管方念，龍黎，姚方杰，王昱琦，江千濤，康厚揚，蔣云峰，李偉，鄧梅，李豪，陳國躍

（1四川農業(yè)大學小麥研究所，成都 611130；2西南作物基因資源發(fā)掘與利用國家重點實驗室，成都 611130；3四川農業(yè)大學農學院，成都 611130）

0 引言

【研究意義】由條型柄銹菌（Puccinia striiformisWest. f. sp.tritici，Pst）引起的小麥條銹病是世界范圍內最重要的小麥病害之一，嚴重影響了小麥的產量和品質，在非洲、亞洲、大洋洲、歐洲、北美洲和南美洲等60多個國家分布流行和危害小麥生產[1-4]。中國的小麥產區(qū)是世界上最大且相對獨立的小麥條銹病流行區(qū)，且病害發(fā)生流行規(guī)律比其他國家更加復雜，該病害對中國西南、西北等地方的冬、春麥區(qū)危害最為嚴重[3,5-9]。2008年，中國植物病理學家分別在四川省和甘肅省等地分離得到同時對Yr24/Yr26和Yr10有毒性的新型毒力類型，該毒力類型對貴農22毒性穩(wěn)定，簡稱G22-9致病類型。此后連續(xù)多年相繼在云南省、陜西省、青海省、山西省、新疆維吾爾自治區(qū)、貴州省和西藏自治區(qū)等地方發(fā)現(xiàn)，并且頻率呈現(xiàn)逐年上升態(tài)勢，對中國的小麥生產構成了極大威脅[10-12]。2016年1月，經全國小麥銹病和白粉病研究協(xié)作組會商決定，將 G22-9致病類型正式命名為條中34號生理小種（CYR34）[13]。CYR34的出現(xiàn)及流行頻率的逐年增高，標志著中國小麥條銹菌群體結構繼Hybrid 46和水源11類群后又一次發(fā)生重大變異，使得中國小麥再次受到條銹病大流行的威脅。針對當前小麥生產上流行條銹病菌生理小種或毒力類型，鑒定一批新的抗性種質，發(fā)掘和聚合條銹病抗性新基因并轉育到當地品種（系），培育一系列抗病品種被認為是預防條銹病危害、確保小麥高產穩(wěn)產最為經濟環(huán)保和有效的手段[5-6]?！厩叭搜芯窟M展】地方品種，又稱農家品種、本地品種，是經過長期的人類干預和自然選擇后保存下來的作物遺傳資源，具備了對當地自然生態(tài)環(huán)境的較強適應性和與之相應的生產潛力，還可能潛藏著育成品種所缺乏的具有重要經濟價值的優(yōu)良基因[14-15]。與世界上大多數國家的品種相比，中國小麥農家品種具有早熟性、多粒性、高度適應性、高親和性、抗病蟲及抗逆等特點，因此受到小麥遺傳育種學家的高度重視。尤其在小麥條銹病抗性方面，從資源鑒定、抗性基因發(fā)掘到育種利用，對中國小麥農家品種展開了較為系統(tǒng)的研究。早在20世紀80年代，路端誼等[16]利用當時中國流行的條銹病優(yōu)勢生理小種條中1號、條中10號、條中17號、條中18號、條中19號和條中21號對757份中國小麥農家品種進行成株期抗病性鑒定，揭示了長江流域比黃河流域的農家品種抗性更好，且南方農家品種具有更強的抗銹性。近年來，隨著條銹菌新小種或新毒力類型的產生和發(fā)展速度加快，嚴重威脅著中國小麥生產安全[17]。鑒于此，近年來，中國小麥病理和遺傳學家利用表型鑒定并結合分子標記技術加快了對中國小麥農家品種較為系統(tǒng)的條銹病抗性評價與鑒定。孫建魯等[18]通過利用條銹菌單小種及混合小種對 100份小麥品種資源（包括 13份農家品種、27份引進種質和60份育成種質）進行苗期和成株期條銹病抗性鑒定，結果發(fā)現(xiàn)農家品種在苗期（61.54%）和成株期（76.92%）均表現(xiàn)出較大比例的抗性；已知Yr特異分子標記檢測表明農家品種中含未知Yr頻率較高，應加強利用。黃苗苗等[19]對 223份小麥農家品種進行了成株期條銹病抗性表型鑒定與評價，并利用6個已知Yr基因分子標記進行了檢測，共有50份農家種表現(xiàn)為成株期抗性，99份具有慢條銹病特性，這些農家種中可能攜帶Yr26、Yr9、Yr5、Yr10、Yr15和Yr18。王吐虹等[20]在 40份小麥農家品種中發(fā)現(xiàn)有 35份含有未知的抗條銹病基因，占87.5%，而且有較高的遺傳異質性。說明小麥農家品種中含有豐富的抗病基因?！颈狙芯壳腥朦c】黃淮海麥區(qū)作為中國條銹病菌的重要春季流行區(qū)，小麥條銹病也是該麥區(qū)最重要的病害，每年都有不同程度的發(fā)生[21]。新毒性生理小種CYR34的產生已引起黃淮海麥區(qū)大部分主栽抗性品種喪失抗性，為小麥條銹病防治工作帶來嚴峻挑戰(zhàn)。因此，明確該麥區(qū)小麥地方品種的抗性表現(xiàn)和可能攜帶的抗性基因，鑒定一批可直接用于小麥條銹病抗性育種的優(yōu)異種質并將其抗性基因/位點/區(qū)段轉育到小麥新品種（系）至關重要?！緮M解決的關鍵問題】本研究利用當前中國小麥生產上毒性強、流行頻率高的條銹菌生理小種和毒力類型對 152份來源于黃淮海麥區(qū)小麥農家品種進行抗性鑒定，并利用13個條銹病已知抗性基因緊密連鎖標記（或功能標記）進行分子檢測，為條銹病抗性育種提供材料基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試小麥農家品種：152份黃淮海麥區(qū)小麥農家品種，包括52份山東農家品種、45份河南農家品種、26份河北農家品種、15份陜西農家品種和14份江蘇農家品種，均由中國國家作物種質資源庫提供。已知條銹病抗性基因Yr9、Yr10、Yr18、Yr24/26、Yr30、Yr39、Yr48、Yr65和Yr67載體由美國華盛頓州立大學陳賢明教授提供。室內苗期條銹病鑒定對照銘賢 169由甘肅農業(yè)科學院植物保護研究所賈秋珍研究員提供。成株期條銹病鑒定誘發(fā)材料SY95-71及感病對照Avocet S由四川農業(yè)大學小麥研究所提供。

