龔強(qiáng)，王軻，葉興國(guó)，杜麗璞，徐延浩

（1長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北荊州 434025；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081）

0 引言

【研究意義】大麥（Hordeum vulgareL.）是世界第四大禾谷類作物，約占禾谷類作物總產(chǎn)量的8%[1]。大麥營(yíng)養(yǎng)成分豐富，富含蛋白質(zhì)、抗性淀粉、纖維素和維生素等，而且大麥抗旱、耐貧瘠、耐鹽堿性能較強(qiáng)，適應(yīng)性廣，在應(yīng)對(duì)惡劣環(huán)境化和土壤鹽漬化等逆境脅迫方面有著重要意義。目前，國(guó)內(nèi)外大麥轉(zhuǎn)基因研究大多以轉(zhuǎn)化效率較高的品種Golden Promise為受體，利用其他商業(yè)化大麥進(jìn)行轉(zhuǎn)化難以獲得轉(zhuǎn)基因植株，或者轉(zhuǎn)化效率很低，限制了大麥基因工程育種的步伐。近幾年，大麥高質(zhì)量參考基因組序列和部分基因功能注釋不斷完善[2]，需要對(duì)大麥進(jìn)行功能基因組研究。另外，國(guó)內(nèi)還未發(fā)現(xiàn)有關(guān)無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因大麥研究的報(bào)道。因此，提高大麥的遺傳轉(zhuǎn)化效率，拓寬大麥遺傳轉(zhuǎn)化的基因型，建立大麥無篩選標(biāo)記遺傳轉(zhuǎn)化體系，對(duì)于大麥基因工程改良和產(chǎn)業(yè)化種植具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】長(zhǎng)期以來，有關(guān)大麥遺傳轉(zhuǎn)化的研究較少，轉(zhuǎn)化效率較低。1994年 WAN等[3]利用基因槍分別轉(zhuǎn)化大麥 Golden Promise幼胚、愈傷組織和小孢子，首次獲得可育轉(zhuǎn)基因株系。TINGAY等[4]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法建立了大麥Golden Promise幼胚的轉(zhuǎn)化體系，轉(zhuǎn)化效率 4.2%。TRIFONOVA等[5]通過調(diào)整生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間和微損傷等方法，獲得大麥轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化效率1.7%—6.3%。FANG等[6]將綠色熒光蛋白作為可視標(biāo)記，以hpt作為篩選基因，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化大麥Golden Promise幼胚，轉(zhuǎn)化效率3.4%。TRAVELLA等[7]依據(jù)熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）檢測(cè)結(jié)果，比較了農(nóng)桿菌介導(dǎo)和基因槍介導(dǎo)對(duì)大麥轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)等的影響，發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化效率是基因槍的2倍，且在利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得的轉(zhuǎn)基因植株中目標(biāo)基因表達(dá)穩(wěn)定、沉默情況較少。BARTLETT等[8]對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大麥后的再生過程進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，將hpt標(biāo)記基因和luc熒光素報(bào)告基因轉(zhuǎn)化大麥Golden Promise幼胚，轉(zhuǎn)化效率提高到25%。HENSEL等[9]進(jìn)一步研究了外植體不同處理方法和共培養(yǎng)條件等因素對(duì)大麥轉(zhuǎn)化效率的影響，進(jìn)一步提高了大麥Golden Promise幼胚的轉(zhuǎn)化效率（高達(dá) 86.0%），商業(yè)化春性大麥品種Optic、Helium和冬性大麥品種Igri、Tafeno等的轉(zhuǎn)化效率也達(dá)到0.2%—7.8%。目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)大麥遺傳轉(zhuǎn)化的研究非常少，還處在建立高頻再生體系和提高遺傳轉(zhuǎn)化效率的研究階段[10-20]。國(guó)內(nèi)最早獲得大麥轉(zhuǎn)基因植株的研究報(bào)道出現(xiàn)于 2004年，任江萍等[21]以啤酒大麥品種晉引6號(hào)幼胚為材料，用基因槍法對(duì)1 200個(gè)幼胚進(jìn)行了轟擊，獲得了7株陽(yáng)性植株，轉(zhuǎn)化效率為0.58%，在過表達(dá)TrxS的轉(zhuǎn)基因植株中，α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性有顯著性提高[22]。呂維濤等[23]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將反義磷脂酶Dγ轉(zhuǎn)入大麥，獲得了可耐0.7% NaCl的植株。李靜雯等[24]利用RNAi抑制B-hordein的合成，降低了大麥品種Golden Promise籽粒蛋白質(zhì)的含量。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展, 轉(zhuǎn)基因植物的安全性已經(jīng)引起了公眾的廣泛關(guān)注，其中篩選標(biāo)記基因的存在是轉(zhuǎn)基因植物安全性評(píng)價(jià)的主要隱患。人們先后提出了幾種獲得無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)，包括共轉(zhuǎn)化法、定位重組體系、多元自動(dòng)轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)、轉(zhuǎn)座子再定位系統(tǒng)和同源重組體系等，其中共轉(zhuǎn)化法應(yīng)用最為普遍[25-26]。特別是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雙 T-DNA載體共轉(zhuǎn)化法，不但可以避免將細(xì)菌篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)入植物，而且可以從轉(zhuǎn)基因植物中排除nptII、Bar、hpt等篩選標(biāo)記，在獲得安全型轉(zhuǎn)基因植物方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[26]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)已經(jīng)在很多植物如煙草[27]、大豆[28]、玉米[29]、高粱[30]、水稻[31]和小麥[26]中成功獲得無篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然大麥Golden Promise的遺傳轉(zhuǎn)化效率較高，但是其他大麥品種轉(zhuǎn)化效率仍然很低，需要拓展大麥基因型范圍和提高轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)基因大麥安全問題無疑會(huì)受到關(guān)注，在國(guó)內(nèi)建立大麥無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)迫在眉睫?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬以優(yōu)良大麥品種Vlamingh為受體，通過對(duì)培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)步驟進(jìn)行優(yōu)化，建立其高效遺傳轉(zhuǎn)化體系。進(jìn)一步利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化法將雙T-DNA表達(dá)載體導(dǎo)入大麥，并通過后代自然分離獲得無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因大麥植株。本研究將拓寬大麥轉(zhuǎn)基因的受體基因型范圍，為大麥基因功能解析和轉(zhuǎn)基因育種提供高效的轉(zhuǎn)化體系，為安全型轉(zhuǎn)基因大麥材料創(chuàng)制提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 植物材料和表達(dá)載體

