張健

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200025）

變構(gòu)效應(yīng)（allosteric effect）是一種精確調(diào)節(jié)生物大分子功能的機(jī)制，指大部分為蛋白質(zhì)的生物大分子在遠(yuǎn)離底物位點(diǎn)或功能位點(diǎn)的其他區(qū)域存在變構(gòu)位點(diǎn)，這些位點(diǎn)通過(guò)傳遞配體結(jié)合等作用來(lái)造成大分子活性改變的過(guò)程。從20世紀(jì)初對(duì)血紅蛋白的玻爾效應(yīng)研究開(kāi)始，到上世紀(jì)60年代由Monod和Jacob教授首次提出變構(gòu)效應(yīng)這一概念，再到目前美國(guó)FDA批準(zhǔn)的多個(gè)變構(gòu)藥物上市，變構(gòu)效應(yīng)及其在藥物設(shè)計(jì)中的應(yīng)用正越來(lái)越得到研究者的關(guān)注，變構(gòu)效應(yīng)更是被稱為“生命的第二秘密”。

變構(gòu)藥物設(shè)計(jì)的核心在于發(fā)現(xiàn)變構(gòu)位點(diǎn)與合理設(shè)計(jì)變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，從而通過(guò)間接的方式調(diào)節(jié)靶標(biāo)蛋白活性。相比于靶向蛋白功能位點(diǎn)的正構(gòu)藥物來(lái)說(shuō)，變構(gòu)藥物具有一系列天然優(yōu)勢(shì)：其一，變構(gòu)位點(diǎn)理論上可以位于蛋白表面的任何位置，比起長(zhǎng)期進(jìn)化選擇后的蛋白功能位點(diǎn)，變構(gòu)位點(diǎn)保守性更低，從而變構(gòu)調(diào)節(jié)劑具有更好的亞型選擇性和更低的副作用，具有臨床應(yīng)用價(jià)值；其二，當(dāng)?shù)孜锖湍繕?biāo)蛋白結(jié)合能力較強(qiáng)或者涉及口袋平坦寬大的蛋白-蛋白相互作用時(shí)，很難開(kāi)發(fā)直接靶向底物位點(diǎn)的藥物分子，而變構(gòu)調(diào)節(jié)劑因并不直接結(jié)合在底物位點(diǎn)，此時(shí)依然可以調(diào)控蛋白活性；其三，變構(gòu)調(diào)節(jié)劑可以和正構(gòu)位點(diǎn)的分子共同作用，對(duì)蛋白活性進(jìn)行更加精細(xì)和復(fù)雜的調(diào)節(jié)，在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有應(yīng)用可能；其四，由于變構(gòu)調(diào)節(jié)劑對(duì)特定構(gòu)象的結(jié)合，只有在正構(gòu)小分子存在時(shí)，變構(gòu)調(diào)節(jié)劑才會(huì)對(duì)蛋白活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，這不僅進(jìn)一步減少了副作用，也有利于組織特異性給藥途徑的探索。近10年來(lái)，變構(gòu)小分子數(shù)量的激增也證明了變構(gòu)效應(yīng)在藥物設(shè)計(jì)領(lǐng)域受到極大重視。

基于Sirtuin 6（SIRT6）的變構(gòu)激動(dòng)劑設(shè)計(jì)是合理變構(gòu)藥物設(shè)計(jì)的一個(gè)典型范例。SIRT6是一種組氨酸去乙?；福涔δ苁菍⒁阴；嚢彼醾?cè)鏈的乙酰基轉(zhuǎn)移到煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）上，在抗炎、DNA衰老修復(fù)和腫瘤控制中起到重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT6過(guò)表達(dá)的小鼠明顯更加長(zhǎng)壽，且癌細(xì)胞更快凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有影響。因此，SIRT6激動(dòng)劑的發(fā)現(xiàn)可能具有重要的臨床意義。然而，傳統(tǒng)靶向正構(gòu)位點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)策略很難達(dá)到激動(dòng)效果。針對(duì)酶激動(dòng)的難靶問(wèn)題，變構(gòu)方法則可以大顯身手。筆者課題組采用自主開(kāi)發(fā)的Allosite變構(gòu)位點(diǎn)識(shí)別方法，預(yù)測(cè)了潛在的SIRT6正構(gòu)位點(diǎn)背側(cè)的變構(gòu)位點(diǎn)。在虛擬篩選超過(guò)500萬(wàn)個(gè)化合物后，基于變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的打分原則和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，成功獲得了EC50在200 μmol· L-1左右的2個(gè)化合物，并通過(guò)基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)方法將EC50優(yōu)化到5 μmol· L-1。小分子和SIRT6蛋白的共晶表明，Allosite有效識(shí)別了具有激動(dòng)活性的變構(gòu)位點(diǎn)，細(xì)胞和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了激動(dòng)劑的抗肝癌效果。這項(xiàng)研究不僅為靶向SIRT6蛋白的藥物設(shè)計(jì)提供了良好的先導(dǎo)化合物，促進(jìn)了對(duì)其機(jī)制的研究，也為其他酶激動(dòng)劑的變構(gòu)設(shè)計(jì)提供了成功范例。

