陳志超,劉云鵬,徐慶陽(yáng),陳 寧

(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津 300457)

支鏈氨基酸(BCAAs),即L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-纈氨酸,是哺乳動(dòng)物體內(nèi)不可合成的必需氨基酸[1],對(duì)其生理功能和代謝具有重要作用。BCAAs用于食品、藥品和化妝品中,是抗生素和除草劑的前體,在飼料添加劑中也有廣泛應(yīng)用[2]。與其他氨基酸一樣,BCAAs也是由誘變或代謝工程改造的谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)或大腸桿菌(Escherichiacoli)發(fā)酵而成[3-4]。

化學(xué)法生產(chǎn)BCAAs,需要經(jīng)過(guò)化學(xué)衍生、色譜分離和酶處理對(duì)映體等步驟,除考慮合成工藝條件外,還要考慮異構(gòu)體的拆分與D-異構(gòu)體的消旋利用,多重因素導(dǎo)致化學(xué)法生產(chǎn)支鏈氨基酸成本高、難度大。隨著對(duì)BCAAs需求的增加,對(duì)生產(chǎn)成本與生產(chǎn)效率的要求隨之提高,發(fā)酵法因經(jīng)濟(jì)性、環(huán)境友好性、產(chǎn)物純度高和產(chǎn)量大等優(yōu)勢(shì)而備受關(guān)注。早期,大多數(shù)BCAAs生產(chǎn)菌株是通過(guò)隨機(jī)誘變分離得到的,但是隨機(jī)誘變方法將遺傳變異分布在基因組的各個(gè)部位,使有益突變很難篩選,遺傳性狀不穩(wěn)定,導(dǎo)致產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率很難提高。代謝工程育種是指以生物化學(xué)和遺傳學(xué)為基礎(chǔ),研究代謝產(chǎn)物的生物合成途徑和代謝調(diào)節(jié)的機(jī)制,通過(guò)遺傳育種技術(shù)獲得解除或繞過(guò)了微生物正常代謝途徑的基因工程菌株,從而人為使有用產(chǎn)物選擇性大量合成積累。近年來(lái),人們通過(guò)合理的基因工程技術(shù)培育出了產(chǎn)氨基酸菌株,例如通過(guò)過(guò)表達(dá)目標(biāo)氨基酸的合成基因。系統(tǒng)代謝工程在基因組水平分析代謝流[5],能幫助研究人員優(yōu)化碳通量向目標(biāo)氨基酸合成[6]。與經(jīng)典誘變育種相比,代謝工程育種可以通過(guò)針對(duì)性的菌株改造來(lái)獲得目的產(chǎn)物,大大提高了育種效率與產(chǎn)量。筆者綜述了BCAAs的生物合成途徑及其在微生物中的調(diào)控作用,特別是谷氨酸棒桿菌,它是放線菌科的一種非致病性革蘭氏陽(yáng)性菌,廣泛用于氨基酸和核苷酸的工業(yè)化生產(chǎn),也概述了用于生產(chǎn)BCAAs的微生物菌株的發(fā)展。

1 支鏈氨基酸合成調(diào)控

1.1 乙酰乳酸合酶與蘇氨酸脫氫酶

乙酰乳酸合酶(乙酰羥基酸合酶,AHAS)由ilvBN編碼,是支鏈氨基酸合成的第一個(gè)關(guān)鍵酶。AHAS能催化生成2-乙酰乳酸和2-乙酰-2-羥基丁酸,它們分別是L-亮氨酸/L-纈氨酸和L-異亮氨酸的間接前體物,該反應(yīng)的起始原料為丙酮酸和2-酮丁酸。丙酮酸由糖酵解(EMP)途徑提供,2-酮丁酸由L-蘇氨酸通過(guò)ilvA編碼的蘇氨酸脫氫酶(TDH)合成,TDH受到L-異亮氨酸反饋抑制[7],而L-纈氨酸可以恢復(fù)TDH的活性[8]。AHAS由大亞基和小亞基組成,分別由ilvB和ilvN編碼,AHAS的小亞基負(fù)責(zé)所有3種BCAAs的多價(jià)調(diào)控[9]。與C.glutamicum不同,有些細(xì)菌有幾種AHAS的亞型,例如,大腸桿菌有3個(gè)同工酶AHAS Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ,分別由ilvBN,ilvGM和ilvIH編碼[2]。這些基因的表達(dá)受到不同的調(diào)控,所有BCAAs均能減弱ilvGM,而ilvBN僅受L-亮氨酸和L-纈氨酸的影響[10]。L-纈氨酸對(duì)AHAS Ⅰ、Ⅲ活性有較強(qiáng)的抑制作用,L-異亮氨酸對(duì)其活性的抑制作用較弱,L-亮氨酸對(duì)其活性無(wú)影響[11]。大腸桿菌對(duì)L-纈氨酸非常敏感,在極低濃度下生長(zhǎng)受到抑制,谷氨酸棒桿菌合成支鏈氨基酸的途徑為

