趙躍麗，饒 清，孫強(qiáng)明，張?zhí)m勝

(1. 大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理 671000； 2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118； 3. 云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650118)

諾如病毒(Norovirus，NoV)是一種RNA病毒，該病毒無包膜、單鏈、正向，其基因組長(zhǎng)度為7.5～7.7 kb，病毒顆粒直徑長(zhǎng)27～40 nm，屬于杯狀病毒(Caliciviridae)，其基因(小鼠NoV除外)包含3個(gè)編碼不同功能蛋白的開放閱讀框(ORF1,2,3)[1]。ORF1主要編碼6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，從N端依次到C端編碼的蛋白質(zhì)分別為p48、NTPase、p22、VPg、3CLpro、RdRp[2]；該病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1和次要結(jié)構(gòu)蛋白VP2分別由ORF2和ORF3編碼[3]。根據(jù)其主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1的氨基酸同源性的不同，NoV主要?jiǎng)澐譃?個(gè)基因型(GⅠ～VⅡ)，其中以GⅡ基因型最常見[4]。5歲以下兒童中絕大部分胃腸炎的暴發(fā)均與NoV GⅡ有關(guān)，流行范圍和其易感性僅次于輪狀病毒，疫情又常在幼托機(jī)構(gòu)和小學(xué)低年級(jí)中發(fā)生[5]。由于NoV GⅡ傳染性強(qiáng)，其新變種每2～4年出現(xiàn)一次，且極易引起全球性的暴發(fā)流行，給全球公共衛(wèi)生事業(yè)帶來了沉重的疾病負(fù)擔(dān)。通過感染患者糞便或嘔吐物產(chǎn)生的氣溶膠，或間接接觸被感染患者排泄物污染的環(huán)境均可使NoV GⅡ發(fā)生二次傳播，甚至在不同物種間NoV GⅡ也有發(fā)生傳播的可能[6-7]，因此，研究和開發(fā)敏感、可靠、標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)室病毒定量檢測(cè)方法，對(duì)有效防治NoV GⅡ具有重要意義。

為建立一種快速的NoV GⅡ拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒及其檢測(cè)體系，本試驗(yàn)通過BioEdit對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的所有NoV GⅡ株全基因序列進(jìn)行比對(duì)，選取同源性好且高度保守的片段構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照質(zhì)粒，根據(jù)構(gòu)建的NoV GⅡ標(biāo)準(zhǔn)品基因序列設(shè)計(jì)其特異性檢測(cè)引物，優(yōu)化反應(yīng)體系，最終建立一種用于檢測(cè)NoV GⅡ拷貝數(shù)的逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)體系，準(zhǔn)確快速地定量檢測(cè)臨床糞便標(biāo)本的病毒拷貝數(shù)，為臨床診斷及治療提供重要參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料 病毒RNA提取試劑盒購(gòu)于Qiagen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)于天根(TIANGEN)生化科技(北京)有限公司，熒光定量試劑ALL-in-OneTM qPCR Mix試劑盒購(gòu)于復(fù)能基因有限公司(GeneCopoeia)，loading buffer、PCR MIX購(gòu)于日本TaKaRa公司。4份兒童腹瀉糞便標(biāo)本來自于2018年12月昆明市兒童醫(yī)院。

1.2 NoV GⅡ標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒與特異性引物 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載所有NoV GⅡ株全基因序列，用BioEdit進(jìn)行全基因序列比對(duì)，選取同源性好、高度保守、大小為500 bp的片段為標(biāo)準(zhǔn)品并克隆到載體pUC57上，且根據(jù)該片段設(shè)計(jì)特異性引物。普通PCR上游引物CoG2F：5’-CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG-3’，普通PCR下游引物G2-SKR：5’-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3’；q-PCR上游引物G2F：5’-GAATGAAGATGGCGTCGAGTG-3’，q-PCR下游引物G2R：5’-CCAAAT GGGAAAGGTAGGGAT-3’，標(biāo)準(zhǔn)品片段與引物由昆明碩擎生物科技公司合成。