供試材料為澳大利亞主栽大麥品種Vlamingh，播種于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所人工氣候室，生長(zhǎng)期間的溫度為25℃，光周期為16 h光照、8 h黑暗。取授粉后 12—14 d 的幼胚用于遺傳轉(zhuǎn)化。T0代轉(zhuǎn)基因大麥植株及時(shí)移栽，放置于人工氣候室中生長(zhǎng)和檢測(cè)。T1代轉(zhuǎn)基因大麥植株2018年9月種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院試作物科學(xué)研究所溫室，用于篩選無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株。

植物表達(dá)載體 pWMB123由葉興國(guó)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[26]，包含2段獨(dú)立的T-DNA區(qū)域，一段T-DNA區(qū)域含有Bar，另一段T-DNA區(qū)域含有GUS（圖1）。將表達(dá)載體pWMB123轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株C58C1后用于大麥轉(zhuǎn)化。

圖1 雙T-DNA表達(dá)載體pWMB123結(jié)構(gòu)Fig. 1 The structure of pWMB123 vector with double T-DNA regions

1.2 培養(yǎng)基

大麥遺傳轉(zhuǎn)化所用的基本培養(yǎng)基為 MS，在 MS培養(yǎng)基中添加不同有機(jī)物質(zhì)（表 1），所有培養(yǎng)基的pH調(diào)整為5.8，121℃滅菌15 min。

