李鈺婷 ，甘海寧，趙自明，占心佾，郭 鳴，李智勇，陳玉興*

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院 廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東 廣州 510095）

卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是一種卒中的常見并發(fā)癥，其病因、病理和機制復(fù)雜，可導(dǎo)致神經(jīng)、心理、精神和情感等障礙。有研究表明，卒中幸存者超過30%患有PSD，且發(fā)病率和死亡率呈增加趨勢［1-2］。柴芍安神解郁顆粒為廣東省第二中醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由醋柴胡、白芍、香附、郁金、石菖蒲、法半夏、丹參、茯苓、酸棗仁、牡蠣組成，主要用于PSD 的治療，臨床應(yīng)用多年取得較好療效。本研究主要觀察柴芍安神解郁顆粒對PSD 大鼠PI3K/Akt/RPS6K 信號通路和下丘腦-垂體-腎上腺軸（Hypothalamic-Pituitary-Adrenal axis，HPA）通路的調(diào)控作用，初步探討柴芍安神解郁顆粒抗PSD 的作用機制，為臨床用藥提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 雄性SD 大鼠，SPF 級，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號SCXK（粵）2013-0002，質(zhì)量合格證號44007200026770。動物實驗設(shè)施使用許可證號SYXK（粵）2015-0059。

1.2 藥物與試劑 柴芍安神解郁顆粒由廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院制劑研究室制備（批號20170802）；百優(yōu)解（氟西汀膠囊，批號6621A）購自法國Patheon 公司；解郁安神顆粒（批號17092521）購自神威藥業(yè)有限公司；水合氯醛（批號20120611）購自成都市科龍化工試劑廠；大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH，批號229180412）、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH，批號120180412）、皮質(zhì)醇（CORT，批號230180412）酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒購自天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；抗PIK3R5（批號E807AA0002）、Akt 1（批 號E803AD0275）和RPS6KA1（批號D905AA1021）抗體購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 儀器 JJ3000 動物電子秤（G＆G 公司）；BS224S 電子天平（萬分之一）（德國Sartorius 公司）；5424 型小型高速離心機（德國Eppendorf 公司）；-80 ℃超低溫冰箱（美國Thermo 公司）；680 酶標(biāo)儀、PowerPac Basic 電泳儀、Mini-protean Teral Cell 垂直電泳槽、制膠器（美國Bio-Rad公司）；Tanon5200 Multi 多功能成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；GS-20 軌道式搖床（杭州米歐儀器有限公司）。

2 方法

2.1 藥物制備 柴芍安神解郁顆粒是廣東省第二中醫(yī)院應(yīng)用十余年，用于治療中風(fēng)后抑郁癥的經(jīng)驗方劑，主要由醋柴胡150 g、白芍150 g、香附150 g、郁金150 g、石菖蒲150 g、法半夏120 g、丹參120 g、茯苓120 g、酸棗仁120 g、牡蠣120 g 組成，將香附、石菖蒲、郁金等提取揮發(fā)油后，藥渣與其余藥材加8 倍量水提取2 次，1.5 h/次，合并濾液，濃縮至相對密度1.10～1.20（60 ℃）清膏，噴霧干燥成細(xì)粉，加入適量麥芽糊精和甜菊素，干壓制粒，噴入揮發(fā)油，混勻即可。根據(jù)日服生藥材劑量為58 g，總出膏率平均為20.22%，得浸膏11.73 g，按日服用2 次，每次5.86 g 浸膏粉，每袋裝8 g，浸膏粉與輔料配比約為10∶3.65。制備工藝請參考文獻(xiàn)［3］。

2.2 造模、分組及給藥 大鼠采用線栓法復(fù)制大腦中動脈栓塞（MCAO）局灶性腦缺血再灌注模型，在缺血2 h 后拔出線栓造成腦缺血再灌注損傷；缺血再灌注7 d 后，造模組大鼠隨機均分為模型組、氟西汀膠囊組（1.80 mg/kg，臨床等效劑量）、解郁安神顆粒組（0.90 g 生藥/kg）、柴芍安神解郁顆粒高劑量組（11.52 g 生藥/kg，2 倍臨床等效劑量）和柴芍安神解郁顆粒低劑量組（5.76 g 生藥/kg，臨床等效劑量）5 組。各給藥組按劑量灌胃給藥，正常對照組、模型組灌胃給予等容量蒸餾水，每日1 次，連續(xù)8 周。同時，除正常對照組外其余各組大鼠每天采用慢性不可預(yù)測應(yīng)激（CUMS）處理［4］。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 曠場試驗 8 周后，各組大鼠置于80 cm×80 cm×40 cm、面白線畫有25 塊16 cm×16 cm 正方形色方格，內(nèi)壁為黑色的箱內(nèi)進(jìn)行曠場試驗［5］，記錄各組水平運動及垂直運動得分。

