曹恒義，朱繼東

（中國科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所生物與化學(xué)交叉研究中心，上海 201203）

生物體內(nèi)的磷酸化調(diào)控是調(diào)節(jié)細胞生命活動的最重要的調(diào)控方式之一。其廣泛地發(fā)生在蛋白、磷脂、糖類和核糖核苷酸等諸多細胞成分中。蛋白激酶和蛋白磷酸酶分別作為磷酸化和去磷酸化功能的兩大類蛋白，在細胞中維系著蛋白磷酸化調(diào)控的平衡，因此對它們功能的研究顯得極為重要。蛋白質(zhì)的磷酸化一般發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸上，蛋白激酶通常以ATP為底物將磷酸基團轉(zhuǎn)移到這些氨基酸殘基上使其磷酸化，從而調(diào)節(jié)蛋白的功能或穩(wěn)定性，或者將細胞信號繼續(xù)傳遞下去，蛋白磷酸酶則會將蛋白氨基酸殘基上的磷酸水解[1]。

目前發(fā)現(xiàn)107個蛋白磷酸酶亞家族，可以分為如下4類：蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases，PTPs）、金屬離子依賴性蛋白磷酸酶（metal-dependent protein phosphatases，PPMs）、磷蛋白磷酸酶（phosphoprotein phosphatases，PPPs）以及鹵酸脫鹵型磷酸酶（phosphatases of the haloacid dehalogenases，HAD磷酸酶），其中PPMs和PPPs屬于蛋白絲/蘇氨酸磷酸酶，HAD磷酸酶中除了缺眼蛋白家族（eyes absent family of proteins，Eya）屬于酪氨酸磷酸酶以外，其余已知的均為絲/蘇氨酸磷酸酶。PTPs根據(jù)催化模組的不同又分為第1、2、3類PTPs以及細菌PTPs。第1類PTPs包括受體型PTPs、非受體型PTPs和雙特異性磷酸酶（dual specificity phosphatases，DSPs），DSPs既可以使酪氨酸去磷酸化，也可以使絲/蘇氨酸去磷酸化[1-3]。

由于蛋白激酶的激活功能往往與腫瘤等疾病直接相關(guān)，因此蛋白激酶很早就被作為藥物靶點來進行研究，其抑制劑也已進入臨床應(yīng)用，然而，蛋白磷酸酶抑制劑的研究相對較少。作為蛋白激酶的主要拮抗蛋白，蛋白磷酸酶一開始被簡單地認為是腫瘤抑制因子，但后來隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)一些蛋白磷酸酶本身可能就是致癌因子，并且一些導(dǎo)致蛋白磷酸酶持續(xù)激活的基因異常已被證實在腫瘤等疾病中廣泛存在，是重要的原癌基因。隨著對蛋白磷酸酶去磷酸化作用的研究繼續(xù)深入，蛋白磷酸酶抑制劑的潛在臨床治療價值得到越來越多的實驗驗證；同時，對蛋白磷酸酶活性有調(diào)節(jié)作用的小分子也為致病機制研究提供了重要的工具。早期有一些天然產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)具有蛋白磷酸酶抑制能力，但它們均主要在兩個方面存在一些問題而最終無法進入臨床應(yīng)用：一是特異性問題，這些抑制劑多作用于磷酸酶的催化域，而同家族蛋白磷酸酶催化域高度保守，抑制劑難以區(qū)分不同亞型的磷酸酶，從而帶來潛在的副作用，并給藥理機制研究造成困難；二是蛋白磷酸酶的催化域往往帶有正電荷，更傾向于結(jié)合帶負電的分子，而帶負電荷的小分子抑制劑本身在代謝和生物利用度方面處于弱勢。最早，人們設(shè)計蛋白磷酸酶底物類似物來競爭蛋白磷酸酶的作用，但絕大多數(shù)都因成藥性差而失敗。直到最近，一些分子通過作用于蛋白磷酸酶催化域以外的潛在口袋來調(diào)節(jié)蛋白磷酸酶的活性（見表1），巧妙地回避了蛋白磷酸酶催化域抑制劑特異性差和成藥性差的問題，這些新的蛋白磷酸酶變構(gòu)抑制劑的問世為蛋白磷酸酶的研究帶來新的活力，也讓蛋白磷酸酶作為藥物靶點重獲希望。本文就目前熱門的蛋白磷酸酶變構(gòu)抑制劑的研究進展作一綜述，希望為更多新的蛋白磷酸酶變構(gòu)抑制劑研究帶來啟發(fā)。

