程武松 陳洪波 游玉峰

近年來，多功能超聲分子對比劑的研究發(fā)展迅速，因其可攜帶針對腫瘤位點的分子探針及藥物對腫瘤進行精準定位、靶向釋藥，提高病灶局部的藥物濃度，實現(xiàn)多種模式下的成像，如超聲、CT、MRI、PET 等，為解決腫瘤早期顯像、靶向治療及腫瘤耐藥等關鍵問題提供了新的思路。本實驗擬制備一種載羥基喜樹堿（10-HCPT）化療藥物的高分子納米粒，其內包裹液態(tài)氟碳（PFOB），同時表面連接cRGD 肽，靶向人卵巢癌SKOV-3 細胞，旨在探討納米分子探針的體外靶向性及超聲/CT 雙模態(tài)成像效果，為卵巢癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷及精準治療探索一種新的方法。

材料與方法

一、主要實驗試劑

羧基端乳酸/羥基乙酸共聚物（PLGA-COOH，分子量為12 000，聚合比50∶50，濟南岱罡生物工程有限公司）；全氟溴辛烷（PFOB，日本TCI 公司）；10-HCPT（成都蘭貝植化科技有限公司）；綠色熒光染料（FITC）標記環(huán)八肽cRGD（中國強耀生物有限公司）；EDC/NHS、DiI、DAPI染色劑（美國Sigma公司）；MES緩沖液（美國Sigma 公司）；二氯甲烷（成都市科隆化學品有限公司）；聚乙二醇（PVA，美國Sigma 公司）；異丙醇（重慶川東化工有限公司）；人卵巢癌SKOV-3 細胞株（武漢普諾賽生命科技有限公司細胞庫）；磷酸緩沖鹽溶液（PBS，重慶惠利生物科技有限責任公司）。

二、主要實驗儀器

光學顯微鏡（IX71，日本Olympus 公司）；透射電子顯微鏡（H 7600，日本日立公司）；掃描電子顯微鏡（JEOLEM 7800 F，日本JEOL 公司）；共聚焦顯微鏡（A1R，日本Nikon 公司）；流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特公司）；馬爾文粒徑分析儀（Zeta Sizer 3000，英國Malvern 有限公司）；紫外分光光度計（UV 2550，日本Shimadzu 公司）；聲振儀（美國Sonics Materials 公司）；百勝MyLab 90 彩色多普勒超聲診斷儀，LA523 線陣探頭，頻率4～10 MHz；CT 成像系統(tǒng)（荷蘭Philips 公司）；DFY 型超聲圖像定量分析診斷儀（重慶醫(yī)科大學超聲影像學研究所）。

三、實驗方法

1.PLGA@10-HCPT-PFOB 非靶向納米粒的制備：采用乳化法稱取PLGA-COOH 100 mg、10-HCPT 4 mg置于50 ml 離心管，加入2 ml 二氯甲烷和2 ml 甲醇（分散相），常溫震蕩至完全溶解，然后置于超聲波清洗儀中充分混均，加入200 μl PFOB 再次震蕩混勻。在冰浴條件下聲振儀聲振6 min（100 W，間歇5 s 模式），加入10 ml 4%PVA 溶液（連續(xù)相）在旋渦器中震蕩數秒，聲振儀聲振4 min（60 W，間歇5 s 模式），加入2%異丙醇溶液10 ml，將上述溶液移至放有磁珠的50 ml 燒杯中，室溫下攪拌4 h，使二氯甲烷及甲醇充分揮發(fā)，經去離子水離心、洗滌3 次（8000 r/min，8 min），獲得PLGA@10-HCPT-PFOB 非靶向納米粒。制備過程中全程避光，在制備上述納米粒時加入DiI 熒光標記物，制備非靶向熒光標記的載藥納米粒。使用上述相同方法制備PLGA@10-HCPT和PLGA@PFOB納米粒。

2.cRGD-PLGA@10-HCPT-PFOB靶向納米粒的制備：通過碳二亞胺法連接cRGD肽，將PLGA@10-HCPTPFOB 納米粒分散溶解于適量MES 緩沖液（0.1 mol/L，pH 值5.5），以EDC與NHS質量比1∶3、PLGA 與EDC摩爾比1∶10先后加入零長度偶聯(lián)活化劑EDC/NHS，冰浴條件下震蕩孵育40 min，多次洗滌、離心后復溶于MES緩沖液（0.1 mol/L，pH 值8.0）；加入一定量cRGD 肽（cRGD 與PLGA 摩爾比為1∶1），冰浴條件下震蕩孵育過夜；多次離心、洗滌，獲得靶向納米粒cRGD-PLGA@10-HCPT-PFOB，溶于2 ml去離子水中，4℃保存。