將大麥幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織分為3份，1份轉(zhuǎn)移到過渡培養(yǎng)基（transition medium，TM），另外2份分別轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基（differentiation medium，DM）和改良的分化培養(yǎng)基（modified differentiation medium，DMM：DM 培養(yǎng)基添加 kinetin（KT）1 mg·L-1、6-benzylaminopurine（6-BA）0.5 mg·L-1和 1-naphthaleneacetic acid（NAA）0.05 mg·L-1），光照培養(yǎng)2周，誘導(dǎo)綠芽分化。

將完整的大麥幼胚接種到1/2MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行成苗培養(yǎng)，利用該方法探索吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）、吲哚丁酸（indole butyric acid，IBA）和萘乙酸（NAA）不同配比對(duì)大麥植株生根的影響。共利用 15種不同生長(zhǎng)素配比的培養(yǎng)基對(duì)大麥植株的生根效果進(jìn)行比較（表 2）。此外，根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)[9,32]，探索添加IBA，且沒有其他生長(zhǎng)素的第一次篩選培養(yǎng)基（first selection medium，SM1）、DM和大麥再生培養(yǎng)基（barley regeneration medium，BRM，NH4NO30.32 g·L-1、KNO33.64 g·L-1、KH2PO40.325 g·L-1、CaCl2·2H2O 0.441 g·L-1、MgSO4·7 H2O 0.246 g·L-1、NaFeEDTA 27.53 mg·L-1、MnSO4·H2O 84 μg·L-1、H3BO331 μg·L-1、ZnSO4·7 H2O 72 μg·L-1、Na2MoO4·2H2O 1.2 μg·L-1、CuSO4·5 H2O 0.25 μg·L-1、CoCl2·6 H2O 0.24 μg·L-1、KI 1.7 μg·L-1、Vitamin B5 112 mg·L-1、6-BAP 0.225 mg·L-1、L-glutamine 146.4 mg·L-1、36 g·L-1maltose stock, and 196 μL·L-1和 CuSO4·5 H2O 0.245 mg·L-1）的生根效果。

表1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化大麥幼胚所用培養(yǎng)基及其組成Table 1 Composition of the media used for Agrobacterium-mediated barley immature embryo transformation (g·L-1)

表2 不同激素配比的15種1/2MS生根培養(yǎng)基Table 2 Composition of 15 rooting media with different hormone ratios on the basis of 1/2 MS medium (mg·L-1)

1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化大麥幼胚

參考 BARTLETT等[8]方法進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麥轉(zhuǎn)化，并進(jìn)行較大改動(dòng)，具體步驟如下：

1.3.1 取樣和滅菌 分批次種植大麥?zhǔn)荏w材料，取開花授粉后14 d左右的未成熟大麥籽粒，用70%乙醇表面滅菌 1 min，然后用 15%次氯酸鈉震蕩滅菌 15 min，最后用無菌水洗4—5次。在顯微鏡下用解剖刀掀開大麥種皮，用尖鑷子小心剝?nèi)〈篼溚暾叻胖糜跊]有乙酰丁香酮的侵染液（infection medium，IM）培養(yǎng)基中。

1.3.2 農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng) 將攜帶表達(dá)載體pWMB123的C58C1農(nóng)桿菌28℃過夜培養(yǎng)，取2 mL菌液5 000 r/min離心，然后加入2 mL IM培養(yǎng)基，侵染大麥幼胚約 10 min，然后將胚放入共培養(yǎng)培養(yǎng)基（co-culture medium，CM），23℃黑暗共培養(yǎng)。

1.3.3 愈傷組織的誘導(dǎo) 共培養(yǎng)2 d后，切除胚軸，盾片面向上轉(zhuǎn)移到SM1，進(jìn)行愈傷的誘導(dǎo)和第一次篩選培養(yǎng)，25℃黑暗培養(yǎng)14 d左右，然后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到SM2進(jìn)行第二次篩選培養(yǎng)，25℃黑暗培養(yǎng)21 d左右。

1.3.4 愈傷組織的分化，轉(zhuǎn)基因苗的生根及移栽 將愈傷組織轉(zhuǎn)移到DM，25℃光照條件下培養(yǎng)2—3周，誘導(dǎo)綠芽分化。然后及時(shí)將綠芽轉(zhuǎn)到1/2MS生根培養(yǎng)基（rooting medium，RT）繼續(xù)25℃光照培養(yǎng)，根系健壯的再生小植株直接移栽到花盆中。

