李心亮　李柯　劉月平　杜青　李若存

〔摘要〕 目的 研究生石膏和煅石膏對急性軟組織損傷大鼠模型水通道蛋白AQP1、AQP3表達的影響，對石膏消腫的作用機制進行初步研究。方法 采用砝碼自由落體運動制備急性軟組織損傷大鼠模型，造模成功后將動物隨機分為模型組，陽性藥組（雙氯芬酸0.75 g/kg），煅石膏高、中、低劑量組（1.0、0.5、0.25 g/kg）、生石膏高、中、低劑量組（1.0、0.5、0.25 g/kg），另設(shè)空白對照組，每組10只。除模型組與空白對照組外，其余各組均給予相應(yīng)藥物，每天換藥1次，連續(xù)7 d。采用Western blotting和免疫組化法檢測各組大鼠損傷組織中AQP1/AQP3表達變化。結(jié)果 與空白對照組比較，模型組大鼠損傷骨骼肌中AQP1/AQP3表達明顯下降（P<0.01）;與模型組比較，煅石膏高、中、低劑量組和陽性藥組大鼠損傷骨骼肌中AQP1/AQP3表達明顯增加（P<0.01），生石膏組無明顯差異。結(jié)論 石膏煅制后可能通過調(diào)節(jié)急性軟組織損傷模型骨骼肌中AQP1/AQP3的表達從而發(fā)揮消腫的作用。

〔關(guān)鍵詞〕 急性軟組織損傷;煅石膏;生石膏;AQP1;AQP3

〔中圖分類號〕R285.5;R648? ? ? ?〔文獻標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.01.003

〔Abstract〕 Objective To explore the effects of raw Gypsum Fibrosum and calcined Gypsum Fibrosum on Aquaporin AQP1 and AQP3 expression in acute soft tissue injury rats， and to preliminarily explore the swelling alleviating mechanism of Gypsum Fibrosum. Methods Acute soft tissue injury rat model was prepared by free-fall weight. After successful modeling， animals were randomly divided into a model group， a positive drug group （Diclofenac 0.75 g/kg）， a calcined Gypsum Fibrosum high， medium and low dose group （1.0， 0.5， 0.25 g/kg）， a raw Gypsum Fibrosum high， medium and low dose group （1.0， 0.5， 0.25 g/kg）. Another blank control group was set， with 10 rats in each group. In addition to the model group and the blank control group， the other groups were given corresponding drugs， dressing once a day for 7 days. Western blotting and immunohistochemistry were used to detect the expression changes of AQP1/AQP3 in the rats injured tissue of each group. Results Compared with the blank control group， the expression of AQP1/AQP3 in skeletal muscle of model rats decreased significantly （P<0.01）. Compared with the model group， the expression of AQP1/AQP3 in injured skeletal muscle of calcined Gypsum Fibrosum high， medium and low dose groups and positive drug group rats were significantly increased （P<0.01）， and there was no significant difference in the raw Gypsum Fibrosum group. Conclusion Calcined Gypsum Fibrosum may play a role in eliminating swelling by regulating the expression of AQP1/AQP3 in skeletal muscle of acute soft tissue injury model.

〔Keywords〕 acute soft tissue injury; calcined Gypsum Fibrosum; raw Gypsum Fibrosum; AQP1; AQP3

急性軟組織損傷是指機體在遭受外力下引發(fā)的皮下、肌肉組織或韌帶等局部毛細管破裂出血和細胞內(nèi)液滲透的運動系統(tǒng)常見疾病[1]。臨床主要表現(xiàn)為損傷處局部腫脹、疼痛、瘀斑等，嚴重影響了患者身心健康。中藥外敷治療急性軟組織損傷歷史悠久，且療效顯著。石膏在臨床上生、煅兼用，功效各異，但其緩解創(chuàng)傷性軟組織腫脹的具體作用機理尚未明確。骨骼肌富含水分，約占整體的76%，水的代謝對于骨骼肌正常生理功能的維持具有重要作用[2]?，F(xiàn)代研究證明，水分子的跨膜運輸主要是通過膜上一類水通道蛋白（Aquaporins， AQPs）進行[3]。AQPs家族中，AQP1是體內(nèi)分布最廣泛的水通道蛋白，并高度表達于骨骼肌微血管內(nèi)皮細胞上，AQP3作為水甘油通道部分在骨骼肌上表達，與組織和細胞的水平衡及調(diào)節(jié)有著密切關(guān)系[4]。石膏的消腫作用是否與調(diào)節(jié)AQP1/AQP3的表達相關(guān)有待進一步探討?；诖耍緦嶒炌ㄟ^研究急性軟組織損傷后骨骼肌中AQP1/AQP3的變化，探討石膏發(fā)揮消腫作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