變構(gòu)藥物設(shè)計(jì)因其巨大價(jià)值在引起世界各國(guó)科研機(jī)構(gòu)和藥物研發(fā)公司重視的同時(shí)，也面臨著諸多挑戰(zhàn)，主要包括以下幾點(diǎn)：1）有價(jià)值的變構(gòu)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)困難。正構(gòu)配體通常結(jié)合在明顯而保守的正構(gòu)位點(diǎn)，而理論上，除了正構(gòu)位點(diǎn)之外的任何位置都可能成為變構(gòu)位點(diǎn)，這造成了變構(gòu)位點(diǎn)確定的困難，同時(shí)也難以測(cè)定變構(gòu)位點(diǎn)與正構(gòu)位點(diǎn)間的作用偶聯(lián)。2）變構(gòu)耐藥突變?nèi)菀装l(fā)生。由于變構(gòu)位點(diǎn)進(jìn)化壓力小，變構(gòu)位點(diǎn)更容易發(fā)生突變，從而造成變構(gòu)調(diào)節(jié)劑失效，另外由于變構(gòu)效應(yīng)涉及蛋白內(nèi)信號(hào)通路，通路上的突變也會(huì)造成變構(gòu)效應(yīng)的變化。3）變構(gòu)效應(yīng)具有種屬特異性。對(duì)人源蛋白有效的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑對(duì)于鼠源蛋白可能就會(huì)失效，這對(duì)于藥物設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)步驟較為不利。4）變構(gòu)調(diào)節(jié)劑與蛋白的共晶復(fù)合物不易獲得。通常變構(gòu)調(diào)節(jié)劑與蛋白結(jié)合力不如正構(gòu)調(diào)節(jié)劑，構(gòu)效關(guān)系不易追溯，同時(shí)具有較低的水溶性，因此難以獲得調(diào)節(jié)劑-蛋白共晶結(jié)構(gòu)，從而影響了臨床實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

作為生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和化學(xué)的交叉領(lǐng)域，變構(gòu)藥物設(shè)計(jì)在目前投入大、風(fēng)險(xiǎn)高的新藥發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域是一個(gè)不可忽視的新方向。近年來(lái)，在綜合運(yùn)用實(shí)驗(yàn)手段和計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)方法的基礎(chǔ)上，變構(gòu)領(lǐng)域的方法學(xué)研究已取得了一系列進(jìn)展，對(duì)變構(gòu)藥物設(shè)計(jì)的蓬勃發(fā)展起到了助推作用。在變構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)方面，AlloSteric Database（ASD）和ASBench等高質(zhì)量數(shù)據(jù)資源對(duì)位點(diǎn)預(yù)測(cè)起到了重要作用；在變構(gòu)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)方面，Allosite、Corrsite、PARS等方法從變構(gòu)位點(diǎn)的不同性質(zhì)出發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)，為研究者們尋找變構(gòu)位點(diǎn)提供了極大的便利；在變構(gòu)信號(hào)傳遞和突變分析方面，AlloDriver、AlloSigMA、MCPath等方法對(duì)變構(gòu)效應(yīng)的機(jī)制探究做出了一定的貢獻(xiàn)，也促進(jìn)了變構(gòu)先導(dǎo)化合物的優(yōu)化；在變構(gòu)調(diào)節(jié)劑打分和預(yù)測(cè)方面，Alloscore可用于結(jié)合活性預(yù)測(cè)，AlloFinder和CovCys等可用于自動(dòng)化變構(gòu)分子探測(cè)，均已經(jīng)在變構(gòu)藥物設(shè)計(jì)領(lǐng)域有所建樹(shù)。從實(shí)驗(yàn)角度出發(fā)，X射線衍射和冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展提供了更多可用于變構(gòu)藥物設(shè)計(jì)的生物大分子結(jié)構(gòu)，核磁共振波譜法也對(duì)于變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的機(jī)制研究和輔助結(jié)構(gòu)測(cè)定有著很大幫助。近年來(lái)，雙電子-電子共振光譜法、氫氘交換質(zhì)譜法等方法的發(fā)展也在變構(gòu)效應(yīng)驗(yàn)證和探索中發(fā)揮了作用?；谧儤?gòu)研究方法快速發(fā)展，變構(gòu)調(diào)節(jié)劑發(fā)現(xiàn)逐漸規(guī)范化、流程化的事實(shí)，變構(gòu)藥物已經(jīng)從偶然發(fā)現(xiàn)進(jìn)入到基于結(jié)構(gòu)的合理藥物設(shè)計(jì)這一階段。