表 1 蛋白磷酸酶變構(gòu)抑制劑Table 1 Allosteric inhibitors of protein phosphatases

1 蛋白酪氨酸磷酸酶1B變構(gòu)抑制劑

蛋白酪氨酸磷酸酶1B （protein-tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）是由PTPN1基因編碼的一種非受體蛋白酪氨酸磷酸酶（non-receptor PTP）。越來越多的證據(jù)表明，PTP1B在多種腫瘤中都存在高表達，如前列腺癌[26]、上皮癌[27]、卵巢癌[28]、乳腺癌[29]和胃腸道癌[30-31]等，因此有人將其視為能夠促進腫瘤生長的蛋白磷酸酶。更讓人感興趣的是，PTP1B具有減弱細胞對胰島素敏感性的作用，其可以使胰島素受體b亞基（insulin receptor b subunit，IRb）的pY1162/pY1163酪氨酸以及胰島素受體底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）去磷酸化從而減弱胰島素誘導(dǎo)的蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）磷酸化，當(dāng)PTP1B被抑制后可恢復(fù)細胞對胰島素的敏感性[32]，因此PTP1B的抑制劑有望成為治療2型糖尿病的新方案。此外，PTP1B對瘦素（leptin）信號通路也有一定的作用，PTP1B抑制劑也被開發(fā)用于肥胖癥的治療[33]。

文獻報道的PTP1B抑制劑已有很多，既有天然產(chǎn)物也有人工合成的小分子抑制劑[33-34]，它們絕大多數(shù)都作用在催化位點上，雖然在體外試驗中具有抑制活性，但在選擇性和細胞滲透性上仍然存在很大的局限性[35]，因此開發(fā)催化位點之外的抑制劑是非常有希望突破這種局限的方案。1997年，Puius等[36]在催化位點附近發(fā)現(xiàn)了芳基磷酸結(jié)合位點，這一位點的氨基酸殘基序列相較于催化位點在同源蛋白中具有更大的差異，隨后越來越多的Cys215殘基附近的位點被發(fā)現(xiàn)[37]，針對這些位點和催化位點設(shè)計的雙位點抑制劑成功解決了一部分蛋白磷酸酶抑制劑選擇性差的問題，但由于這些抑制劑仍然依賴催化位點的結(jié)合因而仍具有帶電荷基團或易被代謝的基團，不利于成藥。2004年，Wiesmann等[5]報道了首個PTP1B變構(gòu)抑制劑，他們通過酶動力學(xué)試驗測試了一些非磷酸結(jié)構(gòu)的PTP1B抑制劑及衍生物，從中發(fā)現(xiàn)了一個不與底物相競爭的化合物1（IC50= 350 μmol · L-1），隨后改造的化合物 2（IC50=22 μmol · L-1）和 3（IC50= 8 μmol · L-1）的抑制活性提高了約40倍，繼而通過共晶結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)化合物2結(jié)合在新的變構(gòu)位點上，該位點位于α3螺旋和α6螺旋之間的凹槽，抑制劑作用于這一位點可以阻止對催化區(qū)域十分重要的WPD loop關(guān)閉構(gòu)象（活性構(gòu)象）的形成（見圖1）。由于化合物2作用在同源性很高的催化區(qū)域之外，隨后的選擇性試驗也發(fā)現(xiàn)它對同源蛋白 LAR（IC50＞ 500 μmol · L-1）和 TC-PTP（IC50=129 μmol · L-1）的抑制活性與PTP1B存在明顯差異。細胞試驗也證實了這些化合物具有增強胰島素信號傳導(dǎo)的作用，這一發(fā)現(xiàn)極大地激發(fā)了研究人員對蛋白磷酸酶抑制劑研發(fā)的熱情。Tang等[6]后來在化合物1 ～ 3的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進一步改造得到化合物4（IC50=3.2 μmol · L-1）。2014 年，Krishnan 等[38-39]通過靶點篩選發(fā)現(xiàn)MSI-1436（5，又名trodusquemine）可作用于 PTP1B（對 PTP1B1-405的 IC50為 600 nmol · L-1），并結(jié)合磁共振（NMR）和蛋白晶體數(shù)據(jù)分析了更長片段的PTP1B蛋白的變構(gòu)位點的作用機制，發(fā)現(xiàn)MSI-1436可以作用在一個新的變構(gòu)位點，該位點位于C端的α9'螺旋上。小鼠移植瘤模型實驗發(fā)現(xiàn)，MSI-1436能抑制人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2） 陽 性的乳腺癌細胞生長。遺憾的是，由于MSI-1436活性較低且在體內(nèi)的生物利用度較差，DepYmed公司于2017年停止了該化合物的臨床試驗，目前，其改造后的第2代分子DPM-1001（6，對PTP1B1-405的IC50為100 nmol · L-1）正在進行臨床前研究，該分子可以與Cu2+形成穩(wěn)定的配合物，并且該配合物可能與C末端的組氨酸結(jié)合[4,40]。