1.4 T0代轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

從移栽成活的抗性再生植株上取少量葉片，利用Bar蛋白抗體試紙條法（取1 cm長(zhǎng)的葉片，液氮速凍破碎；加入0.4 mL Extractin buffer，將試紙條標(biāo)有指示箭頭的一端浸入 buffer內(nèi)，靜止 1 min，觀察 Bar蛋白抗體表達(dá)結(jié)果）檢測(cè)Bar，利用組織化學(xué)染色法結(jié)合PCR擴(kuò)增檢測(cè)GUS。

1.5 T1代中無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株篩選

種植T0代Bar和GUS均為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株，利用新型植物基因組提取試劑盒 CW0531（康為世紀(jì)生物科技有限公司）從葉片中提取基因組DNA，然后分別用特異引物 Bar-F：5′-ACCATCGTCAACCACT ACATCG-3′，Bar-R：5′-GCTGCCAGAAACCCACGTC ATG-3′和 GUS-F：5′-CAAGGAAATCCGCAACCATA TC-3′，GUS-R：5′-TCAAACGTCCGAATCTTCTCCC-3′對(duì)基因組中的Bar和GUS進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR擴(kuò)增體系為2×Taq Master Mix（諾唯贊生物科技有限公司，南京）7.5 μL、10 pmol·L-1引物各 0.5 μL 和 DNA模板50—200 ng，補(bǔ)充ddH2O至15 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。統(tǒng)計(jì) T1代轉(zhuǎn)基因植株中Bar和GUS的分離情況，篩選只含有GUS不含有Bar的無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株。

1.6 Southern blot雜交

利用CTAB法從轉(zhuǎn)基因大麥葉片中提取高質(zhì)量基因組 DNA，對(duì) 30 μg基因組 DNA用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ進(jìn)行過夜酶切，然后利用 1%的瓊脂糖凝膠在30 V電壓下電泳16 h。將凝膠置于20%鹽酸溶液中變性處理10 min，用ddH2O清洗2—3次。通過真空泵轉(zhuǎn)膜儀將酶切后的 DNA片段轉(zhuǎn)移至帶正電的尼龍膜上。以pWMB123質(zhì)粒DNA為模板，分別用Bar和GUS特異引物（Bar-F、Bar-R、GUS-F和GUS-R）擴(kuò)增的片段作為探針，探針標(biāo)記和雜交過程參考 DIG High Prime DNA labelling and Detection Starter Kit II（Roche，美國(guó)）說明書進(jìn)行。利用Tanon 5200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)大麥愈傷組織分化植株和生根的影響

將 SM2培養(yǎng)基上的大麥幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織分為3份，1份按照BARTLETT等[8]方法轉(zhuǎn)移到TM上，在弱光照條件下（光照條件下用紙遮蓋培養(yǎng)皿）培養(yǎng)2周；另外2份分別轉(zhuǎn)移到DM和DMM上。大麥幼胚愈傷組織經(jīng)在DM和DMM上正常光照培養(yǎng)2周后，發(fā)現(xiàn)DMM上大多數(shù)愈傷組織的能產(chǎn)生綠芽點(diǎn)或綠苗（圖2-A），而DM上僅有少數(shù)愈傷組織產(chǎn)生綠芽點(diǎn)（圖2-B），表明DMM比DM更適合大麥愈傷組織分化。將在TM弱光條件下繼代培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到 DMM 培養(yǎng) 2周后發(fā)現(xiàn)，雖然有綠芽的產(chǎn)生（圖2-C），但分化率明顯不及直接分化的愈傷組織。

將分化培養(yǎng)基上產(chǎn)生大麥再生小植株直接轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基1/2MS上，發(fā)現(xiàn)再生植株產(chǎn)生白化現(xiàn)象（圖3-A）。然后在培養(yǎng)基中添加2.5 mg·L-1的CuSO4，發(fā)現(xiàn)可以顯著降低白化現(xiàn)象（圖 3-B）。因此，后續(xù)所有使用的生根培養(yǎng)基都添加了2.5 mg·L-1的CuSO4，但是轉(zhuǎn)基因苗在1/2MS培養(yǎng)基上仍然不生根。