隨著變構(gòu)藥物設(shè)計(jì)進(jìn)入新階段，一些曾經(jīng)難成藥的蛋白已經(jīng)陸續(xù)有了靶向性的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，我國(guó)科研人員在變構(gòu)效應(yīng)開(kāi)發(fā)方面也有了初步的成效。以蛋白酪氨酸激酶SHP2變構(gòu)抑制劑設(shè)計(jì)為例，研究者沒(méi)有選擇難以靶向的高度保守且?guī)д姷拇呋稽c(diǎn)進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)，而是基于變構(gòu)位點(diǎn)，試圖通過(guò)變構(gòu)抑制劑將蛋白穩(wěn)定在自抑制構(gòu)象來(lái)發(fā)揮抗腫瘤效果。研究者首先針對(duì)常見(jiàn)致病突變E76A進(jìn)行了20 000個(gè)化合物的生化篩選，獲得了對(duì)E76A突變體特異性有效，但對(duì)正常SHP2無(wú)效的化合物，并通過(guò)構(gòu)效關(guān)系進(jìn)一步優(yōu)化，獲得了優(yōu)化后的化合物和蛋白的共晶結(jié)構(gòu)。從結(jié)構(gòu)提示的重要相互作用出發(fā)，研究者進(jìn)一步優(yōu)化了小分子調(diào)節(jié)劑，將其IC50控制在0.7 μmol· L-1，選擇性提高到了30倍左右。最終的化合物在分子水平能夠抑制下游絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等過(guò)程，在細(xì)胞水平也能發(fā)揮廣譜的抗癌作用。該SHP2的變構(gòu)抑制劑對(duì)于開(kāi)發(fā)新的癌癥療法有所裨益。近期，新發(fā)現(xiàn)的針對(duì)磷酸甘油酸變位酶1（PGAM1）的變構(gòu)抑制劑對(duì)非小細(xì)胞肺癌的控制效果也值得關(guān)注。以之前變構(gòu)抑制劑的共晶結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，研究者通過(guò)調(diào)節(jié)磺酰胺的位置，控制了抑制劑和底物的競(jìng)爭(zhēng)作用，最后成功開(kāi)發(fā)了HKB99作為PGAM1的抑制劑。該抑制劑不僅可以負(fù)向調(diào)控3-磷酸甘油酸向2-磷酸甘油酸的轉(zhuǎn)化，抑制腫瘤代謝和溫伯格效應(yīng)，也可以削弱PGAM1和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的相互作用，從而抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，還可以通過(guò)活性氧依賴的c-Jun氨基末端激酶（JNK/c-Jun）信號(hào)通路引發(fā)癌細(xì)胞凋亡?？傮w上高效控制了非小細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，對(duì)未來(lái)變構(gòu)藥物設(shè)計(jì)也提供了一定參考。在變構(gòu)激動(dòng)劑方面，α7型尼古丁乙酰膽堿受體（α7nAChR）的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑開(kāi)發(fā)可以提供較好的范例。α7nAChR的激動(dòng)有利于諸如精神分裂癥、阿爾茨海默病等神經(jīng)精神疾病的控制，由于神經(jīng)系統(tǒng)中有多個(gè)該蛋白的其他亞型，設(shè)計(jì)高選擇性的變構(gòu)激動(dòng)劑的需求度很高。從已知2-乙基硫烷基-5-氨基噻唑結(jié)構(gòu)出發(fā)，研究者首先合成了一個(gè)小的化合物庫(kù)，并篩選其激動(dòng)活性，對(duì)激動(dòng)活性較好的化合物做不同修飾，之后基于構(gòu)效關(guān)系進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)合效力和選擇性最好的一類化合物。最終成功設(shè)計(jì)了化合物JWX-A1223a作為α7nAChR的選擇性激動(dòng)劑，同時(shí)揭示N6-（2-氯-6-甲基）-苯基是重要的活性基團(tuán)，為之后的藥物設(shè)計(jì)鋪平了道路?？偟膩?lái)說(shuō)，變構(gòu)調(diào)節(jié)劑設(shè)計(jì)可以在腫瘤控制、神經(jīng)疾病治療等方面提供新策略，而合理變構(gòu)藥物設(shè)計(jì)是推動(dòng)這部分研究不可或缺的力量。

總之，經(jīng)過(guò)百余年的發(fā)展，變構(gòu)調(diào)節(jié)劑發(fā)現(xiàn)從“霧里看花”的隨機(jī)猜測(cè)和偶然發(fā)現(xiàn)，逐漸進(jìn)入了基于結(jié)構(gòu)的合理設(shè)計(jì)這一階段。借助日新月異的實(shí)驗(yàn)方法和計(jì)算手段，研究人員已經(jīng)逐漸掌握了變構(gòu)效應(yīng)的有關(guān)規(guī)律。作為藥物設(shè)計(jì)領(lǐng)域的一片藍(lán)海，變構(gòu)效應(yīng)必將吸引更多的科研工作者，最終將為人類健康事業(yè)做出應(yīng)有的貢獻(xiàn)。