結合蛋白；ORF2編碼146或148 kD融合蛋白，包含解旋酶和多聚酶結構域包圍的甘氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸三肽基序；ORF3編碼21 kD的外殼蛋白（191 aa），最近被證明是基因沉默抑制子；ORF5編碼一個融合蛋白，可能與病毒在植株內的系統(tǒng)移動以及在蚜蟲體內的滯留有關[1,17]。CVEV病毒粒子為等徑對稱多面體，大小約為25或28 nm[7]。CVEV的檢測方法有傳統(tǒng)指示植物鑒定法、常規(guī)反轉錄多聚酶鏈式反應RT-PCR法和實時熒光定量 RT-PCR法[18-19]，但指示植物鑒定法繁瑣且易受柑橘衰退病毒（citrus tristeza virus，CTV）干擾[20]?！颈狙芯壳腥朦c】CVEV可引起柑橘脈突病，但其柯赫氏法則證明尚未完成。通過構建CVEV基因組全長cDNA克隆，經農桿菌介導接種柑橘，并通過 RT-PCR及生物學觀察鑒定其侵染性，將為深入了解其病原分子生物學特性、研究其致病機理打下基礎。【擬解決的關鍵問題】構建CVEV的病毒基因組全長 RT-PCR擴增體系，獲得其侵染性克隆，實現(xiàn)其對柑橘的系統(tǒng)性侵染。

1 材料與方法

試驗于 2017—2020年在西南大學柑桔研究所國家柑桔苗木脫毒中心實驗室完成。

1.1 供試材料

CVEV毒源植株象山紅（Citrus reticulata），柑橘實生苗摩洛哥酸橙（C. aurantium）、鄧肯葡萄柚（C.paradisi）、尤力克檸檬（C. limon）、枳柚（C. paradisi× Poncirus trifoliata）、Rusk枳橙（P. trifoliata × C.sinensis）、棗陽小葉枳（P. trifoliata），基因沉默抑制子 HC-Pro表達質粒等均由西南大學柑桔研究所提供。pXT1雙元表達載體由南京農業(yè)大學陶小榮教授惠贈。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2 酶與試劑

限制性內切酶StuI、SmaI購自北京NEB公司；LA Taq? Polymerase、In-Fusion HD Cloning Kit、SMARTer? RACE 5′/3′ Kit購自大連 TaKaRa 公司；SuperScriptTMIV逆轉錄酶、Trizol試劑購自美國Invitrogen 公司；E.Z.N.A.TMPlasmid Mini ProtocolⅠ試劑盒、E.Z.N.A.TMGel Extraction試劑盒購自 Omega公司；大腸桿菌感受態(tài)細胞JM 109、農桿菌感受態(tài)細胞GV3101購自博邁德生物有限公司。

1.3 引物設計

根據NCBI中已報道的CVEV分離株VE-1基因組序列及5′端RACE測序結果，利用Primer 5軟件設計擴增 CVEV基因組全長 cDNA的特異性引物EV25-F/EV5983-R，以及用于 RACE的 EV532R、EV414R。用于CVEV檢測的VE16-F/VE17-R及其他引物見表1。

1.4 CVEV侵染性克隆構建

1.4.1 毒源植株葉片總RNA提取 按照Trizol試劑說明書提取毒源植株的總 RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.4.2 RACE擴增 提取毒源植株總 RNA，采用SMARTer? RACE試劑盒對CVEV 5′端序列進行擴增，然后通過常規(guī)克隆測序并進行序列分析。第一鏈cDNA合成：配置預混液RACE Buffer Mix：5×First-Strand Buffer 4.0 μL，SMARTer II A Oligonucleotide 1.0 μL，SMARTScribeTMReverse Transcriptase（100 U·μL-1）2.0 μL，dNTPs（20 mmol·L-1）1.0 μL，RNase Inhibitor（40 U·μL-1）0.5 μL，DTT（100 mmol·L-1）0.5 μL，總體積 9 μL。另取模板 RNA 1.75 μL，EV532R 1.0 μL，ddH2O（20 mmol·L-1）1.0 μL，混勻運行程序：72℃ 3 min，迅速置于冰上；加入預混液運行程序：42℃ 60 min；70℃ 10 min。反應所得cDNA備用。

第一輪PCR反應體系：PS Max Premix（2×）12.5 μL，UMP long 1.0 μL，EV532R 1.0 μL，前一步 cDNA 2.0 μL，PS Max Premix（2×）12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，總體積25 μL；第一輪PCR程序：94℃ 2 min；94℃ 15 s，56℃ 15 s，72℃ 30 s，30 個循環(huán)；72℃ 5 min。