1.3 腹瀉糞便標(biāo)本病毒核酸(RNA)提取 依據(jù)QIAamp公司病毒RNA提取試劑盒的說明書，按操作流程處理分裝的糞便標(biāo)本，最后用50 μL DEPC H2O溶解所提取的RNA，靜置2 min后離心收集提取的RNA。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 使用天根公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，參考試劑盒說明書采用20 μL 體系。反應(yīng)體系分為兩步，首先取2 μL 5×gDNA Buffer(5×gDNA Buffer含有高效去除基因組DNA的gDNase，可以去除gDNA，有效避免Total RNA中基因組的干擾)，加8 μL RNA至反應(yīng)管中，充分混勻，短暫離心42℃孵育3 min后置于冰上；其次取2 μL 10×King RT Buffer、1 μL FastKing RT Enayme Mix、2 μL FQ-RT Primer Mix、5 μL RNase-Free ddH2O加入第一步反應(yīng)液中，充分混勻，短暫離心后42℃孵育15 min，95℃孵育3 min，置于4℃終止反應(yīng)。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的擴(kuò)增 合成的標(biāo)準(zhǔn)品片段連接至載體PUC57上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH-5α，挑單個(gè)獨(dú)立菌落接種至5 mL液體培養(yǎng)基中，加入氨芐西林(100 μg/mL)5 μL，置于搖床震搖14 h，使用天根生化科技(北京)有限公司的質(zhì)粒小量提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取質(zhì)粒的濃度(ng/μL)，并按下式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒與糞便標(biāo)本的驗(yàn)證 將擴(kuò)增的質(zhì)粒稀釋100倍和糞便標(biāo)本cDNA同時(shí)進(jìn)行普通PCR驗(yàn)證，采用25 μL反應(yīng)體系，包括上、下游引物各1 μL， ddH2O 8.5 μL，Mix 12.5 μL，稀釋的質(zhì)粒和標(biāo)本cDNA原液2 μL，充分混勻，短暫離心，放入PCR儀中。擴(kuò)增程序如下：98℃預(yù)變性2 min，98℃10 s，56℃ 30 s,72℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物5 μL加入1%的瓊脂糖凝膠的上樣孔中，采用120 V的電壓進(jìn)行電泳。將出現(xiàn)目的條帶的PCR產(chǎn)物送至昆明碩擎生物科技公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將擴(kuò)增的NoV GⅡ標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒用ddH2O按梯度從10-1稀釋至10-7濃度，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)，反應(yīng)體系選擇10 μL，包括qPCR Mix 5 μL(qPCR Mix是含有SYBR○R Green染料的即用型預(yù)混液)，ddH2O 3 μL， q-PCR上、下游引物各0.5 μL，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒1 μL，同時(shí)設(shè)3個(gè)陰性對(duì)照孔，以ddH2O作為陰性對(duì)照。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 5 min，95℃ 10 s，56℃ 20 s，72℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；65℃ 5 s，95℃ 50 s。以獲得的NoV GⅡ標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的溶解峰與擴(kuò)增曲線，繪制NoV GⅡ標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線Y軸是RT-qPCR檢測(cè)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒Ct值，X軸為計(jì)算求得的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒拷貝數(shù)log10，NoV GⅡ標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。

1.8 病毒拷貝數(shù) 對(duì)上述1.6獲得的并且與BLAST對(duì)比確定為GⅡ陽(yáng)性的糞便標(biāo)本，隨機(jī)抽取4份糞便標(biāo)本的RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量PCR，獲得Ct值，再根據(jù)NoV GⅡ標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線和求得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算獲得糞便上清標(biāo)本中NoV GⅡ的拷貝數(shù)。定量PCR以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照組，ddH2O作為陰性對(duì)照組。

2 結(jié)果

2.1 普通PCR驗(yàn)證結(jié)果 將4份糞便標(biāo)本普通PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖和序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果確定標(biāo)本中含GⅡ組NoV。糞便標(biāo)本NoV GⅡ PCR產(chǎn)物電泳及序列比對(duì)結(jié)果見圖1、2。

Maker為分子量標(biāo)準(zhǔn)；標(biāo)本1、2、3、4為糞便標(biāo)本。

圖2 糞便標(biāo)本NoV GⅡ序列對(duì)比圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的擴(kuò)增與驗(yàn)證結(jié)果 采用質(zhì)粒小量提取試劑盒按說明書操作步驟提取擴(kuò)增的NoV GⅡ標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度為321.25 ng/μL，再將NoV GⅡ標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒稀釋100倍后進(jìn)行普通PCR取其擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳。見圖3A。將擴(kuò)增的NoV GⅡ標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒取4 μL與其普通PCR產(chǎn)物送至昆明碩擎生物科技公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在BLAST上進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明質(zhì)粒嵌合序列與設(shè)計(jì)序列100%吻合。見圖3B。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖 根據(jù)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線，可直接獲得各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒相應(yīng)的Ct值，并按照公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)。NoV GⅡ標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線與溶解曲線見圖4。

A：標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的電泳圖；B：標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒測(cè)序峰。

使用紫外分光光度計(jì)測(cè)得NoV GⅡ標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度為321.25 ng/μL，DNA長(zhǎng)度為3 653 bp，按照公式計(jì)算獲得其拷貝數(shù)為8.15×1010copies/μL，NoV GⅡ標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)的log10值見表1。以RT-qPCR檢測(cè)所獲得的NoV GⅡ標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)log10作為X軸，其Ct值作為Y軸，繪制NoV GⅡ標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可求得為Y=-3.972X+39.03，R2=0.991，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。