供試條銹病菌：采用 2個生理小種 CYR32和CYR34進行室內苗期條銹病抗性鑒定，單小種鑒定；采用由CYR32、CYR33、CYR34、水源4號和水源5號組成的混合菌種進行田間成株期條銹病鑒定。上述菌種均由甘肅農業(yè)科學院植物保護研究所賈秋珍研究員提供。

1.2 小麥條銹病抗性表型鑒定

1.2.1 室內苗期接種鑒定 苗期鑒定在甘肅農業(yè)科學院植物保護研究所溫室中完成。每份種質播種10—15粒，溫室培養(yǎng)至一葉一心期，采用涂抹法[22]分別接種條銹病菌CYR32和CYR34生理小種，放置于接種室黑暗低溫（10℃）保濕24 h后移至人工溫室（14—18℃，光照16 h/黑暗8 h）中培養(yǎng)，待對照品種銘賢169充分發(fā)病后按0—4級標準記載侵染型[23]，即0—2級為抗病，3—4級為感病。

1.2.2 田間人工誘發(fā)鑒定 2016—2017年和2018—2019年于小麥生產季分別在四川農業(yè)大學崇州試驗基地（30°33′N，103°39′E。2016CZ，2018CZ）和綿陽市農業(yè)科學院試驗站設置條銹病鑒定圃（31°23′N，104°49′E。2016MY）進行成株期條銹病抗性鑒定。采用人工接種法[24]，3個環(huán)境均采用同樣的田間播種設計：每份種植3行區(qū)、行長2.0 m，行距0.3 m，株距0.2 m，單粒點播，每間隔 20行設置一行感病對照Avocet S。為確保田間菌量充分，鑒定圃四周播種 2行區(qū)誘發(fā)材料SY95-71。每年1月中旬小麥分蘗中后期，通過涂抹法在誘發(fā)行小麥葉片接種混合小種，待3月下旬至4月中旬感病對照Avocet S充分發(fā)病后，調查病害的普遍率、嚴重度和侵染型[25]，每隔7 d調查1次，共調查3次。

1.2.3 分子標記檢測 采用改良的 CTAB法[26]提取152份黃淮海麥區(qū)小麥農家品種和Yr基因載體DNA。利用國內外現(xiàn)已開發(fā)的條銹病抗性基因Yr9、Yr10、Yr18、Yr24/26、Yr30、Yr36、Yr39、Yr41、Yr48、Yr65、Yr67、Yr80和Yr81等13個標記[27-39]對黃淮海麥區(qū)小麥農家品種進行PCR擴增，擴增產物經2.0%的瓊脂糖電泳或6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測后照相保存，并對Yr80和Yr81抗性基因的KASP標記進行熒光定量PCR擴增檢測。供檢測Yr基因分子標記的引物均由擎科生物技術有限公司合成（電子附表1）。