3.cRGD-PLGA@10-HCPT-PFOB 靶向納米粒的表征觀察：使用光學顯微鏡、掃描電子顯微鏡及透射電子顯微鏡觀察靶向載藥納米粒的大小及分布情況；將稀釋后的納米?；鞈乙褐糜诠杵稍镞^夜，使用掃描電子顯微鏡觀察納米粒的外部形態(tài)；將樣品滴于銅網上，自然干燥成膜，使用透射電子顯微鏡觀察靶向納米粒的內部結構；馬爾文粒徑分析儀測量cRGD-PLGA@10-HCPT-PFOB納米粒的粒徑大小和表面電位。

4.cRGD 肽與納米粒連接情況的檢測：制備靶向納米粒時加入DiI 熒光標記物獲得紅色熒光標記的靶向納米粒，使用共聚焦顯微鏡檢測紅色熒光染料標記的納米粒與FITC 標記的cRGD 的連接情況；流式細胞儀測 量PLGA@10-HCPT-PFOB、cRGD-PLGA@10-HCPT-PFOB納米粒FITC熒光強度。

5.10-HCPT 包封率和載藥量測定：配置不同濃度的10-HCPT 溶液，以紫外分光光度計測量其吸光度并繪制標準曲線，通過標準曲線計算包封率和載藥量。

6.體外評估cRGD-PLGA@10-HCPT-PFOB 納米粒的靶向性：體外培養(yǎng)人卵巢癌SKOV-3 細胞，取對數生長期細胞，以每孔1×105的密度接種于共聚焦培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h，分為靶向納米粒組、非靶向納米粒組及拮抗組，納米粒濃度均為1 mg/ml。靶向納米粒組：每個培養(yǎng)皿加入1 ml 經DiI 染色標記的靶向納米粒；非靶向納米粒組：每個培養(yǎng)皿加入1 ml 經DiI 染色的非靶向納米粒；拮抗組：每個培養(yǎng)皿加入足量游離cRGD 肽后，再加入1 ml 經DiI 染色標記的靶向納米粒，將3 組納米粒與SKOV-3 細胞在37℃孵箱內分別孵育1 h、2 h、4 h，用4%多聚甲醛1 ml 固定15 min，PBS 沖洗3次，加入DAPI 染色劑對細胞核進行染色。15 min 后PBS 沖洗3次，于共聚焦顯微鏡下觀察3 組納米粒與細胞的結合情況。在上述共聚焦培養(yǎng)皿中加入0.25%胰酶對細胞消化后收集到15 ml 的EP 管中，低溫離心機離心5 min（1000 r/min）。使用PBS 將離心后的細胞稀釋至500 μl，使細胞懸浮于其中送流式細胞儀檢測DiI 的熒光強度。

7.體外超聲及CT 成像：①體外超聲成像。將cRGD-PLGA@10-HCPT-PFOB靶向納米粒配制成濃度為100.00 mg/ml、75.00 mg/ml、50.00 mg/ml、25.00 mg/ml、12.50 mg/ml、6.25 mg/ml的溶液（實驗組），各取200 μl加入SKOV-3細胞懸浮液中，然后將其置于瓊脂凝膠模型中，以PBS為對照組，觀察各組二維超聲圖像。②體外CT成像。將cRGD-PLGA@10-HCPT-PFOB 靶向納米粒配制成濃度為100.00 mg/ml、75.00 mg/ml、50.00 mg/ml、25.00 mg/ml、12.50 mg/ml、6.25 mg/ml 的溶液（實驗組），各取200 μl 置于EP 管中，以PBS 為對照組，在CT成像系統(tǒng)中成像，并利用自帶軟件測量各組納米粒的CT 值。

四、統(tǒng)計學處理

應用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以±s 表示，不同濃度納米粒實驗組和對照組的聲強值及CT值比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、cRGD-PLGA@10-HCPT-PFOB 靶向納米粒的表征

靶向納米粒外觀呈黃色混懸液，穩(wěn)定性好；光學顯微鏡下形態(tài)規(guī)則、大小均一（圖1A）；掃描電鏡下納米粒外觀呈球形，表面光滑（圖1B）；透射電鏡下納米粒呈核殼結構（圖1C）；其平均粒徑為（322.03±5.34）nm，平均表面電位為（-1.55±0.10）mV。

二、cRGD 肽與PLGA@10-HCPT-PFOB 非靶向納米粒的連接情況

共聚焦顯微鏡下FITC 標記的cRGD 肽呈綠色熒光（圖2A），DiI染色標記的納米粒呈紅色熒光（圖2B），兩者融合呈橙黃色熒光（圖2C）；流式細胞儀檢測PLGA@10-HCPT-PFOB 非靶向納米粒FITC 綠色熒光強度為0.78%，cRGD-PLGA@10-HCPT-PFOB 靶向納米粒FITC綠色熒光強度為80.76%。