圖 1 化合物2與PTP1B變構(gòu)位點的結(jié)合模式[5]Figure 1 Binding mode of compound 2 to PTP1B allosteric site [5]

2 含Src同源2結(jié)構(gòu)域蛋白酪氨酸磷酸酶變構(gòu)抑制劑

含Src同源2結(jié)構(gòu)域蛋白酪氨酸磷酸酶（Src homology 2 domain containing protein tyrosine phosphatase，SHP2）由PTPN11基因編碼，其結(jié)構(gòu)包含N端的2個Src同源2結(jié)構(gòu)域（N-SH2和C-SH2 domains）和C端的1個具有催化功能的PTP結(jié)構(gòu)域。在通常狀態(tài)下，N端的SH2結(jié)構(gòu)域會與PTP結(jié)構(gòu)域相互作用形成一種自抑制的構(gòu)象，當(dāng)SH2結(jié)構(gòu)域與酪氨酸磷酸化的生長因子受體結(jié)合后會解除SHP2的自抑制構(gòu)象，形成開放的活化狀態(tài)從而激活PTP結(jié)構(gòu)域的去磷酸化功能?；罨腟HP2可以激活RAS-細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）信號通路，因此SHP2是諸多蛋白激酶通路上的重要調(diào)控蛋白[41-42]。最近也有研究表明，SHP2可以通過結(jié)合程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）和B、T淋巴細胞衰減因子（B- and T-lymphocyte attenuator，BTLA）等抑制性的免疫檢查點來調(diào)節(jié)T細胞的活化[43]。同時，PTPN11基因的突變導(dǎo)致SHP2蛋白的持續(xù)激活在多種人類發(fā)育性疾病和癌癥中都被發(fā)現(xiàn)，如白血病[44-45]、努南綜合征[46]等，因此被認定為是原癌基因。早期針對其PTP結(jié)構(gòu)域的抑制劑同樣存在選擇性差、活性低、成藥性差等缺點。2016年，諾華（Novartis）公司報道了化合物SHP099（7，IC50= 0.071 μmol · L-1），該化合物不同于以往的SHP2抑制劑，共晶研究發(fā)現(xiàn)它能結(jié)合到2個SH2結(jié)構(gòu)域和PTP結(jié)構(gòu)域三者之間（稱作“隧道”位點），使SHP2穩(wěn)定在關(guān)閉的自抑制構(gòu)象上（見圖2），從而抑制SHP2的活性[10-11]。這一獨特的作用方式使SHP099成為首個高效、可口服、選擇性好的SHP2抑制劑。在隨后的研究中，F(xiàn)odor等[9]又發(fā)現(xiàn)了SHP2結(jié)構(gòu)上的另一個變構(gòu)位點——“門閂”位點，該位點位于N-SH2結(jié)構(gòu)域和PTP結(jié)構(gòu)域交界面之間，同樣可以穩(wěn)定SHP2的自抑制構(gòu)象（見圖2），針對該位點篩選得到變構(gòu)抑制劑SHP244（8，對 SHP21-525的 IC50為 60 μmol · L-1），其作為苗頭化合物經(jīng)進一步改造后，抑制活性有所提升，但該位點的抑制劑活性相較作用于“隧道”位點的抑制劑仍然較弱，盡管如此，新的位點也具有很好的開發(fā)潛力，對未來解決可能出現(xiàn)的變構(gòu)位點突變產(chǎn)生耐藥的情況有所幫助。最近，諾華公司的SHP2變構(gòu)抑制劑開發(fā)又有了新的進展，在接連發(fā)表的2篇文章中，諾華公司對SHP099進行了進一步改造，進一步擴充了“隧道”位點變構(gòu)抑制劑的化合物庫，開發(fā)了一系列活性更高、藥物代謝性質(zhì)更好的化合物，目前TNO155（9）已處于Ⅰ期臨床試驗中，這充分說明了磷酸酶的變構(gòu)抑制劑具有很大的藥物開發(fā)潛力[7-8]。