2 結果

2.1 黃淮海麥區(qū)小麥農家品種苗期抗條銹病的鑒定

分別采用當前小麥生產上條銹病流行生理小種CYR32和CYR34對供試152份黃淮海麥區(qū)小麥農家品種進行苗期抗性鑒定。在供試種質中，9份農家品種對CYR32具有苗期抗性，約占6%，其中，2份表現(xiàn)為免疫或近免疫。9份農家品種對CYR34表現(xiàn)苗期抗性，其中1份表現(xiàn)為免疫或近免疫（電子附表2）。對比分析發(fā)現(xiàn)，僅半截芒大白麥和白穗白2份種質對CYR32和CYR34同時表現(xiàn)苗期抗性。結果表明，黃淮海麥區(qū)小麥農家品種對中國當前小麥條銹病流行小種整體抗性水平較低。

2.2 黃淮海麥區(qū)小麥農家品種成株期抗條銹病鑒定

利用由CYR32、CYR33、CYR34、水源4號和水源5號組成的條銹菌混合生理小種進行人工誘發(fā)，在多環(huán)境下（2016CZ、2016MY和 2018CZ）對黃淮海麥區(qū)小麥農家品種進行成株期條銹病抗性鑒定。在2016MY鑒定圃中，62份種質在成株期具有抗性，占40.78%。在2016CZ鑒定圃中，57份在成株期表現(xiàn)抗性，占37.50%。在2018CZ鑒定圃中，60份種質具有成株期抗性，占39.47%。對比3個環(huán)境抗性鑒定結果，35份種質在3個環(huán)境均表現(xiàn)為穩(wěn)定的成株期抗性，占23.03%。其中，13份種質在成株期表現(xiàn)低侵染型、低嚴重度反應的高抗病性（IT=0—1、FDS＜20%）（電子附表2）。

2.3 黃淮海麥區(qū)抗條銹病小麥農家品種區(qū)域分布及綜合評價

結合苗期和成株期抗性結果，共鑒定出7份具有全生育期抗性（all stage resistance，ASR）農家品種。152份黃淮海麥區(qū)農家品種中，來自山東省的52份種質中，10份表現(xiàn)出成株期抗性（adult-plant resistance，APR），占19.23%，其中1份表現(xiàn)出全生育期抗性；來自河北省的26份種質中，僅紅禿頭表現(xiàn)出成株期抗性；來自陜西省的15份種質中，8份在成株期表現(xiàn)出抗性，占53.33%；來自江蘇省的14份種質中，4份表現(xiàn)出成株期抗性，占35.70%，其中1份表現(xiàn)出全生育期抗性；來自河南省的48份種質中，12份表現(xiàn)出成株期抗性，占35.41%，其中5份表現(xiàn)出全生育期抗性。

2.4 黃淮海麥區(qū)小麥農家品種條銹病抗性基因分子檢測

利用國內外學者開發(fā)的已知抗條銹病基因Yr9、Yr10、Yr18、Yr24/26、Yr30、Yr36、Yr39、Yr41、Yr48、Yr65、Yr67、Yr80和Yr81緊密連鎖的側翼標記或功能標記對 152份黃淮海麥區(qū)小麥農家品種進行分子檢測，分別以13個條銹病抗性基因載體作為陽性對照，得出在供試的黃淮海麥區(qū)小麥農家品種中，131份種質可能攜帶Yr18，2份可能攜帶Yr41，13份可能攜帶Yr48，57份種質可能攜帶Yr81；其中，2份種質可能同時攜帶Yr18和Yr41，8份可能同時攜帶Yr18和Yr48，49份材料同時攜帶Yr18和Yr81（圖1和圖2），7份同時攜帶Yr48和Yr81。供試材料中并未檢測到可能攜帶Yr9、Yr10、Yr24/26、Yr30、Yr36、Yr39、Yr65、Yr67和Yr80的種質；另外11份種質未檢測到上述檢測Yr基因。在9份表現(xiàn)苗期抗性和42份成株期穩(wěn)定抗性種質中，5份均未檢測到所有供試的13個Yr基因標記的存在，推測這些抗性種質可能攜帶了其他已知或未知小麥條銹病抗性基因（組合）。