圖1 cRGD-PLGA@10-HCPT-PFOB靶向納米粒的表征

圖2 共聚焦顯微鏡下cRGD肽與PLGA@10-HCPT-PFOB非靶向納米粒的連接情況（×400）

三、10-HCPT的包封率和載藥量測定

繪制10-HCPT標準曲線，在波長為268 nm、372 nm處出現(xiàn)吸收峰，將波長設定在372 nm，10-HCPT 的包封率為（81.34±2.28）%，載藥量為（13.24±1.24）%。

四、納米粒的體外靶向性

納米粒經DiI 染色后呈紅色熒光，SKOV-3 細胞核經DAPI 染色后呈藍色熒光。靶向納米粒組顯示SKOV-3 細胞周圍見大量紅色熒光，即經過DiI染色后的納米粒被SKOV-3 細胞靶向結合并吞噬；而非靶向納米粒組和拮抗組僅見少量紅色熒光與細胞結合，熒光強度明顯低于靶向納米粒組，且隨著孵育時間的延長，靶向納米粒組熒光強度增強更明顯（圖3）。流式細胞儀檢測示靶向納米粒組DiI 熒光強度明顯高于非靶向組和拮抗組，且隨著孵育時間的延長，靶向納米粒組DiI熒光強度明顯增強，而非靶向納米粒組和拮抗組隨著孵育時間的延長熒光強度無明顯變化（表1）。

圖3 共聚焦顯微鏡下靶向納米粒組（A）、非靶向納米粒組（B）及拮抗組（C）不同孵育時間的連靶情況（×400）

表1 流式細胞儀檢測各組不同孵育時間人卵巢癌SKOV-3細胞DiI的熒光強度

五、cRGD-PLGA@10-HCPT-PFOB 靶向納米粒的體外超聲/CT成像

隨著靶向納米粒濃度增加，實驗組二維超聲圖像聲強值均逐漸增強，對照組的回聲均低于不同濃度納米粒實驗組（圖4）。6.25 mg/ml、12.50 mg/ml、25.00 mg/ml、50.00 mg/ml、100.00 mg/ml 的靶向納米粒聲強分別為（6.28±0.12）dB、（11.36±0.21）dB、（17.21±0.16）dB、（28.64±0.28）dB、（58.26±0.19）dB，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），不同濃度靶向納米粒各實驗組聲強值均高于對照組（均P<0.05），且各實驗組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。

隨著靶向納米粒濃度增加，實驗組CT 成像的CT值均逐漸增強，對照組的CT值均低于不同濃度納米粒各實驗組（圖4）。6.25 mg/ml、12.5 mg/ml、25.00 mg/ml、50.00 mg/ml、100.00 mg/ml 的 納 米 粒CT 值 分 別 為（42.16±2.16）Hu、（73.27±3.23）Hu、（100.20±1.98）Hu、（135.87±3.12）Hu、（217.53±2.29）Hu，對照組CT 值為（3.23±0.24）Hu，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），不同濃度納米粒各實驗組CT值均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05），且各實驗組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。

圖4 靶向納米粒的體外超聲和CT成像圖

討 論

多模態(tài)多功能超聲造影劑的制備已成為當前腫瘤診療一體化的研究熱點，以超聲成像優(yōu)勢為基礎，聯(lián)合CT、MRI、PET 及光學等成像優(yōu)勢，可準確獲取病變部位的醫(yī)學生物學信息，在醫(yī)學可視化成像下實現(xiàn)局部靶向釋藥［1］。雖然目前診療一體化造影劑的研究取得了新的進展，但向臨床轉化仍存在很多亟需解決的問題［2］。因此，提高納米粒的靶向性是診療一體化造影劑的基礎，在此基礎上可實現(xiàn)多模態(tài)成像下不同治療方式的聯(lián)合治療。本實驗選擇靶向效率相對較高的主動靶向性，采用臨床常見的超聲和CT成像模式在PFOB 改善腫瘤缺氧微環(huán)境下進行化學治療，實現(xiàn)高效的診療一體化造影劑的制備。