2.3.2 CRH、ACTH、CORT 檢測 末次給藥后1 h，10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取全血，分離血清，ELISA 測血清CRH、ACTH、CORT 水平；

2.3.3 海馬組織PI3K、Akt、RPS6KA1 蛋白檢測 采用Western blot 法。取大鼠腦組織，冰臺上迅速分離海馬組織。取0.1 g 組織于冰上研磨，加入1 mL 裂解液，充分裂解，12 000 r/min，4 ℃，離心10 min，用BCA 法檢測蛋白濃度后，按照60 μg 蛋白上樣量進(jìn)行計算，煮蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜封閉后，加入PI3K、Akt、RPS6KA1（1∶1 000 稀釋）孵育，4 ℃過夜；回收一抗，洗滌液洗3 次，二抗孵育1 h，回收二抗，洗滌液洗3 次。將PVDF 膜置于化學(xué)發(fā)光液中浸泡1～2 min，ECL 發(fā)光顯色，用凝膠自動成像系統(tǒng)對印跡區(qū)帶進(jìn)行拍攝，用Image J軟件進(jìn)行半定量分析。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行分析，計量資料以（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK 檢驗；方差不齊時改用Dunnett’s T3 檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 柴芍安神解郁顆粒對PSD 大鼠曠場試驗得分的影響見表1。與正常對照組比較，模型組大鼠水平運動和垂直運動得分均減少（P＜0.01）；與模型組比較，各藥物組大鼠水平運動得分、垂直運動得均增加（P＜0.01）。

表1 柴芍安神解郁顆粒對PSD 大鼠曠場試驗得分的影響（，n=10）

表1 柴芍安神解郁顆粒對PSD 大鼠曠場試驗得分的影響（，n=10）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.2 柴芍安神解郁顆粒對PSD 大鼠血清CRH、ACTH、CORT 水平的影響 見表2。與正常對照組比較，模型組大鼠血清中CRH、ACTH、CORT 水平均升高（P＜0.01）；與模型組比較，各藥物組血清CRH、ACTH、CORT 均降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 柴芍安神解郁顆粒對PSD 大鼠血清中CRH、ACTH、CORT 水平的影響（，n=10）

表2 柴芍安神解郁顆粒對PSD 大鼠血清中CRH、ACTH、CORT 水平的影響（，n=10）

注：與正常對照組比較，##P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 柴芍安神解郁顆粒對PSD 大鼠海馬組織BDNF 的影響 表3 表明，與正常對照組比較，模型組大鼠海馬BDNF水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，柴芍安神解郁顆粒高、低劑量組大鼠海馬BDNF 水平均增加（P＜0.01）。

表3 柴芍安神解郁顆粒對PSD 大鼠海馬組織BDNF 水平的影響（，n=10）

表3 柴芍安神解郁顆粒對PSD 大鼠海馬組織BDNF 水平的影響（，n=10）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.4 柴芍安神解郁顆粒對PSD 大鼠海馬組織PI3K/Akt/RPS6KA1 信號通路蛋白表達(dá)的影響 見表4、圖1。與正常對照組比較，模型組大鼠海馬PI3K 蛋白表達(dá)無變化（P＞0.05），Akt 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），RPS6KA1 蛋白表達(dá)增加（P＜0.01）；與模型組相比，各組大鼠海馬Akt和RPS6KA1 均有顯著性增加（P＜0.01）。

表4 柴芍安神解郁顆粒對PSD 大鼠海馬PI3K、Akt、RPS6KA1 蛋白表達(dá)的影響（，n=3）

表4 柴芍安神解郁顆粒對PSD 大鼠海馬PI3K、Akt、RPS6KA1 蛋白表達(dá)的影響（，n=3）

注：與正常對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖1 Western blot 檢測大鼠海馬PI3K、Akt、RPS6KA1 蛋白表達(dá)

4 討論

“卒中”是一種急性腦血管疾病，又稱“中風(fēng)”“腦血管意外”，是由于腦部血管突然破裂或阻塞而引起的腦組織損傷。卒中發(fā)生后通常會導(dǎo)致PSD，而PSD 發(fā)生的原因復(fù)雜，分析其原因主要由于卒中嚴(yán)重?fù)p害大腦的生理結(jié)構(gòu)，影響其正常的調(diào)節(jié)情緒功能。有研究［6］發(fā)現(xiàn)，左側(cè)大腦半球梗死后抑郁發(fā)病率高于右側(cè)半球，說明左側(cè)大腦半球病變更易引起抑郁狀態(tài)，以及患者對自身疾病所帶來身心生理生活及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)上的焦慮，嚴(yán)重影響情緒，甚至產(chǎn)生輕生現(xiàn)象等。柴芍安神解郁顆粒作為廣東省第二中醫(yī)院的院內(nèi)制劑，具有疏肝解郁及活血化瘀等功效，多年臨床應(yīng)用已證實該制劑具有顯著改善PSD 的療效，但是該方治療PSD 的作用機制尚未闡明。因此，本研究擬從情緒應(yīng)激及內(nèi)分泌相關(guān)的HPA 軸、神經(jīng)營養(yǎng)因子及其下游信號通路的角度探討其改善PSD 的作用機制。我們的研究發(fā)現(xiàn)柴芍安神解郁顆粒明顯升高PSD 模型大鼠的抑郁癥狀，其作用機制與調(diào)節(jié)大腦海馬神經(jīng)元保護(hù)有密切關(guān)系。