為了解決大麥轉(zhuǎn)基因植株生根困難的問題，首先利用一步成苗培養(yǎng)方法激素不同配比對(duì)大麥植株生根的影響。共利用15種不同生長(zhǎng)素配比的培養(yǎng)基對(duì)大麥植株的生根效果進(jìn)行了比較（表2），培養(yǎng)10 d后發(fā)現(xiàn)單加IBA的生根效果最好（圖4）。不同濃度的IBA都可以顯著促進(jìn)大麥的生根，其中1 mg·L-1的生根效果最佳，因此，生根培養(yǎng)基中選擇添加到1 mg·L-1的IBA。

雖然一步成苗的大麥植株在添加 IBA的 1/2MS培養(yǎng)基上生根效果很好，但轉(zhuǎn)基因大麥植株在該培養(yǎng)基上生根效果并不理想。因此，又探索了添加IBA的沒有其他生長(zhǎng)素的SM1、DM和BRM的生根效果。結(jié)果表明，大麥轉(zhuǎn)基因植株在僅添加IBA無其他生長(zhǎng)素的DM和BRM雖然生長(zhǎng)狀態(tài)不錯(cuò)，但是仍然很難生根，而在添加IBA的無其他生長(zhǎng)素的SM1的生根效果很好。

圖2 大麥愈傷組織在不同培養(yǎng)基上的分化情況Fig. 2 Differentiation performance of barley callus on different shoot induction medium

圖3 CuSO4對(duì)轉(zhuǎn)基因大麥小植株白化現(xiàn)象的影響Fig. 3 The effect of copper sulfate on the albinism of transgenic barley plants

2.2 大麥轉(zhuǎn)基因T0代陽(yáng)性植株的獲得和檢測(cè)

利用攜帶pWMB123表達(dá)載體的C58C1農(nóng)桿菌共轉(zhuǎn)化了大麥品種Vlamingh的138個(gè)幼胚，經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)和2次篩選培養(yǎng)，獲得了125個(gè)抗性愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率為91%?？剐杂鷤M織經(jīng)過在優(yōu)化過的培養(yǎng)基上分化和生根，共獲得14棵候選轉(zhuǎn)基因植株（BL1—BL14），轉(zhuǎn)化效率為 10.14%。將幼苗及時(shí)移栽至花盆，在溫室中生長(zhǎng)。然后對(duì) T0代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行試紙條檢測(cè)，并提取基因組DNA進(jìn)行目標(biāo)基因的PCR檢測(cè)。Bar蛋白抗體試紙條檢測(cè)結(jié)果顯示全部轉(zhuǎn)基因植株中均含有Bar（圖6-A）；組織化學(xué)染色和PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，其中4株轉(zhuǎn)基因株（BL2—BL5）不含有GUS（圖6-B和圖6-C），說明攜帶GUS和Bar的2個(gè)T-DNA的共轉(zhuǎn)化效率為71.43%。

2.3 T1代中無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因大麥植株的獲得

為了獲得無篩選標(biāo)記大麥轉(zhuǎn)基因植株，選取4個(gè)Bar和GUS均為陽(yáng)性的T0代大麥轉(zhuǎn)基因植株BL1、BL6、BL7和BL8，形成T1代株系，研究T1代中外源轉(zhuǎn)入基因的分離情況。理論上，T1代應(yīng)該分離出4種類型：Bar+GUS—、Bar—GUS+、Bar—GUS—和Bar+GUS+。利用PCR方法共檢測(cè)了98株T1代轉(zhuǎn)基因植株（圖7），在BL8株系獲得了2株無篩選標(biāo)記（Bar—GUS+）植株（表3），共檢測(cè)到3株Bar+GUS—類型植株，沒有檢測(cè)到Bar—GUS—類型植株，其他植株全部為Bar+GUS+類型（表3）。根據(jù)PCR檢測(cè)結(jié)果，選取部分T1代轉(zhuǎn)基因植株，分別利用Bar和GUS作探針進(jìn)行Southern blot鑒定（圖8），進(jìn)一步證實(shí)BL8-15和BL8-19為無篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株。在BL-8株系中無篩選標(biāo)記植株的獲得效率為 6.9%，在全部 T1代植株中無篩選標(biāo)記植株的獲得效率僅有 2.04%。以上結(jié)果也證實(shí)，Bar和GUS可以在大麥轉(zhuǎn)基因后代中穩(wěn)定遺傳和表達(dá)。