在SHP099被報道之后，越來越多的研究機構(gòu)和醫(yī)藥企業(yè)開始致力于SHP2變構(gòu)抑制劑的研發(fā)，SHP2也成為明星靶點。Xie等[12]在SHP2的“隧道”位點關(guān)鍵位置引入與疾病相關(guān)的E76A突變，利用SHP2E76A持續(xù)激活的蛋白來篩選有效的變構(gòu)抑制劑，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過改造得到的化合物10（對SHP2E76A的IC50為 0.71 μmol · L-1）能有效抑制絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路。Nichols等[13]發(fā)現(xiàn)SHP099的類似物RMC-4550（11，IC50= 0.58 nmol · L-1）可以對 BRAF 第 3類突變、神經(jīng)纖維瘤蛋白1（neurofibromin 1，NF1）缺失以及KRAS(G12C)等依賴GTP激活RAS-MAPK通路的癌癥驅(qū)動基因產(chǎn)生抑制，目前Revolution Medicines公司的RMC-4630也已處于Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗階段。

圖 2 化合物7與SHP2“隧道”變構(gòu)位點的結(jié)合模式以及化合物8與SHP2“門閂”變構(gòu)位點的結(jié)合模式[9, 11]Figure 2 Binding mode of compound 7 to“tunnel”allosteric site and compound 8 to“l(fā)atch”allosteric site [9, 11]

3 淋巴酪氨酸磷酸酶變構(gòu)抑制劑

淋巴酪氨酸磷酸酶（lymphoid tyrosine phosphatase，LYP）是由PTPN22基因編碼的磷酸酶，催化位點中心在Cys227，它在T細胞信號調(diào)節(jié)中有著重要的作用并有可能成為治療自身免疫性疾病的靶點。LYPR620W雜合突變在1型糖尿病[47-48]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[49]、格雷夫斯病[50]以及一些自身免疫性疾病中均有發(fā)現(xiàn)[51]，但是其發(fā)病機制尚不十分明確，近期的研究表明，突變的LYP可能導(dǎo)致T細胞整合素下游信號分子的磷酸化水平升高[52]。該靶點目前鮮有變構(gòu)抑制劑的報道，Stanford等[14]報道的LYP抑制劑不帶有羧酸、磷酸等基團，他們通過動力學(xué)分析、多肽氨基酸氫/氘交換質(zhì)譜分析[peptide amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (DXMS) analysis]、分子對接（docking）以及對關(guān)鍵氨基酸殘基進行突變，發(fā)現(xiàn)他們的抑制劑 12（IC50= 5.28 μmol · L-1）作用于催化位點之外的位點，因此具有良好的選擇性。最近，Li等[15]發(fā)現(xiàn)了又一LYP變構(gòu)抑制劑NC1（13，Ki= 4.3 μmol · L-1），他們運用非天然氨基酸 2-氟-酪氨酸（2-fluorine-tyrosine，F(xiàn)2Y） 替 換 Leu281， 并 用19F-NMR觀測WPD loop的運動，發(fā)現(xiàn)該抑制劑能限制WPD loop的構(gòu)象。