將上述所得PCR產物稀釋50倍，取2.0 μL，再加入 EV414R 1.0 μL，NUP 1.0 μL，PS Max Premix（2×）12.5 μL，ddH2O補至總體積 25 μL，運行第二輪 PCR 程序：94℃ 2 min；94℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 30 s，35 個循環(huán)；72℃ 5 min。

1.4.3 CVEV基因組全長 RT-PCR 以提取的總 RNA為模板，使用SuperScriptTMIV逆轉錄酶合成cDNA，反應體系：在冰上配置以下混合液，50 μmol·L-1random hexamers 1 μL，10 mmol·L-1dNTP Mix 1 μL，RNA 模板 9 μL，ddH2O 補至 13 μL；5×SSIV Buffer 4.0 μL，10 mmol·L-1dTT 1.0 μL，RNase OUTTMRecombinant RNase Inhibitor 1.0 μL，SuperScriptTMIV Reverse Transcriptase（200 U·μL-1）1.0 μL，混勻。運行程序：23℃ 10 min；53℃ 15 min。以產物cDNA為模板，使用引物EV25-F/EV5983-R進行PCR擴增。PCR 反應體系為 25 μL：ddH2O 4.0 μL，2×GC buffer I 12.5 μL，EV25-F/EV5983-R 各 1.0 μL，LA Taq 酶 0.5 μL，dNTP 4.0 μL，模板 2.0 μL。反應條件：94℃ 2 min；94℃ 30 s，65℃ 8 min，20個循環(huán)；94℃ 30 s，60℃ 30 s，65℃ 8 min，20 個循環(huán)；68℃ 10 min。

1.4.4 pXT1線性載體獲取 使用NEB限制性內切酶SmaI和StuI酶切pXT1雙元表達載體，獲得pXT1線性載體，反應體系：雙元表達載體pXT1質粒28 μL（1.0 μg），10×Cutsmart Buffer 5.0 μL，限制性內切酶SmaI 1.0 μL，ddH2O 16 μL。反應條件：25℃溫育30 min。再加入1 μLStuI限制性內切酶，37℃溫育30 min。電泳驗證后利用E.Z.N.A.TMGel Extraction試劑盒進行產物回收。

1.4.5 CVEV全長 cDNA的 In-Fusion克隆 使用In-Fusion?HD Cloning Kit將獲得的PCR產物與pXT1線性載體連接。反應體系：5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2 μL，PCR 產物 2 μL，線性化 pXT1 載體 2 μL，ddH2O補足至10 μL。反應條件：50℃溫育30 min。轉化大腸桿菌 JM 109，挑選單克隆采用引物VE16-F/VE17-R[1]進行菌液 PCR，陽性克隆送華大基因公司測序。

1.5 序列分析

利用DNAMAN 7.0對測序后所得CVEV全長cDNA進行序列分析，利用MAGA X軟件構建CVEV進化樹（鄰接法）。

1.6 農桿菌介導真空浸潤接種柑橘

提取1.4.5所得陽性克隆質粒，電擊法轉化農桿菌感受態(tài)細胞 GV3101，均勻涂布到含有利福平（20 μg·μL-1）和卡那霉素（50 mmol·L-1）抗生素的 LB 固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)約48 h。挑選陽性單克隆接種含相應抗生素的 LB液體培養(yǎng)基（20 mg·L-1Rif，50 mg·L-1Kan），200 r/min，28℃振蕩培養(yǎng)12—16 h。離心收集菌體，用接種緩沖液懸?。?0 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1MES，200 μmol·L-1As），使其 OD600為0.8—1.0，同時加入沉默抑制子表達克隆，使樣品OD≈1.0，沉默抑制子OD≈0.5，黑暗靜置2 h備用。參照文獻[21-22]報道的方法進行農桿菌介導真空浸潤接種柑橘，即將柑橘實生苗浸入前步驟接種混合液并置于真空干燥儀，抽真空至壓力-1.0—-0.8 kg·cm-2，保持5 min后快速釋放壓力并立即用無菌水沖洗，22℃暗處理24 h。轉入正常光周期：22℃ 16 h；20℃ 8 h。一周后開始癥狀觀察記錄，并參照王艷嬌[23]的方法開展RT-PCR檢測。

2 結果

2.1 RACE分析

病毒基因組 5′端序列對于全長 cDNA侵染性克隆的構建具有重要影響，個別堿基突變就可能導致其侵染性降低，甚至失去侵染性。因此，在擴增克隆CVEV基因組之前首先采用 RACE技術確定其基因組5′端序列。