表3 T1代株系中Bar和GUS的分離情況Table 3 Genotyping detection for the Bar and GUS genes in the selected T1 lines by PCR

圖4 大麥再生植株在不同激素配比培養(yǎng)基上的生根情況Fig. 4 Rooting status of transgenic barley plantlets on 15 media with different hormone ratios

圖5 不同培養(yǎng)基成分對(duì)大麥再生植株生根的影響Fig. 5 Effect of different media containing various auxin ratios on the rooting of transgenic barley plantlets

3 討論

3.1 大麥遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化

圖6 T0代轉(zhuǎn)基因大麥植株鑒定Fig. 6 Identification of T0 transgenic barley plants

圖7 T1代轉(zhuǎn)基因大麥株系BL8中Bar（A）和GUS（B）的PCR檢測(cè)Fig. 7 PCR detection of Bar (A) and GUS (B) genes in T1 transgenic barley plants

目前，國(guó)內(nèi)外大麥遺傳轉(zhuǎn)化的受體品種主要為Golden Promise，基因型范圍非常窄。本研究利用了再生能力比較強(qiáng)的大麥品種Vlamingh，拓展了大麥遺傳轉(zhuǎn)化的范圍。尤其重要的是，該大麥品種為春性，在溫室條件下其生長(zhǎng)周期比Golden Promise短一個(gè)月以上， Vlamingh作為受體材料不但可以縮短轉(zhuǎn)化周期，還可以減少在溫室培養(yǎng)材料的水電等消耗。本研究參考 BARTLETT等[8]描述的大麥遺傳轉(zhuǎn)化體系，并根據(jù)之前的文獻(xiàn)報(bào)道和葉興國(guó)實(shí)驗(yàn)室在小麥遺傳轉(zhuǎn)化方面積累的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)大麥遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化。首先，發(fā)現(xiàn)同樣的大麥愈傷組織經(jīng)過在TM上培養(yǎng)后分化能力下降（圖2），因此認(rèn)為可以省略TM這一步驟，這樣不但縮短了大麥的遺傳轉(zhuǎn)化過程，也節(jié)省了時(shí)間和成本。另外，還對(duì)分化培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化發(fā)現(xiàn)DMM分化效果最好（圖2）。通過調(diào)節(jié)生根培養(yǎng)基中不同激素比例（圖4）和培養(yǎng)基關(guān)鍵成分（圖5），篩選到了生根效果較好的 SM1。利用優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化體系植株再生率很高，但是由于改良分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基用了一些愈傷組織和再生植株，減少了器官齊全轉(zhuǎn)基因植株的數(shù)量，最終的轉(zhuǎn)化效率只有10.14%，該體系實(shí)際轉(zhuǎn)化效率應(yīng)該更高。

圖8 T1代轉(zhuǎn)基因大麥植株的Southern blot鑒定Fig. 8 Southern blot detection of T1 transgenic barley plants

3.2 無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因大麥植株獲得效率

WANG等[26]對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化雙 T-DNA載體的 12個(gè)小麥T1株系進(jìn)行了無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株篩選，在3個(gè)株系中獲得了無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株，無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株的獲得效率分別為 40.0%、14.3%和7.5%；而在全部T1代群體（共12個(gè)株系）中無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株的獲得效率僅為4.3%。MATTHEWS等[33]利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化雙T-DNA載體，也成功獲得了3個(gè)只含目標(biāo)基因的無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因大麥植株，無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株獲得效率0.83%—18.55%。根據(jù)孟德爾遺傳定律，如果篩選標(biāo)記基因和目標(biāo)基因在 T0代轉(zhuǎn)基因植株中都以單拷貝形式存在，T1代中無篩選標(biāo)記植株的獲得效率應(yīng)為 18.75%，而本研究中 BL8株系T1代中無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株的頻率僅為6.9%。本研究T1代大麥轉(zhuǎn)基因植株的Southern blot鑒定結(jié)果顯示（圖8），Bar和GUS在轉(zhuǎn)基因植株中整合的拷貝數(shù)較高，尤其Bar的拷貝數(shù)在多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株中高達(dá)10個(gè)以上，顯著降低了無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株的頻率。因此，為了提高無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株獲得效率，需要降低轉(zhuǎn)基因植株中Bar整合的拷貝數(shù)。