4 白細胞共同抗原變構(gòu)抑制劑

白細胞共同抗原（leukocyte common antigen，即CD45）是一種在白細胞膜上表達的受體蛋白酪氨酸磷酸酶，由PTPRC基因編碼，其功能對T細胞受體（T-cell receptor，TCR）的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及T細胞的激活至關(guān)重要，它可以調(diào)節(jié)Src家族蛋白激酶的淋巴細胞特異性酪氨酸蛋白激酶（lymphocytespecific protein tyrosine kinase，Lck）等，將其pY505去磷酸化（待激活的活化態(tài)，“primed” status）從而促進Lck pY394（小鼠pY393）的自磷酸化激活；此外，pY394的去磷酸化也受到高濃度CD45的調(diào)節(jié)，因此CD45作為雙向調(diào)節(jié)Lck等蛋白活性的關(guān)鍵因子，維持著Lck等蛋白的磷酸化平衡，避免Lck持續(xù)的超活化狀態(tài)[53-54]。CD45由胞外糖基化的可變結(jié)構(gòu)域、1個單次跨膜結(jié)構(gòu)域以及保守的胞內(nèi)的D1、D2結(jié)構(gòu)域組成，其中D1結(jié)構(gòu)域具有催化磷酸基團水解的半胱氨酸殘基，D2則不具有催化活性[55-56]。當(dāng)PTPRC基因發(fā)生改變以后，會導(dǎo)致可變剪接發(fā)生變化使CD45表達的亞型發(fā)生改變，這與多種自身免疫性疾病相關(guān)，如多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性肝炎等[2,57]，因此CD45也被視為十分有價值的治療自身免疫性疾病的靶點。此外，CD45表達水平下降也被發(fā)現(xiàn)在對抗埃博拉病毒和炭疽感染中具有一定的作用[58-59]。Perron等[16]先通過虛擬篩選得到了可能作用在D1、D2結(jié)構(gòu)域之間的化合物，從中發(fā)現(xiàn)了一個選擇性較好的苗頭化合物，進一步改造得到化合物14（IC50= 200 nmol · L-1）并在突變試驗中驗證了其結(jié)合位點，作者推測其可能通過該變構(gòu)位點影響CD45的構(gòu)象和活性，使Lck的pY393增加，活化態(tài)的Lck減少，阻斷TCR信號，遲發(fā)性過敏小鼠模型實驗表明，該化合物可減少炎癥反應(yīng)。