健康雄性SD大鼠，SPF級，體質(zhì)量180～220 g，90只，雌雄各半，購自湖南長沙斯萊克景達動物實驗公司。在光/暗周期為12 h/12 h（光照時間7：00-19：00），溫度為18～22 ℃的條件下飼養(yǎng)于籠中，自由獲得飼料和飲水。實驗動物許可證：SYKX（湘）2015-0008，動物合格證號：43006700010860 。

1.2? 藥物與試劑

煅石膏用大豆油（煅石膏66%∶大豆油34%）配制，由湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所課題組提供，生產(chǎn)批號：20151026;生石膏用大豆油（生石膏66%∶大豆油34%）配制，由湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所制劑室提供，批號：20151026;雙氯芬酸，北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：20 g/支，批號：X4447;AQP1一抗，美國RD公司，批號：154131;AQP3一抗，美國RD公司，批號：150925;山羊抗鼠lgG二抗，賽默飛世爾，批號：150725。

1.3? 主要儀器

正置熒光顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)（Cail Zeiss），垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽（美國Bio-Rad公司），核酸蛋白濃度測定儀（BioDrop），WD-9405B型水平搖床（沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司），Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂）。

1.4? 造模

參考文獻[5]的方法建立急性軟組織損傷大鼠模型，取SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，采用10%硫化鈉溶液脫除大鼠小腿部鼠毛，將大鼠固定于動物臺上，用自制質(zhì)量為160 g的撞擊器，固定高度，撞擊大鼠小腿中部外側(cè)，連續(xù)打擊7次，接觸面直徑0.8 cm，造成打擊處腫脹，皮下瘀血，局部軟組織挫傷;其中，打擊處皮膚無破損，手觸無骨折，無其他異常者視為造模成功。

1.5? 分組及干預(yù)

造模成功后將動物隨機分為模型組，陽性藥組（雙氯芬酸0.75 g/kg）、煅石膏高、中、低劑量組（1.0、0.5、0.25 g/kg）、生石膏高、中、低劑量組（1.0、0.5、0.25 g/kg），另設(shè)空白對照組，每組10只。模型組與空白對照組不作處理，其余各組在受創(chuàng)部位經(jīng)皮膚給予相應(yīng)的藥物，每天換藥1次，連續(xù)給藥7 d。

1.6? 樣本采集

實驗結(jié)束后，各組大鼠禁食不禁水24 h，采用10%水合氯醛（0.3 mL/kg）麻醉動物，剪取損傷部位肌肉組織約1 g，放入生理鹽水中清洗掉表面血跡后，立即剪取一半組織放入凍存管中，放入液氮速凍，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?剩余組織放入4%的多聚甲醛溶液中固定保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7? Western-blotting實驗

將50 mg肌肉組織放入研缽中，加入液氮不斷研磨成粉狀，然后將粉末置入1 mL的組織裂解液中，混勻后置于冰上裂解30 min，離心（10 000 r/min、4 ℃、5 min）。取上清液，BCA法測蛋白濃度。配制10%SDS-PAGE凝膠，濃縮膠5%，取50 μg蛋白質(zhì)樣品，加入等體積上樣緩沖液中，100 ℃沸水中煮5 min，上樣，電泳85 V、30 min，待染料前沿進入分離膠后，130 V約1.5 h。濕轉(zhuǎn)100 V、70 min;封閉2 h，TBS-T漂洗2次，加入一抗，4 ℃下反應(yīng)過夜，TBS-T漂洗10 min×3次，加入二抗，室溫下孵育60 min，TBS-T漂洗10 min×3次，最后經(jīng)ECL發(fā)光液顯影。采用凝膠成像分析軟件分析，Image J軟件掃描圖片得出各蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，進行半定量分析。

1.8? 免疫組化實驗

取出保存在4%的多聚甲醛液中的樣本，分別石蠟包埋，制成5 μm的切片;脫蠟至水，沖洗，滴加封閉液，37 ℃孵育30 min，去除多余的液體;加一抗4 ℃過夜，PBST漂洗3次，每次5 min;再加入二抗，37 ℃濕盒避光孵育30 min，脫水封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察每張玻片上3個不重復(fù)視野中AQP1和AQP3的陽性細胞（陽性細胞為棕褐色），采用ZEISS圖像分析軟件計算各組免疫陽性細胞的數(shù)量。

1.9? 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料采用“x±s”表示，多組間比較方差分析采用單因素分析。組間比較采用t檢驗。若P<0.05

