王珍珍，趙戰(zhàn)勤，常永超，王瑞麗，薛 云

(1. 河南科技大學臨床醫(yī)學院 河南科技大學第一附屬醫(yī)院，河南 洛陽 471003； 2. 河南科技大學醫(yī)學技術與工程學院，河南 洛陽 471003； 3. 河南科技大學動物科技學院，河南 洛陽 471003)

碳青霉烯類抗生素是治療臨床革蘭陰性桿菌感染的最后一道防線。耐碳青霉烯類革蘭陰性菌的產(chǎn)生及全球性的播散，使得臨床抗感染藥物的選擇面臨巨大的挑戰(zhàn)[1]。碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因是產(chǎn)碳青霉烯酶水解相應抗生素，最主要的碳青霉烯酶有五大類[2]，包括KPC、NDM、IMP、VIM和OXA-48，其中最常見的是由blaKPC同位基因編碼的A類絲氨酸類酶KPC(Klebsiellapneumoniaecarbapenemase)[3]。2003年美國YIGITH等在一株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenemas-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)中首次發(fā)現(xiàn)了blaKPC基因[4]，并將其歸類于A類絲氨酸水解酶，命名為KPC-1。2003年YIGITH等[5]在一株臭鼻克雷伯耐藥菌株上發(fā)現(xiàn)了第二個blaKPC(blaKPC-2)基因，與blaKPC-1相比，在編碼區(qū)520 bp處發(fā)生點突變，表現(xiàn)出單個氨基酸的改變(S174G)。隨后世界各地相繼發(fā)現(xiàn)了blaKPC的其他亞型，目前已知blaKPC至少存在18種亞型，共有20個位點的堿基突變(13個氨基酸改變)，其中只有1個變異體有6個堿基缺失(KPC-14，核苷酸位置：722～727 bp)，其他基因亞型之間均表現(xiàn)在單個堿基的突變[6-7]，KPC-2和KPC-3是世界范圍內廣泛傳播的碳青霉烯酶。

為減少耐藥菌株的水平傳播，臨床須對攜帶該類菌株的患者進行單獨管理[8]。然而目前，發(fā)展中國家絕大多數(shù)醫(yī)院缺乏相應的強化感染控制措施(intensive infection control measures ICMs)。對于碳青霉烯耐藥的檢測只是局限在表型耐藥，并未深入分析耐藥的分子機制及其傳播規(guī)律。中國各地報道的耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌的臨床耐藥性及碳青霉烯酶的分布表現(xiàn)出地域差異[9-12]。本研究基于河南科技大學第一附屬醫(yī)院兩個院區(qū)2017年1月—2018年12月獲得的臨床分離株，分析碳青霉烯耐藥菌株臨床分布特點，重點追蹤blaKPC基因及其亞型流行規(guī)律，為臨床對碳青霉烯類耐藥菌株的綜合防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株來源 2017年1月—2018年12月河南科技大學第一附屬醫(yī)院兩個院區(qū)臨床送檢的各種標本檢出的耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌。耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌的判斷標準嚴格遵守美國疾病控制與預防中心的最新定義[13]，細菌對亞胺培南、美羅培南或厄他培南中至少一種耐藥，耐藥判斷依據(jù)為2017版臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)指南[14]，腸桿菌科細菌耐藥最低抑菌濃度(MIC)值：亞胺培南≥4 μg/mL和(或)美羅培南≥4 μg/mL和(或)厄他培南≥2 μg/mL；非腸桿菌科細菌中銅綠假單胞菌和不動桿菌屬對亞胺培南或美羅培南至少一種抗菌藥物耐藥(亞胺培南≥8 μg/mL和(或)美羅培南≥8 μg/mL)；其他非腸桿菌科細菌對亞胺培南或美羅培南中至少一種耐藥(亞胺培南≥16 μg/mL和(或)美羅培南≥16 μg/mL)。質控菌株購于衛(wèi)生部臨床檢驗中心：肺炎克雷伯菌ATCC 700603、銅綠假單胞菌ATCC 27853。

1.1.2 主要儀器及試劑 Micoscan Walkaway 960(德國西門子)、VITEK 2 Compact全自動細菌藥敏分析儀(法國生物梅里埃)、PCR 擴增儀(杭州博日公司) 、電泳儀(珠海黑馬公司)、凝膠成像儀(上海歐翔科學儀器有限公司)、PCR反應試劑盒、擴增引物、mix及DNA marker[生工生物工程(上海)有限公司]、血平板和中國藍平板(安圖生物有限公司)、低電滲瓊脂糖(徐州微科曼得公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)鑒定及藥物敏感試驗 按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第4版進行常規(guī)細菌培養(yǎng)、分離。采用Micoscan Walkaway 960和VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析儀進行菌株鑒定及藥敏試驗。藥物敏感試驗結果判定依據(jù)CLSI 2017年標準[14]。