5 絲裂原激活蛋白激酶磷酸酶3變構(gòu)抑制劑

絲裂原激活蛋白激酶磷酸酶3（mitogen-activated protein kinase phosphatase 3，MKP-3）又稱為DUSP6，是一個廣泛存在的DSP家族的蛋白磷酸酶，除了解除酪氨酸的磷酸化，還可以對MAPK、ERK等的絲/蘇氨酸去磷酸化，其功能主要是負反饋調(diào)節(jié)成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）信號[60-62]。MKP-3作為RAS-ERK通路的抑制蛋白，其抑制劑目前主要被用于一些胚胎發(fā)育、免疫和FGF相關(guān)的研究[63-65]。盡管如此，也有一些文獻報道MKP-3可能促進腫瘤的產(chǎn)生[66-69]。目前MKP-3變構(gòu)抑制劑很少，Molina研究團隊通過轉(zhuǎn)基因斑馬魚構(gòu)建了體內(nèi)篩選模型，最終發(fā)現(xiàn)MKP-3抑制劑BCI（15，斑馬魚 FGFR 激活試驗 EC50為 10.6 μmol · L-1），該抑制劑能有效抑制ERK介導(dǎo)的MKP-3活化，從而抑制FGF信號，并發(fā)現(xiàn)其可能作用于催化位點旁的變構(gòu)位點上，隨后改造的 BCI-215（16，EC50= 12.0 μmol ·L-1）相較于BCI有著更低的細胞毒性[17-18]。2017年，Kaltenmeier等[70]發(fā)現(xiàn)BCI-215可以在MDABN-231人乳腺癌細胞中選擇性激活MAPK信號通路引起細胞壞死。

6 肝臟再生磷酸酶變構(gòu)抑制劑

肝臟再生磷酸酶（phosphatases of regenerating liver，PRL）主要有 PRL-1、PRL-2和 PRL-3等 3個亞型，分別由PTP4A1、PTP4A2、PTP4A3基因編碼[26]，三者基因序列高度相似[71]。有證據(jù)表明PRL在促進腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲過程中有重要的作用[72-75]，并在多種腫瘤中高表達[76]。由于PRL催化區(qū)十分平坦，沒有明顯的小分子結(jié)合口袋，并且與其他PTP家族蛋白的催化區(qū)高度相似，因此給PRL選擇性抑制劑的設(shè)計帶來挑戰(zhàn)。值得慶幸的是，PRL蛋白在細胞內(nèi)需要通過相互結(jié)合形成同源三聚體才能發(fā)揮促進細胞遷移的功能[75]，Bai等[19]根據(jù)這一特點，通過虛擬篩選的方法發(fā)現(xiàn)了作用在三聚體交界面的變構(gòu)抑制劑17，其在10 μmol · L-1濃度下可抑制PRL1過表達細胞增殖和遷移，能有效地在體外和小鼠移植瘤模型中抑制腫瘤生長；在共晶結(jié)構(gòu)中，其類似物Analog-3（18）與PRL1單體結(jié)合在三聚體的交界面上（見圖3）。

圖 3 化合物18與PRL1的三聚體交界面的結(jié)合模式[19]Figure 3 Binding mode of compound 18 to the trimer interface of PRL1 [19]

7 野生型p53誘導(dǎo)磷酸酶變構(gòu)抑制劑

野生型p53誘導(dǎo)磷酸酶1（wild-type p53-induced phosphatase 1，Wip1）是由PPM1D基因編碼的絲/蘇氨酸磷酸酶，可以負向調(diào)節(jié)DNA損傷應(yīng)答通路（DNA damage response pathway，DDR）上的關(guān)鍵蛋白，如p53等[77]。當(dāng)細胞因電離輻射、化療藥物而造成損傷時，細胞會啟動DNA損傷應(yīng)答通路來減緩細胞周期，修復(fù)DNA，或啟動細胞凋亡，從而維持基因組的穩(wěn)定。當(dāng)損傷修復(fù)結(jié)束后，細胞則通過蛋白磷酸酶停止DDR，其中PP2C絲/蘇氨酸磷酸酶家族在其中發(fā)揮著重要作用，Wip1就是由p53誘導(dǎo)產(chǎn)生的這一類磷酸酶[78]。目前在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)PPM1D基因擴增和Wip1過表達，因而Wip1抑制劑被認為能間接激活野生型p53[79-82]。