3 討論

3.1 新毒性生理小種的產生對黃淮海麥區(qū)小麥條銹病防治的挑戰(zhàn)

圖1 黃淮海麥區(qū)部分材料Yr18連鎖標記csLV34檢測Fig. 1 Detection results of agarose gel by using the marker csLV34 linked to the stripe rust resistance gene Yr18 in part of wheat landraces from Huang-huai-hai

圖2 黃淮海麥區(qū)部分材料Yr81連鎖標記KASP_3077熒光定量PCR檢測Fig. 2 Detection results of Real-Time PCR by using the marker KASP_3077 linked to the stripe rust resistance gene Yr81 in part of wheat landraces from Huang-huai-hai

近年來，在條銹病常發(fā)易變區(qū)的四川省和甘肅省麥區(qū)，隨著條銹病新毒性菌系——貴農22致病類群，特別是貴農22致病類型9，簡稱G22-9致病類型（即CYR34）的出現(xiàn)及擴展，標志著中國小麥條銹菌群體結構又一次重大變化發(fā)生[13]。目前，以G22-9致病類型（CYR34）為代表的貴農 22致病類群在哺育寄主選擇壓力下已發(fā)展成為中國小麥生產上流行頻率最高的條銹病菌優(yōu)質類群，導致目前中國抗病育種中廣泛用作抗源的Yr10、Yr24/26和川麥42、南農92R系、貴農系和蘭天系品種喪失抗性，這預示著強毒性新小種CYR34在全國范圍流行的風險越來越高[40-41]。黃淮海麥區(qū)是中國小麥主產基地，也是中國條銹病重要的春季流行區(qū)，是保障中國糧食安全的小麥條銹病流行主要防控地區(qū)[10]。因此，了解該麥區(qū)農家品種的條銹病抗性遺傳背景及抗性基因分布，加快發(fā)掘抗病新基因及培育抗病新品種，是拓寬小麥抗性遺傳基礎及抗性育種的關鍵。

3.2 黃淮海麥區(qū)小麥地方品種攜帶Yr18和Yr81的狀況

利用緊密連鎖分子標記進行分子檢測并與抗譜分析、系譜分析在內的其他方法相結合是準確鑒定目標基因的重要手段[42]。Yr18是成株期抗性基因，來源于普通小麥，定位于7DS，其載體品種有Thatcher、Jupeteco 73R和Anza等，是公認的慢銹性基因，可能提供持久抗性，目前還沒有檢測到其有生理?；訹43]。前人研究證實，中國小麥農家品種中攜帶抗病基因Yr18占比較高。楊文雄等[44]對231份小麥種質進行條銹病抗性基因鑒定，發(fā)現(xiàn)僅有 6.1%育成品種攜帶Yr18，而85.1%的農家品種攜帶Yr18。白小軍等[45]對來自寧夏的小麥農家品種的條銹病抗性基因分布進行檢測發(fā)現(xiàn)，農家品種中攜帶Yr18的比例（90.9%）遠遠大于育成品種（7.7%）和引進品種（14.3%）。本研究利用Yr18的功能標記對黃淮海麥區(qū)小麥農家品種進行檢測也發(fā)現(xiàn)，131份種質（86.18%）攜帶該成株期條銹病抗性基因，進一步證實了Yr18在中國黃淮海麥區(qū)小麥農家品種中廣泛存在。已有研究表明在高病害壓力下Yr18單獨存在時其抗性表現(xiàn)不明顯，但結合 2—4個其他慢銹基因則可獲得高抗或近免疫抗性[46-47]。本研究42份攜帶Yr18的小麥農家品種在成株期表現(xiàn)出高抗條銹病，推測這些種質可能還攜帶對當前小麥生產中流行小種具有抗性的其他已知或未知基因及其組合。最近，澳大利亞學者通過對1份來自中國的小麥農家品種（Aus27430）條銹病抗性表型分析，發(fā)現(xiàn)該種質對澳大利亞條銹病流行生理小種在苗期表現(xiàn)為抗性，而在成株期則表現(xiàn)為中抗-中感反應。通過構建重組自交系遺傳作圖群體并結合小麥 90K SNP芯片和基于常規(guī)PCR分子標記技術，將該抗性基因定位在6A短臂上，并正式命名為Yr81[39]。本研究利用Yr81的特異KASP分子標記KASP_3077對152份黃淮海麥區(qū)農家品種進行分子檢測，發(fā)現(xiàn)其中有57份小麥農家品種可能攜帶該基因，證實Yr81普遍存在于中國小麥農家品種中。迄今為止，尚未有學者利用中國條銹病生理小種對Yr81進行毒性研究。本研究利用CYR32和CYR34對攜帶Yr81的小麥農家品種進行抗性表型分析發(fā)現(xiàn)，供試材料中攜帶了Yr81的農家種在苗期多表現(xiàn)為感病反應（IT=3—4）；利用混合小種進行成株期條銹病抗性表型鑒定發(fā)現(xiàn)，也多表現(xiàn)為感病。進一步分析發(fā)現(xiàn)，同時含有Yr18和Yr81的49份農家種中，9份成株期表現(xiàn)出良好抗性（DS=0—10%），2份材料表現(xiàn)出全生育期抗性（電子附表2），推測Yr18和Yr81的聚合可以顯著提高條銹病抗性，這與前人研究結果一致[46-47]。因此，可將Yr81與包括Yr18在內的其他條銹病抗性基因進行聚合在條銹病抗性育種中加以利用。另外，本研究利用條銹病混合菌種對供試材料在多環(huán)境下進行成株期抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)攜帶了相同抗性基因或基因組合，在不同鑒定環(huán)境下其抗感表型或抗性程度不盡相同，可能與環(huán)境條件、鑒定的時期等有關。因此，為進一步精準鑒定供試農家種對當前我國小麥生產上條銹病主要流行小種或致病類群的抗性反應，利用單一小種或致病類群在可控環(huán)境（室內）對供試農家種進行成株期條銹病抗性鑒定將是我們下一步的工作重點。