采集CVEV毒源象山紅植株新展開的嫩葉，利用Trizol試劑提取總RNA，對CVEV的5′末端進行RACE（圖1-A），獲得大小約414 bp的目標條帶。擴增產物經切膠回收、連接、轉化大腸桿菌JM109，挑取單菌落進行菌液PCR驗證（圖1-B），獲得陽性克隆。隨機挑選3個PCR陽性克隆進行測序，并與已報道的CVEV分離株VE-1進行序列比對，在排除RACE試劑的3—5個堿基后，各陽性克隆基因序列及 VE-1的序列均為 ATATAAGCTATA AAAGAAAAGTGCGTTTACGCTTCCTT···， 說 明CVEV 5′端前70個堿基序列比較保守，這為利用該保守序列設計引物擴增CVEV全長cDNA，進而構建侵染性克隆打下基礎。

2.2 CVEV基因組全長RT-PCR

圖1 CVEV 5′末端RACE及克隆Fig. 1 5′ rapid amplification of cDNA ends (RACE) and its cloning of CVEV

依據5′及3′端保守序列設計直接擴增CVEV基因組全長的引物 EV25-F/EV5983-R。以 2.1提取的總RNA為模板，進行CVEV的基因組全長RT-PCR。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示（圖2），PCR產物片段大小約5 983 bp，符合預期CVEV基因組全長大小，切膠回收備用。

2.3 CVEV基因組全長cDNA克隆、鑒定及序列分析

使用限制性內切酶SmaI和StuI酶切pXT1雙元表達載體。將2.2獲得的RT-PCR產物和pXT1線性載體切膠回收、In-Fusion HD Cloning Kit連接、轉化大腸桿菌JM 109。挑取單菌落采用引物VE16-F/VE17-R進行菌液 PCR篩選，然后采用引物 EV25-F/EV5983-R進行CVEV全長cDNA初步PCR鑒定（圖3），共計獲得10個CVEV基因組全長cDNA克隆。

圖2 CVEV的基因組全長RT-PCRFig. 2 RT-PCR for full-length genome of CVEV

圖3 CVEV全長cDNA克隆的PCR鑒定Fig. 3 Identification of CVEV full-length cDNA by PCR

隨機選取 6個陽性克隆，命名為 CVEV1901—CVEV1906并進行序列測定。結果表明所獲克隆均符合 CVEV基因組全長預期，序列之間的一致性為99.35%。其中，CVEV1901全長5 983 nt，由5個ORF、5′端207 nt和3′端198 nt的兩個UTR以及在ORF2和ORF3之間的122 nt的基因間隔區(qū)組成。進一步分析顯示，CVEV-1901與浙江分離株 XZG（登錄號：MN596377）僅有一個堿基差異，第 1 375位堿基G→A，序列一致性99.98%，與四川SM分離株序列一致性 99.11%；與西班牙 VE-1分離株、美國加州VE701分離株和日本IBK分離株基因組序列一致性分別為98.61%、97.36%和96.89%；與同一屬豌豆耳突花葉病毒（pea enation mosaic virus）和紫花苜蓿耳突病毒（alfalfa enamovirus）的序列一致性分別為90.46%和90.26%。

在利用 MEGA X構建的系統(tǒng)進化樹上，CVEV1901與中國浙江分離株XZG關系最近，并與四川分離株SM一起聚為一簇；與西班牙分離株VE-1、美國加州分離株VE701、日本分離株IBK距離較近；而與同屬的豌豆耳突花葉病毒和紫花苜蓿耳突病毒距離相對較遠；與黃矮病毒科其他不同屬病毒分居在不同的大分支上，這與序列分析結果一致（圖4）。

2.4 CVEV基因組全長cDNA克隆的侵染性鑒定

2.4.1 尤力克檸檬接種 將獲得的 CVEV全長cDNA克隆CVEV1901和CVEV1902分別轉化農桿菌 GV3101，以 pTX1空載體為陰性對照，真空浸潤接種尤力克檸檬實生苗。接種 30 d后，抽提系統(tǒng)新發(fā)葉片RNA進行RT-PCR檢測，結果表明兩株 CVEV1901接種的尤力克植株檢測出 CVEV特異性條帶（圖5）。初步說明CVEV侵染性克隆構建成功。

圖4 CVEV與黃矮病毒科中其他病毒全長基因序列的系統(tǒng)進化樹Fig. 4 Polygenetic tree of CVEV and other members of family Luteoviridae

圖5 CVEV全長cDNA克隆接種尤力克檸檬的RT-PCR檢測Fig. 5 RT-PCR detection of C. limon inoculated with full-length cDNA of CVEV