MCCORMAC等[27]發(fā)現(xiàn)雙 T-DNA載體中 2個(gè)T-DNA區(qū)的大小影響外源轉(zhuǎn)入基因整合的拷貝數(shù)。WANG等[26]研究結(jié)果也表明，攜帶Bar的T-DNA區(qū)段較小導(dǎo)致其在轉(zhuǎn)基因植株中整合的拷貝數(shù)較多。在本研究中，含Bar的T-DNA區(qū)段長(zhǎng)度僅為1.7 kb左右，而含GUS的T-DNA區(qū)段長(zhǎng)度為4.4 kb，Southern結(jié)果也顯示GUS基因在轉(zhuǎn)基因植株中的拷貝數(shù)確實(shí)低于Bar。因此，增加含Bar的T-DNA區(qū)段長(zhǎng)度可以降低Bar在T0代轉(zhuǎn)基因植株的拷貝數(shù)，從而達(dá)到增加T1代無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株的獲得效率。

3.3 獲得無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的意義

目前，轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性越來越引起了公眾關(guān)注，成為了轉(zhuǎn)基因植物商業(yè)化種植的主要限制。實(shí)際上選擇標(biāo)記的存在是轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化的主要障礙之一。早期消除選擇標(biāo)記和不必要的載體骨架將有助于克服生物安全性限制，并有助于環(huán)境釋放轉(zhuǎn)基因大麥。因此，開發(fā)無標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因大麥對(duì)于大麥轉(zhuǎn)基因育種和大麥轉(zhuǎn)基因商業(yè)化有重要意義。

在植物遺傳轉(zhuǎn)化研究中使用的標(biāo)記基因主要有 2種類型：第一種是細(xì)菌選擇性標(biāo)記，如bla、kan和aadA等；第二種是植物選擇標(biāo)記，如nptII、Bar和hpt。盡管標(biāo)記基因應(yīng)用于遺傳轉(zhuǎn)化過程顯著提高了植物的轉(zhuǎn)化效率，但是由于大多數(shù)選擇標(biāo)記編碼抗生素或除草劑的基因，獲得轉(zhuǎn)基因植株后這些基因在植物基因組中的存在和表達(dá)就變得多余?；驑尳閷?dǎo)的共轉(zhuǎn)化可以去除植物選擇標(biāo)記，但是由于細(xì)菌選擇標(biāo)記與載體中的目標(biāo)基因緊密連接，因此不能去除細(xì)菌選擇標(biāo)記?；驑屴D(zhuǎn)化線性植物表達(dá)盒可以成功去除轉(zhuǎn)基因植物中的所有標(biāo)記基因[34-35]。因此，無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株通常利用基因槍介導(dǎo)或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化方法獲得。但是，無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株的獲得效率與篩選標(biāo)記基因整合的拷貝數(shù)密切相關(guān)，而一般情況下基因槍轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的拷貝數(shù)顯著高于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。所以，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化法是獲得無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株的最優(yōu)方法。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)改良的DMM能顯著提高大麥愈傷組織的分化能力；添加1.0 mg·L-1的IBA的SM1（無其他生長(zhǎng)素）的生根效果最佳；利用大麥品種Vlamingh建立了高效遺傳轉(zhuǎn)化體系且轉(zhuǎn)化效率可達(dá)10.14%，進(jìn)一步利用雙T-DNA的表達(dá)載體在T1代中通過自然分離成功獲得了無篩選標(biāo)記大麥轉(zhuǎn)基因植株。