表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? Western-blotting檢測

與空白對照組比較，模型組大鼠肌肉組織中水通道蛋白AQP1、AQP3表達均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，陽性藥組、煅石膏高、中、低劑量組大鼠肌肉組織中水通道蛋白AQP1、AQP3表達均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;生石膏高、中、低劑量組大鼠肌肉組織中AQP1、AQP3的表達均無明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表1，圖1-2。

2.2? 免疫組化檢測

與空白對照組比較，模型組大鼠AQP1及AQP3的表達明顯減少;與模型組比較，煅石膏高、中、低劑量組大鼠AQP1及AQP3的表達均顯著升高差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），生石膏高、中、低劑量組大鼠肌肉組織中AQP1、AQP3的表達均無明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表2，圖3-4。

3 討論

急性軟組織損傷是臨床上常見的多發(fā)病，嚴重影響著我國約20%以上成年人、50%以上老年人的生活質(zhì)量[6]。因此，明確急性軟組織損傷的分子機制，可以更好的為臨床應(yīng)用提供用藥依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，損傷處腫脹多因局部組織細胞等被破壞，瘀血停滯互結(jié)，血流不暢、微循環(huán)紊亂所致。中醫(yī)臨床常采用局部外用藥，可降低藥物的毒副作用，并通過維持皮膚表面相對穩(wěn)定的血藥濃度，延長藥物作用時間而發(fā)揮顯著療效[7]。石膏是中醫(yī)臨床最為常用礦物藥之一，生品因其清熱瀉火、除煩止渴之功，多用于熱病氣分證，而煅制后性寒微弱，清熱之力減弱，收濕生肌作用增強。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，石膏煅制后能夠明顯的改善急性軟組織損傷模型大鼠證候積分，發(fā)揮明顯的抗炎消腫作用[8]。煅石膏除常用于外治潰瘍不斂，濕疹瘙癢，水火燙傷，外傷出血外，外敷治療跌打損傷引起的紅、腫、熱、痛，作為醫(yī)院制劑已在多家醫(yī)院生產(chǎn)使用[9-12]。中醫(yī)學(xué)認為“濕”就是由于水分不能暢通而滯留在組織所引起的病癥，煅石膏能治療軟組織損傷的腫脹，是因其有收濕的作用，收濕作用可能為煅石膏的物理性質(zhì)，因石膏煅后極易吸水。但這一推測并不能完全說明煅石膏的作用機制[13]。

AQPs是屬于水或溶質(zhì)通道家族的一類蛋白，廣泛表達于上皮和內(nèi)皮以及其他類型細胞如表皮、脂肪細胞和骨骼肌中，可以促進滲透細胞質(zhì)膜的水分運輸，從而響應(yīng)滲透梯度[14]。其中，AQP1是AQPs家族中最早被鑒定出來的水通道蛋白，以三維結(jié)構(gòu)四聚體形式選擇性分布在上皮及內(nèi)皮細胞中，維持液體平衡及協(xié)同水跨膜轉(zhuǎn)運[15]。文獻報道，AQP1在心肌水腫和缺血-再灌注損傷中起了重要的作用[15];并參與了大鼠骨骼肌內(nèi)液平衡及水代謝[16]。AQP1還代表了微血管壁整個通過細胞間的10%～45%的液體滲透性，與血管的滲透性密切相關(guān)[17]。AQP3是皮膚中基底表皮細胞質(zhì)膜強烈表達的水-甘油轉(zhuǎn)運蛋白，在骨骼肌中位于細胞膜的表面，對于細胞正常生理狀態(tài)的維持有著重要意義，其可促進皮膚水化，參與傷口愈合期間的細胞遷移[18];AQP3敲除小鼠的研究同樣顯示，AQP3促進水和甘油轉(zhuǎn)運以及損傷后傷口愈合[19]。急性軟組織損傷后，局部代謝微環(huán)境的改變，可能存在酸性代謝產(chǎn)物的堆積、滲透壓的變化、微循環(huán)障礙，從而導(dǎo)致細胞腫脹，影響AQP1和AQP-3的表達。AQP1和AQP-3表達的上調(diào)可能正是骨骼肌適應(yīng)損傷后細胞代謝微環(huán)境改變以維持細胞正常生理活動的結(jié)果，二者可能通過參與水跨膜轉(zhuǎn)運以達到減輕組織腫脹的目的[2，20]。本實驗采用生、煅石膏對急性軟組織損傷模型大鼠進行干預(yù)，比較發(fā)現(xiàn)煅石膏可明顯緩解損傷部位水腫癥狀，而生石膏作用不明顯。Western-blotting檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠損傷組織中AQP1和AQP3積分光密度值降低，免疫組化法檢測損傷組織中上述蛋白的免疫陽性細胞數(shù)結(jié)果與Western-blotting法檢測結(jié)果趨勢相同，而給予煅石膏干預(yù)后可明顯逆轉(zhuǎn)這些變化。故實驗結(jié)果可分別從蛋白定性、定量的不同維度說明：石膏煅制后改善急性軟組織模型大鼠組織水腫，可能與調(diào)節(jié)細胞中AQP1和AQP3的表達，促進大鼠骨骼肌水代謝、維持骨骼肌液體環(huán)境平衡相關(guān)。本實驗的結(jié)果為煅石膏臨床治療軟組織損傷的作用機制提供了依據(jù)。