2.4.2 多品種柑橘接種 為進一步確認 CVEV1901的侵染性，通過農桿菌介導的真空浸潤接種摩洛哥酸橙、鄧肯葡萄柚、尤力克檸檬、枳柚、Rusk枳橙、棗陽小葉枳6個柑橘品種，并以pTX1空載體為陰性對照。結果發(fā)現(xiàn)部分CVEV1901接種的摩洛哥酸橙出現(xiàn)CVEV侵染的典型癥狀，葉片側脈產生耳狀小突起，葉背有相應的凹陷，葉片皺縮，部分鄧肯葡萄柚和尤力克檸檬葉片出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象（圖6），而 pTX1空載體接種對照則無上述癥狀表現(xiàn)。CVEV1901接種后120 d的RT-PCR檢測結果表明，摩洛哥酸橙、鄧肯葡萄柚、尤力克檸檬、枳柚、Rusk枳橙和棗陽小葉枳的CVEV 陽性率分別為 16/17（94.12%）、12/14（85.71%）、16/21（76.19%）、15/19（78.95%）、13/14（92.86%）和0/18（0），而 pTX1空載體接種對照為0。這進一步表明CVEV1901為具有侵染性的CVEV基因組全長cDNA克隆。

圖6 CVEV1901接種不同柑橘品種的癥狀Fig. 6 Symptoms on different citrus varieties inoculated with CVEV1901

3 討論

侵染性克隆的構建是深入研究病毒分子生物學特性、致病機理及載體化利用的重要基礎[24-29]。但相對于侵染草本植物的病毒，目前關于果樹病毒侵染性克隆的報道較少，構建難度較大。本研究通過對CVEV病毒全長基因組的一次性 RT-PCR擴增，與 pXT1載體進行無縫重組克隆，獲得了CVEV的侵染性克隆。本研究所獲的侵染性克隆CVEV1901與我國已報道的XZG及SM分離株基因組長度一致，結構相同，同源性均高于 99%，通過農桿菌介導的真空浸潤可以高效侵染多種柑橘品種。這不僅為研究CVEV分子生物學特性如復制、移動、基因功能等提供了單一遺傳背景的材料，而且為深入研究CVEV的致病機制打下了堅實基礎。在通過突變獲取弱毒株系用于交叉保護，或改造為基因沉默載體方面也具有廣闊的應用前景。

目前，植物 RNA病毒侵染性克隆的構建主要還是通過分段擴增、分段克隆來獲得[30]。這種方法可能會造成獲得的植物病毒全長cDNA為假重組體。本試驗采用一步法RT-PCR擴增獲得CVEV全長cDNA，則有效避免了這種情況。不過，該方法對RNA模板、反轉錄酶、DNA聚合酶等有比較嚴格的要求，尤其是模板質量和反轉錄酶及聚合酶的擴增和保真能力。多次試驗表明，利用Trizol法提取柑橘葉片總RNA可以達到本試驗需求，同時為防止RNA降解，提取RNA后立即進行第一鏈cDNA的合成。不同的反轉錄酶對于病毒基因組的全長擴增也有不同的影響，通過對不同類型反轉錄酶多次試驗，發(fā)現(xiàn)采用 SuperScriptTMIV逆轉錄酶可成功擴增CVEV全長，CVEV1901與毒源植株XZG分離株的全基因組相比僅有一個堿基差異，與中國分離株的同源性高于99%，表明該酶的保真性能也有保證。最后，使用 In-Fusion重組連接線性化pXT1和CVEV全長cDNA，精確置于載體的35S后，在啟動子與病毒5′端序列之間沒有任何非病毒序列，保證了轉錄出的病毒的精確性，也為所獲克隆具備侵染性打下了良好基礎。

接種方式對病毒侵染性克隆成功接種具有重要的影響[22]。CVEV1901通過農桿菌介導的真空浸潤可高效侵染多個柑橘品種。但在通過農桿菌介導的注射方式對煙草、豌豆、蠶豆、蕓豆、昆諾藜等草本植物進行接種時，通過RT-PCR均未檢測到CVEV陽性植株。表明CVEV1901可能無法通過注射方式成功侵染上述草本植物，當然部分植物也可能并非CVEV的有效寄主。這一現(xiàn)象在柑橘黃化脈明病毒（citrus yellow vein clearing virus）侵染性克隆接種時也曾出現(xiàn)[22]，有待進一步研究。

4 結論

建立了CVEV的基因組全長RT-PCR擴增體系，獲得CVEV基因組全長cDNA克隆。通過農桿菌介導的真空浸潤接種，RT-PCR檢測和生物學癥狀觀察，證明CVEV1901為具有侵染性的CVEV基因組全長cDNA侵染性克隆。

致謝：南京農業(yè)大學陶小榮教授惠贈pXT1雙元表達載體，在此表示感謝！