由于Wip1的結(jié)構(gòu)仍未完全解析出來，目前唯一報道的作用于催化位點之外的抑制劑是GSK2830371（19，對 Wip12-420的 IC50為 6 nmol · L-1）。Gilmartin等[20]通過酶活性試驗（以熒光素二磷酸酯為底物）和酶親和力試驗（利用DNA編碼化合物庫），分別采用生物化學(xué)和生物物理方法得到具有相似性的CAA（capped amino acid）小分子結(jié)構(gòu)，經(jīng)改造后得到GSK2830371；由于未能成功得到共晶結(jié)構(gòu)，他們采用了光親和標記試驗來驗證CAA分子的結(jié)合位點，再結(jié)合同源蛋白PPM1A的結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)CAA分子結(jié)合在Wip1催化位點外的一段可翻動的“flap”片段附近，該片段對催化有著重要作用，因此該抑制劑具有很好的特異性，并且在小鼠移植瘤模型中也能有效抑制B細胞淋巴瘤的生長。

8 蛋白磷酸酶調(diào)節(jié)亞基15A/15B變構(gòu)抑制劑

蛋白磷酸酶調(diào)節(jié)亞基15A（protein phosphatase 1 regulatory subunit 15A，PPP1R15A）和蛋白磷酸酶調(diào)節(jié)亞基15B（protein phosphatase 1 regulatory subunit 15B，PPP1R15B）是分別由PPP1R15A和PPP1R15B編碼的另一類蛋白絲/蘇氨酸磷酸酶——PPPs，這一亞家族的結(jié)構(gòu)與PPMs存在明顯的差異，由保守的催化亞基（catalytic subunit protein phosphatase 1，PP1c）和不同的調(diào)節(jié)亞基（如R15A或R15B）相結(jié)合而組成，眾多的調(diào)節(jié)亞基決定了全酶的細胞定位以及底物特異性。最早，Tsaytler等[21]發(fā)現(xiàn)了α2腎上腺素受體激動劑胍那芐（20，guanabenz，R15A-PP1c SPR 試驗：KD= 0.122 μmol · L-1）可以選擇性地結(jié)合在PPP1R15A上，干擾真核翻譯起始因子2-α亞基（eukaryotic translation initiation factor 2 subunit alpha，eIF2-α）的去磷酸化，增加磷酸化eIF2-α的水平可以短暫減緩蛋白質(zhì)的合成，有利于分子伴侶對蛋白質(zhì)正確折疊，維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。隨后，該團隊的Das等[22]進一步開發(fā)了PPP1R15A選擇性抑制劑sephin1（21，又名IFB-088，KD=0.786 μmol · L-1），并在小鼠中預(yù)防了 2 種蛋白錯誤折疊相關(guān)疾病——腓骨肌萎縮癥（charcot-marietooth disease）和肌萎縮性側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis）。2018年，Krzyzosiak等[23]報 道了在體外構(gòu)建的一種以表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)為基礎(chǔ)的篩選平臺，使用更為完整的PP1c-R15A/B 蛋白來測試小分子和酶之間的親和力，并篩選得到PPP1R15B選擇性抑制劑raphin1（22，R15B-PP1c SPR試驗：KD= 0.033 μmol · L-1），該化合物可口服且可跨越血腦屏障，在亨廷頓舞蹈癥（Huntington's disease）小鼠模型中證實對疾病有潛在的預(yù)防作用。

9 缺眼同源蛋白2變構(gòu)抑制劑

Eya最早被發(fā)現(xiàn)是作為轉(zhuǎn)錄因子Six1的共激活因子，二者在胚胎發(fā)育和細胞增殖中有重要的作用，正常成人組織的Eya幾乎不表達，但在腫瘤中發(fā)現(xiàn)Six1和Eya復(fù)合物的高表達[83-87]。高表達的Six1和缺眼同源蛋白2（eyes absent homolog 2，Eya2）可以增加腫瘤的侵襲性[85,88]，縮短患者的生存期[89]。目前發(fā)現(xiàn)的可以被Eya去磷酸化的蛋白有組蛋白H2AX、雌激素受體 β（estrogen receptor β，ER-β）和含WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白1（WD repeat-containing protein 1，WDR1），因此人們將Eya視為潛在的抗腫瘤藥物靶點基于以下幾種可能：當(dāng)DNA受到損傷時，Eya的磷酸酶活性可以使組蛋白H2AX去磷酸化，從而使細胞進行DNA修復(fù)而不進入凋亡[90-91]，使用Eya抑制劑可能有助于增加患者對放化療的敏感性；磷酸化的ER-β具有一定的抑制腫瘤生長的作用，高表達Eya會使ER-β失去這一作用[92]，Eya抑制劑可能可以恢復(fù)ER-β的磷酸化水平；WDR1則與細胞骨架相關(guān)，可能影響細胞的侵襲性，但具體機制尚不明確。