參考文獻

[1] LIONBERGER D R， BRENNAN M J. Topical nonsteroidal anti-inflammatory drugs for the treatment of pain due to soft tissue injury： diclofenac epolamine topical patch[J]. Journal of Pain Research， 2010， 36（3）： 223-233.

[2] 邵先舫，劉志軍，李? 前，等.治傷巴布劑對大鼠創(chuàng)傷性軟組織中水通道蛋白-3表達的影響[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，30（2）：207-210.

[3] JIANG Y， LIU H， LIU W， et al. Endothelial Aquaporin-1 （AQP1） expression is regulated by transcription factor Mef2c[J]. Molecules and Cells， 2016， 39（4）： 292.

[4] 嚴? 望.AQPs表達與骨骼肌腫脹的關(guān)系及治傷巴布劑干預(yù)其表達的研究[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

[5] 王玉忠，鄭傳莉.活血止痛膠囊對大鼠急性軟組織損傷的修復(fù)作用研究[J].中藥材，2015，38（6）：1263-1265.

[6] 張桂榮，李蜀平，劉冬平，等.跌打正骨軟膏治療急性軟組織損傷的實驗研究[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，8（7）：679-682.

[7] 程? 玥，唐朝輝，曹? 亮，等.金黃凝膠對大鼠急性軟組織損傷的治療作用研究[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2015，30（7）：768-773.

[8] 李心亮，李? 柯，劉月平，等.煅石膏外用對急性軟組織損傷的治療作用及其機制研究[J].中國中醫(yī)急癥，2015，24（7）：1176-1178.

[9] 李? 妍.煅制溫度對石膏理化性質(zhì)及藥理作用的影響研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2017.

[10] 神油澤.外敷“白藥膏”治療骨折及軟組織扭挫傷[J].按摩與導(dǎo)引，1995，15（3）：21-22.

[11] 何寶凝.白藥膏的質(zhì)量標(biāo)準研究[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育，2012，10（3）：144-145.

[12] 馮小映，李麗月，林靜吟.石膏軟膏的質(zhì)量標(biāo)準研究[J].海峽藥學(xué)，2017，29（4）：59-60.

[13] 岳婧怡，張? 玲.藥用石膏的研究進展[J].廣州化工，2016，44（6）：4-6.

[14] ZHAN Z Y， XU G X. Research progress in the relationship between aquaporins and age-related cataract[J]. International Journal of Ophthalmology， 2011， 11（12）：2122-2124.

[15] YU-MEI Y， JU M， KUN S， et al. Research progress of aquaporin-1 and its role in heart[J]. Journal of Shanghai Jiaotong University， 2011， 31（1）：99-103.

[16] SONG Z， XIANG-NAN L I. Expression of aquaporin-1 and aquaporin-3 in lung tissue of rat model with ischemia-reperfusion injury[J].中華醫(yī)學(xué)雜志（英文版），2010，123（24）：3711-3713.

[17] MINTS M， HILDENBRAND A， LALITKUMAR L P G， et al. Expression of aquaporin-1 in endometrial blood vessels in menorrhagia[J]. International Journal of Molecular Medicine， 2007，19（3）：407-411.

[18] MARLAR S， JENSEN H， LOGIN F H， et al. Aquaporin-3 in Cancer[J]. International journal of molecular sciences， 2017， 18（10）： 2106.

[19] LEVIN M H， VERKMAN A S. Aquaporin-3-dependent cell migration and proliferation during corneal re-epithelialization[J]. Investigative ophthalmology & visual science，2006，47（10）：4365-4372.

[20] 邵先舫，李? 前，丁? 青，等.水通道蛋白1在大鼠正常骨骼肌中的表達[J].中華中醫(yī)藥雜志，2013，28（3）：819-820.

（本文編輯? 楊? 瑛）