1.2.2 DNA模板制備 無菌采集分離株，取適量接種于血平板上，37℃培養(yǎng)24 h。挑選3～5個單個菌落置于200 μL的無菌ddH2O中，充分振蕩、混勻，置于100℃金屬加熱器中煮沸15 min，立即冰浴10 min，經(jīng)15 000 r/min低溫離心10 min，取上清，-20℃保存待用。

1.2.3 耐藥基因的檢測 采用聚合酶鏈反應(PCR)分別對blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM和blaOXA-48基因進行擴增。PCR反應體系為：總體積25 μL，其中Master Mix (2×) 12.5 μL，上游引物、下游引物、DNA模版各1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件為：94℃預變性2 min，94℃變性30 s；55℃退火30 s；72℃模板延伸30 s；共36個循環(huán)；72℃延伸10 min。取擴增產(chǎn)物10 μL通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳30 min，最終在凝膠成像儀上觀察結果。引物序列見表1，引物合成及PCR產(chǎn)物序列測定由生工生物工程(上海)完成。

表1 耐藥基因PCR引物序列及產(chǎn)物長度

2 結果

2.1 菌株分布 2017年1月—2018年12月河南科技大學第一附屬醫(yī)院兩個院區(qū)送檢的各類臨床標本中共檢出耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌510株，其中耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(CRE)420株、非腸桿菌科細菌90株，菌種分布見表2。耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌主要來自重癥監(jiān)護病房(ICU)、神經(jīng)外科和呼吸科，分別占60.8%、11.8%、5.3%；標本來源主要為痰、膿性分泌物、靜脈血、無菌中段尿，分別占66.9%、8.8%、8.2%、6.5%；患者年齡≥50歲者占71.6%；住院日數(shù)≥15 d者占79.8%。

表2 510株耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌菌種分布

表3 510株耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌對常見抗菌藥物的耐藥情況

2.3 耐藥基因檢測結果 420株CRE中，耐藥基因檢出率56.7%，blaKPC攜帶率為54.3%。228株攜帶blaKPC菌株中，肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌、大腸埃希菌分別占83.8%(191株)、11.8%(27株)、2.6%(6株)；另外在1株陰溝腸桿菌、1株摩根摩根菌、1株弗勞地檸檬酸桿菌、1株住泉沙雷菌中也檢出blaKPC基因；blaNDM攜帶率1.2%(5/420)，檢出菌為陰溝腸桿菌(2株)、大腸埃希菌(1株)、肺炎克雷伯菌(1株)、鮑曼不動桿菌(1株)；blaIMP攜帶率1.4%(6/420)，檢出菌為克雷伯菌(4株)、摩氏摩根菌(1株)、陰溝腸桿菌(1株)；未發(fā)現(xiàn)VIM和OXA-48型耐藥基因。90株非發(fā)酵菌中，僅2株鮑曼不動桿菌檢出攜帶blaKPC基因，暫未發(fā)現(xiàn)其他菌種攜帶碳青霉烯耐藥基因，部分陽性PCR結果見圖1。

M為DNA Marker，1—2為NDM陽性，3—4為KPC陽性，5—6為IMP陽性。

2.4blaKPC亞型檢測結果 對攜帶blaKPC基因的172株CRE和2株鮑曼不動桿菌進行基因測序比對分析，結果顯示173株為KPC-2型菌株，1株為KPC-1型菌株，未發(fā)現(xiàn)blaKPC的其他基因亞型。其中blaKPC-1由肺炎克雷伯菌攜帶，該blaKPC-1基因在blaKPC-2(AY210886)原始DNA序列的520 bp處發(fā)生突變，暫未發(fā)現(xiàn)其他位點的堿基突變。見圖 2。