Eya是一類經(jīng)典的非巰基催化的蛋白磷酸酶（non-thiol-based protein phosphatases），屬于鹵酸脫鹵酶家族，該家族通過天冬氨酸而非半胱氨酸催化去磷酸化[93]。Krueger等[25]通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)一類可以選擇性抑制Eya2的化合物，其中一些化合物在高濃度Mg2+下仍具有非競爭性的酶動力學(xué)特征，隨后突變試驗發(fā)現(xiàn)化合物MLS000544460（23，對 Eya2253-538的 IC50為 4.1 μmol · L-1）可能并不作用在催化位點上。最近，該團隊合成了溶解性更好的類似物NCG00249987（24，對Eya2253-538的IC50為3.0 μmol · L-1），并通過晶體結(jié)構(gòu)驗證了其變構(gòu)結(jié)合位點，占據(jù)該變構(gòu)位點會導(dǎo)致催化位點的β1-α1 loop（274-282）位置偏移，使得Mg2+難以與催化位點結(jié)合（見圖4），從而抑制Eya2的活性，降低腫瘤細胞的侵襲性[24]。

圖 4 化合物24與Eya2變構(gòu)位點的結(jié)合模式[24]Figure 4 Binding mode of compound 24 to Eya2 allosteric site [24]

10 總結(jié)與展望

隨著對蛋白磷酸酶研究的深入，人們更加深刻地認識到蛋白磷酸酶和蛋白激酶之間維系的磷酸化平衡在疾病中的重要作用，蛋白磷酸酶也不僅僅只發(fā)揮下調(diào)磷酸化信號的作用，異常的蛋白磷酸酶在不同環(huán)境下上調(diào)或下調(diào)磷酸化信號都可能導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。目前，蛋白激酶小分子抑制劑已有許多被批準用于臨床治療，相比之下，蛋白磷酸酶抑制劑的藥物研發(fā)進展則十分緩慢，大多數(shù)進展較快的蛋白磷酸酶抑制劑仍然處于臨床實驗階段[94]。變構(gòu)抑制劑的出現(xiàn)，可以避開高度保守的蛋白磷酸酶催化位點，不僅提高小分子對特定蛋白磷酸酶的選擇性，還可以減小分子的極性和電荷，提高溶解性、滲透性和生物利用度，因此為了攻克蛋白磷酸酶抑制劑“不可成藥”的難題，蛋白磷酸酶變構(gòu)抑制劑藥物也被寄予厚望。除了本文提到的蛋白磷酸酶，仍有許多蛋白磷酸酶可能存在變構(gòu)位點且尚未被充分研究，也有一些非競爭性抑制劑的作用位點尚未確證。在本文介紹的變構(gòu)抑制劑中，人們采用多種方法對蛋白磷酸酶的變構(gòu)位點進行開發(fā)，除了酶動力學(xué)分析和酶選擇性篩選，NMR、關(guān)鍵殘基突變試驗、分子對接（docking）以及小分子蛋白質(zhì)共晶結(jié)構(gòu)解析等諸多方法均有涉及，這些方法也為發(fā)現(xiàn)新的蛋白磷酸酶變構(gòu)位點提供參考。由于開發(fā)新位點需要非常多的驗證工作，蛋白磷酸酶變構(gòu)抑制劑的研究往往是機遇與挑戰(zhàn)并存，如同十幾年前開始研究蛋白激酶藥物一樣，對蛋白磷酸酶變構(gòu)抑制劑的研究也許意味著正在打開蛋白磷酸化調(diào)控的另一個“寶箱”。