研究［3］表明，整合素αvβ3 在卵巢癌新生血管內皮細胞和腫瘤細胞上均呈高表達，而在正常血管內皮細胞和組織中無表達或呈極低表達。因此，整合素αvβ3是人卵巢癌SKOV-3 細胞理想的靶點之一。cRGD 肽是一種能夠與整合素αvβ3 受體特異性結合的環(huán)狀八肽［4］。本實驗通過碳二亞胺法將cRGD 肽的氨基與PLGA 的羧基通過穩(wěn)定的肽鍵相連，在共聚焦顯微鏡下觀察標記綠色熒光的cRGD 肽與標記紅色的PLGA納米粒兩者融合為橙黃色，流式細胞儀測定PLGA@10-HCPT-PFOB 非靶向納米粒表面cRGD 肽連接率達80.76%，表明cRGD 肽成功連接到PLGA@10-HCPTPFOB 非靶向納米粒表面。在體外靶向實驗中，共聚焦顯微鏡下靶向納米粒組有大量cRGD-PLGA@10-HCPT-PFOB 靶向納米粒被卵巢癌SKOV-3 細胞識別并攝取，即使經過PBS 反復沖洗，仍可緊密結合，紅色熒光強度明顯高于非靶向納米粒組和拮抗組，且隨著孵育時間的延長，熒光強度增強。流式細胞儀也得出類似結果，表明人卵巢癌SKOV-3 細胞對cRGDPLGA-10-HCPT-PFOB 靶向納米粒有較高的靶向結合能力。

應用高分子聚合物制備的納米粒外殼抗壓性強，在較高機械指數下仍然很穩(wěn)定，延長了血液循環(huán)時間［5］。使用PLGA-COOH 制備的納米粒通過穩(wěn)定的化學鍵與其特異性配體（如抗體、肽類等）連接，形成具有主動靶向能力的納米粒。本實驗通過碳二亞胺法將cRGD 肽側鏈的上氨基與PLGA-COOH 羧基形成穩(wěn)定的肽鍵，從而使納米粒具有靶向性。PFOB 是全氟化碳化合物中的一種，其化學性質穩(wěn)定，具有良好的攜氧能力，故其在新型造影劑、靶向藥物載體、臨床治療等領域已廣泛應用［6-8］。由于PFOB 的沸點較高，不易發(fā)生相變，其實現(xiàn)超聲分子成像的原理主要通過聚集顯影，當納米粒在病灶處大量聚集時，靶區(qū)會產生明顯增強的回聲信號，信噪比提高［9］。在本實驗體外實驗中，靶向納米粒加入人卵巢癌SKOV-3 細胞混懸液后，通過聚集顯影明顯增強超聲成像。也有研究［10-11］證實，PFOB 不僅可作為超聲造影劑，還能作為CT/MRI造影劑，從而實現(xiàn)多模態(tài)成像。本實驗發(fā)現(xiàn)隨著納米粒濃度的增加，其CT 值不斷增強，進一步證明了PFOB 被包裹于納米粒中。實體腫瘤微環(huán)境往往處于缺氧狀態(tài)，被認為是限制腫瘤治療效果的重要原因之一［12］。Zhang 等［7］研究團隊成功制備PFOB@LIPIR780 納米粒，不僅能增強CT 成像，還能利用PFOB 良好的攜氧能力改善腫瘤缺氧微環(huán)境，從而提高IR780的光動治療和光熱治療的療效。Song 等［12］制備的PFOB 納米粒在超聲作用下促進PFOB 攜載氧氣的釋放，改善了腫瘤的缺氧環(huán)境，增強了放射治療和光動力治療效果。Huang 等［13］研究認為，通過增加局部氧供能夠有效緩解腫瘤組織缺氧，提高化療藥物的療效，有助于減輕缺氧誘導相關的化療藥物耐藥。因此，在納米粒中引入PFOB不僅增強了多模態(tài)成像，還可以改善腫瘤缺氧的微環(huán)境，從而提高抗腫瘤治療效果。

本實驗選擇的廣譜抗腫瘤化療藥物10-HCPT 作用機制是通過抑制拓撲異構酶Ⅰ，抑制腫瘤細胞DNA的復制［14］，但其半衰期短、細胞毒性大、羥基內酯環(huán)結構不穩(wěn)定，臨床應用受限［15］。但是，10-HCPT 可被包裹于高分子PFOB 納米粒中，且單次注射量遠低于其他抗腫瘤化療藥物，增加了靶向釋藥的可控性和安全性［16］。PLGA 包裹10-HCPT 后能夠保護其內酯環(huán)結構，從而提高藥物活性［17］。本實驗將10-HCPT成功地攜載于PFOB 納米粒中，藥物包封率較高，為（81.34±2.28）%，既克服了10-HCPT 自身穩(wěn)定性和水溶性差、毒副作用大、半衰期短等缺點，又解決了載藥納米粒靶向治療中劑量限制的問題。

綜上所述，本實驗成功制備cRGD-PLGA@10-HCPT-PFOB 靶向納米粒，其形態(tài)規(guī)則，大小為納米級，能夠穿過腫瘤血管內皮細胞間隙，且具有較高的10-HCPT 包封率和載藥量；在體外尋靶實驗中，該靶向納米粒對人卵巢癌SKOV-3 細胞具有良好的主動靶向性，可增強超聲/CT 雙模態(tài)成像。但本實驗未評價該納米粒的體外安全性和治療作用，本課題組后期將進一步行相關實驗以為體內可視化治療提供理論依據。