3.3 黃淮海麥區(qū)小麥地方品種攜帶未知基因的抗性材料

3個小麥成株期條銹病抗性基因Yr30、Yr36和Yr39，分別來源于墨西哥品系 RL6077[31]、野生二粒小麥 RSL65[32]和美國春小麥品種 Alpowa[33]。通過遺傳作圖和分子標記，分別將它們定位小麥染色體3BS、6BS和7BL上。本研究利用其緊密連鎖標記對黃淮海麥區(qū)農家品種進行分子檢測發(fā)現(xiàn)，該麥區(qū)的所有供試小麥農家品種均未檢測到這個 3個抗病基因的存在。近年來，隨著新的強毒性條銹病生理小種的出現(xiàn)并流行，從農家品種中發(fā)掘新的有效抗性基因并培育條銹病抗性新品種已成為共識，從小麥農家品種中發(fā)掘新的條銹病抗性基因已成為關注的熱點。系譜分析發(fā)現(xiàn)，最近報道的4個正式命名的小麥條銹病新基因Yr79、Yr80、Yr81和Yr82均來自不同國家的農家品種[38-39,48-49]，證實小麥農家品種中攜帶豐富的可用條銹病抗性基因，是小麥條銹病抗性育種的有效基因源。黃淮海麥區(qū)是中國小麥主產基地，也是中國條銹病重要的春季流行區(qū)，是保障中國糧食安全的小麥條銹病流行主要防控地區(qū)。因此，了解該麥區(qū)的條銹病抗性遺傳背景及抗性基因分布，已成為防控條銹病危害的基礎性工作。本研究利用小麥生產上流行的強毒性生理小種CYR32和CYR34對152份來自黃淮海麥區(qū)小麥農家品種進行條銹病抗性鑒定，并結合Yr基因進行分子檢測發(fā)現(xiàn)，42份具有成株期穩(wěn)定抗性的小麥農家品種中，4份種質（爪子牙、蚰子頭、石島三棵和白蚰子）未檢測到其攜帶所有供試已知抗性基因；9份具有苗期抗性的小麥農家品種中，1份種質（白芒白）未檢測到其攜帶所有供試已知抗性基因，說明這些小麥農家品種可能攜帶對當前小麥生產中流行小種具有抗性的其他已知或未知基因及其組合，是在小麥條銹病持久抗性育種中可進一步利用的新抗源。

4 結論

黃淮海麥區(qū)小麥農家品種對當前中國流行的條銹病毒性小種或毒力類群主要表現(xiàn)為成株期抗性，其抗性受多個微效成株期抗性基因控制；該麥區(qū)小麥農家品種主要攜帶Yr18和Yr81；在9份表現(xiàn)苗期抗性和42份成株期穩(wěn)定抗性種質中，共有5份種質未檢測到其攜帶所有供試已知抗性基因，推測這些抗性種質可能攜帶了對當前小麥生產中流行小種具有抗性的其他已知或未知小麥條銹病抗性基因（組合），是進一步發(fā)掘抗條銹病基因并轉育到當前小麥新品種（系）中的重要基因源。