不少研究表明，PSD 的發(fā)生、發(fā)展與HPA 軸的異常有密切關(guān)系。當(dāng)機體感受應(yīng)激源時，HPA 軸興奮性升高，腎上腺分泌的糖皮質(zhì)類固醇升高，從而使機體適應(yīng)應(yīng)激。PSD 患者存在長期或慢性的抑郁應(yīng)激狀態(tài)與HPA 軸功能持續(xù)亢進(jìn)有關(guān)，表現(xiàn)出促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（Corticotropin-Releasing Hormone，CRH）、促腎上腺皮質(zhì)激素（Adrenocorticotropic Hormone，ACTH）及腎上腺酮（Corticosterone，CORT）大量釋放［7-9］。柴芍安神解郁顆粒明顯降低PSD 大鼠血清CRH、ACTH 和CORT 的水平，提示其能降低中風(fēng)后遺癥引起的HPA 軸功能過度興奮，從而改善PSD大鼠的抑郁癥狀。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）主要分布在海馬和前皮質(zhì)中，對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育發(fā)揮重要的作用，在本實驗中，柴芍安神解郁顆粒明顯升高海馬組織中BDNF 的含量，結(jié)果提示其具有增強神經(jīng)元的存活和聯(lián)系的作用，而氟西汀和解郁安神顆粒并無此作用。同時，BDNF 也是與抑郁癥高度相關(guān)的一個神經(jīng)營養(yǎng)因子［10］，BDNF 缺失可能導(dǎo)致神經(jīng)凋亡或萎縮，進(jìn)而導(dǎo)致抑郁的發(fā)生。BDNF 與酪氨酸激酶B（Tyrosine kinase B，TrkB）結(jié)合后可激活細(xì)胞內(nèi)多個信號傳導(dǎo)通路，其中的磷酸肌醇3 激酶（Phosphoinositol 3 kinase，PI3K）傳導(dǎo)通路通過與下游的靶標(biāo)Akt 相結(jié)合，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)育、分化、再生以及對神經(jīng)元的存活、突觸可塑性等發(fā)揮重要作用。當(dāng)腦發(fā)生缺血時，PI3K/Akt 通道的激活可抵抗自由基、拮抗氨基酸神經(jīng)毒性、平衡細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管內(nèi)皮新生等，對抑制細(xì)胞凋亡有積極作用［11-4］。柴芍安神解郁顆粒明顯增加PSD 大鼠腦內(nèi)PI3K 和Akt 的蛋白表達(dá)，兩者結(jié)合增多，從而在腦卒中時，增加神經(jīng)元的存活。而氟西汀和解郁安神顆粒僅增加Akt 的表達(dá)量，PI3K 并無明顯變化。核糖體蛋白S6 激酶α1（Ribosomal Protein S6 Kinase A1，RPS6KA1）是一類位于MAPK 激酶下游的高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，其介導(dǎo)某些特定前凋亡蛋白的失活或通過激活轉(zhuǎn)錄因子直接啟動一些抗凋亡蛋白的合成，還能夠通過磷酸化來使一些具有凋亡功能的細(xì)胞死亡蛋白和腫瘤抑制因子相關(guān)蛋白激酶失活［15］。柴芍安神解郁顆粒通過增加PRS6KA1 的蛋白表達(dá)量，從而增強神經(jīng)元細(xì)胞抵抗凋亡的作用。

綜上所述，柴芍安神解郁顆粒可明顯增加PSD 大鼠水平運動得分和垂直運動得分，顯著性降低PSD 大鼠CRH、ACTH、CORT 等HPA 軸激素水平，抑制HPA 軸功能興奮性，以及上調(diào)海馬BDNF 的含量及PI3K、Akt、RPS6KA1蛋白的蛋白相對表達(dá)量，從而減少腦神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。該結(jié)果提示柴芍安神解郁顆粒改善PSD 大鼠抑郁癥狀可能與抑制PHA 軸興奮性及激活PI3K/Akt/RPS6K 通路使腦神經(jīng)元細(xì)胞免受凋亡有關(guān)。