KPC-2與KPC-1在520 bp處有基因G-A的突變。

3 討論

碳青霉烯類抗生素是治療產(chǎn)AmpC酶和超廣譜β-內酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases, ESBLs)菌株的臨床治療藥物，隨著該類藥物的過渡使用，其耐藥范圍也從歐洲發(fā)達國家發(fā)展到中國及非洲的發(fā)展中國家[17]。本研究結果顯示，該院分離的耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌以CRE為主(82.4%)，其中肺炎克雷伯菌占CER的69.8%。耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌多集中在ICU(60.8%)和神經(jīng)外科(11.8%)，年齡多在50歲及以上(71.6%)，與國內研究[18]報道一致?；仡櫺苑治龌颊叩募韧钒l(fā)現(xiàn)，大部分耐藥菌感染患者存在嚴重的原發(fā)疾病，如顱腦損傷，嚴重心腦血管疾病，住院日數(shù)大多≥15 d(79.8%)，并且長期接受廣譜抗菌藥物的治療，說明嚴重原發(fā)疾病、患者的健康狀態(tài)以及廣譜抗菌藥物的使用，都是耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌的重要危險因素，提示臨床應注意合理使用抗菌藥物，避免超適應證給藥。本研究表明，耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌可分離自痰、血、尿、腹腔等，說明耐藥菌株引起的感染并不僅局限于呼吸系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)，還能引起血液、腹腔、顱內等多部位感染，其感染的廣泛性應引起臨床重視。

我國流行的碳青霉烯酶主要是KPC、NDM和IMP，其中以KPC酶最常見。本研究結果顯示，420株CRE中，耐藥基因攜帶率56.7%，其中228株攜帶blaKPC基因，5株攜帶blaNDM基因，6株攜帶blaIMP基因，試驗結果以KPC酶為主。blaKPC攜帶率占前三位的菌株分別為肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌和大腸埃希菌，其中肺炎克雷伯菌是攜帶blaKPC的優(yōu)勢菌群，與中國其他地區(qū)[25]報道一致。90株非腸桿菌科細菌碳青霉烯酶攜帶率為2.2%，且均為KPC酶，這說明非腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制或攜帶的碳青霉烯酶種類有所不同，這將在下一步研究中繼續(xù)闡明。該研究中，高比例的產(chǎn)氣腸桿菌對blaKPC的攜帶，顯示出產(chǎn)KPC酶的本院特征與地域差異，但因本研究尚未覆蓋其他少見基因如blaGES、blaIMI等，因此具有一定局限性。本研究數(shù)據(jù)表明，KPC酶不僅局限于肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌、大腸埃希菌等，在陰溝腸桿菌、住泉沙雷菌等菌株中也檢測出blaKPC基因的攜帶。2株鮑曼不動桿菌對blaKPC的攜帶說明blaKPC不僅局限在CRE中，在不同種屬之間也能水平傳播。

KPC-2是世界上最廣泛流行的碳青霉烯酶。國際流行ST258，而我國最常見的是攜帶blaKPC-2的ST11型肺炎克雷伯菌[25]。肺炎克雷伯菌具有獲得耐藥基因，并將其遺傳的強大能力，可能是肺炎克雷伯菌成為最主流的攜帶菌攜帶blaKPC菌株的原因?；驕y序結果表明174株攜帶blaKPC菌株中，僅1株肺炎克雷伯菌攜帶blaKPC-1，其他均為KPC-2型菌株，表明該院blaKPC-2占據(jù)blaKPC的主導地位。KPC家族有四個突變熱點，其中氨基酸殘基237位、239位影響酶的活性[26-27]。本研究基因測序結果顯示，所有blaKPC-2的堿基序列一致，并未發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)非突變熱點的其他變異部位，說明blaKPC-2來源單一，推測KPC耐藥基因可能有共同的克隆來源。試驗結果以攜帶blaKPC-2的肺炎克雷伯菌為主，與中國其他地區(qū)的報道一致[25]。

碳青霉烯類抗生素耐藥給患者治療帶來嚴重壓力，病死率極高，是全國乃至全世界所面臨的巨大挑戰(zhàn)。本研究是單中心研究，涉及的標本量偏少，不能覆蓋整個洛陽地區(qū)耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌的流行情況，單從現(xiàn)有的研究結果來看，本研究是洛陽地區(qū)首次報告碳青霉烯類耐藥菌株的臨床數(shù)據(jù)，包含了腸桿菌科細菌和非腸桿菌科細菌的表型耐藥及分子耐藥數(shù)據(jù)，對臨床耐藥菌管理、控制及抗菌藥物使用有一定指導意義。該地區(qū)耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌與河南其他地區(qū)相比具有相似性，其流行均高于國家水平。碳青霉烯類抗生素耐藥機制以產(chǎn)KPC為主，也可見少量金屬酶NDM和IMP，且對大多數(shù)抗菌藥物耐藥，因此，對碳青霉烯類耐藥菌株的管理應更加嚴謹，防止其暴發(fā)流行。