圖4 NoV GⅡ標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線與溶解曲線

表1 NoV GⅡ標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒檢測(cè)結(jié)果

圖5 NoV GⅡ標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 糞便標(biāo)本測(cè)序分型及其拷貝數(shù) 4份糞便標(biāo)本進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)獲得相應(yīng)的Ct值，且各Ct分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，將熒光定量PCR產(chǎn)物送至昆明碩擎生物科技公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站上的BLAST進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果及序列見表2，與普通PCR結(jié)果一致。4份糞便標(biāo)本NoV GⅡ檢測(cè)結(jié)果曲線為，標(biāo)本1：Y=-3.152X+23.45，R2=0.95；標(biāo)本2：Y=-2.730X+26.33，R2=0.96；標(biāo)本3：Y=-3.075X+23.63，R2=0.96；標(biāo)本4：Y=-2.166X+29.14，R2=0.89。見圖6、7。4份糞便標(biāo)本原液病毒拷貝數(shù)分別為30 443.45、9 468.40、53 176.69、4 493.12 copies/μL，標(biāo)本原液及稀釋液NoV GⅡ拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果見表3。對(duì)標(biāo)本稀釋后進(jìn)行NoV GⅡ拷貝數(shù)檢測(cè)，最低可以檢測(cè)的拷貝數(shù)為24.66 copies/μL。

表2 4份糞便標(biāo)本的分型及其序列

圖6 糞便標(biāo)本3熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

圖7 4份糞便標(biāo)本熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果曲線圖

表3 糞便標(biāo)本原液及各稀釋度中 NoV GⅡ拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果

3 討論

NoV GⅡ感染性腹瀉在全世界范圍內(nèi)均有流行，可以感染所有人群，甚至威脅5歲以下兒童、60歲以上老人和有潛在疾病患者的生命，因此接種疫苗對(duì)這一人群非常有益。目前，還沒有獲得被批準(zhǔn)的可以預(yù)防和治療NoV感染的疫苗，其中NoV基因型的多樣性、抗原漂移突變、不能在體外細(xì)胞培養(yǎng)中生長(zhǎng)和缺乏合適的動(dòng)物模型等是阻礙疫苗研究的主要因素[8-12]。近年來，我國(guó)北京、上海、香港等多地發(fā)生多起NoV感染暴發(fā)，暴發(fā)程度僅次于輪狀病毒，絕大多數(shù)暴發(fā)主要是由NoV GⅡ基因型引起，并且隨著時(shí)間的推移NoV疫情不斷上升、加重，給我國(guó)的醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)造成了嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān)[13-16]。因此，尋找早期診斷NoV GⅡ感染的方法，對(duì)于其感染控制和臨床治療具有十分重要的意義。目前，雖然RT-PCR是NoV GⅡ主要的診斷方法，但是RT-PCR在操作過程中易發(fā)生交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性，需要測(cè)序才能確定病毒類型，并且對(duì)于檢測(cè)病毒含量低的標(biāo)本靈敏度低，不能進(jìn)行定量測(cè)定無法獲得病毒的拷貝數(shù)，不利于對(duì)患者感染程度進(jìn)行判斷[17]。因此，研究開發(fā)敏感、可靠、標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)室NoV GⅡ定量檢測(cè)方法對(duì)有效防治NoV GⅡ具有重要意義。本試驗(yàn)在擴(kuò)增曲線中設(shè)定了熒光閾值，只有熒光RFU值高于閾值才有相應(yīng)的拷貝數(shù)結(jié)果，在擴(kuò)增結(jié)束后設(shè)定了溶解曲線程序，只有擴(kuò)增產(chǎn)物是目的片段時(shí)，擴(kuò)增曲線的溶解曲線才單一且與溶解值一致，通過以上方法排除假陽(yáng)性。本試驗(yàn)方法能在感染早期NoV含量低的標(biāo)本中，快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出NoV，并通過定量測(cè)定獲得病毒的拷貝數(shù)，從而對(duì)患者感染程度作出準(zhǔn)確判斷，指導(dǎo)用藥劑量及其用藥療程，還可以對(duì)重病患者的病程發(fā)展情況進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，為患者的臨床治療及預(yù)后判斷提供了一種有效的檢驗(yàn)方法。

本研究通過對(duì)NoV GⅡ基因組序列進(jìn)行分析，針對(duì)VP1衣殼蛋白高度保守序列片段設(shè)計(jì)擴(kuò)增特異性引物，此引物在試驗(yàn)中顯示出較高的敏感性。選取VP1衣殼蛋白高度保守序列片段引物區(qū)序列500 bp，構(gòu)建NoV GⅡ標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=-3.972X+39.03，R2=0.991。試驗(yàn)中相應(yīng)濃度的Ct值差異較小，且在誤差范圍內(nèi)，證明該方法的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性都較好，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)試驗(yàn)標(biāo)本中的NoV GⅡ進(jìn)行絕對(duì)定量。對(duì)4份2018年12月來自于云南省昆明市兒童醫(yī)院的NoV GⅡ感染患者的糞便標(biāo)本分別進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程獲得相應(yīng)的糞便標(biāo)本拷貝數(shù)。通過試驗(yàn)驗(yàn)證，該標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒具有較高的敏感性，并且可對(duì)標(biāo)本中NoV GⅡ進(jìn)行定量測(cè)定，為疾病的預(yù)防控制和相關(guān)試驗(yàn)研究提供了有效的定量檢測(cè)方法。