1.2 乙酰羥基酸異構(gòu)還原酶

在C.glutamicum中,ilvC基因編碼乙酰羥基酸異構(gòu)還原酶(AHAIR),與ilvBN基因受到同一操縱子轉(zhuǎn)錄調(diào)控。AHAIR利用NADPH作為輔助因子,將2-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為2,3-二羥基異戊酸以合成L-纈氨酸和L-亮氨酸,將2-乙酰-2-羥基丁酸轉(zhuǎn)化為2,3-二羥基-3-甲基戊酸以合成L-異亮氨酸,ilvBNC操縱子的表達(dá)受BCAAs轉(zhuǎn)錄弱化調(diào)控[12]。

1.3 二羥基酸脫水酶

ilvD編碼的二羥基酸脫水酶(DHAD)[13]能將2,3-二羥基異戊酸、2,3-二羥基-3-甲基戊酸分別催化生成2-酮異戊酸、2-酮-3-甲基戊酸,DHAD被L-纈氨酸或L-亮氨酸抑制[14],ilvD基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

1.4 支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶

ilvE編碼的支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(BCAT)或轉(zhuǎn)氨酶B是L-異亮氨酸和L-纈氨酸生物合成的最后一個(gè)酶[13],該酶將L-谷氨酸的氨基轉(zhuǎn)移到2-酮異戊酸酯和2-酮-3-甲基戊酸,分別生成L-纈氨酸和L-異亮氨酸[15]。

L-亮氨酸的特異性合成途徑是從leuA編碼的異丙基蘋(píng)果酸合成酶(IPMS)反應(yīng)開(kāi)始,由2-酮異戊酸和乙酰CoA生成2-異丙基蘋(píng)果酸,該酶在C.glutamicum中受L-亮氨酸反饋抑制,其表達(dá)也受L-亮氨酸調(diào)控[16],隨后,異丙基蘋(píng)果酸異構(gòu)酶(IPMI)將2-異丙基蘋(píng)果酸異構(gòu)化為3-異丙基蘋(píng)果酸,IPMI由大亞基和小亞基組成,分別由leuC和leuD編碼,由leuB編碼的異丙基蘋(píng)果酸脫氫酶(IPMD)將3-異丙基蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)化為2-酮-4-甲基戊酸。在C.glutamicum中,leuB受L-亮氨酸反饋抑制,leuABCD基因在大腸桿菌中形成操縱子,其表達(dá)受L-亮氨酸介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄弱化調(diào)控[17]。L-亮氨酸與另外兩種BCAAs一樣,是由2-酮-4-甲基戊酸在BCAT的催化作用下形成的[18],此外,該步反應(yīng)也可由tyrB編碼的酪氨酸可抑制轉(zhuǎn)氨酶(TrAT)催化[10]。

2 生產(chǎn)支鏈氨基酸的代謝工程菌種現(xiàn)狀

通過(guò)合理的育種策略設(shè)計(jì),有目的地利用代謝工程手段改造代謝網(wǎng)絡(luò),設(shè)計(jì)菌株的分解代謝與合成代謝的多步級(jí)聯(lián)反應(yīng),能最大限度提高支鏈氨基酸的產(chǎn)量,減少副產(chǎn)物的生成,避免誘變育種對(duì)菌體的不良影響[19]。發(fā)酵法生產(chǎn)化學(xué)品的一般策略是“進(jìn)、通、節(jié)、堵、出”[20],發(fā)酵法生產(chǎn)支鏈氨基酸也采用這一策略。

2.1 L-纈氨酸

生產(chǎn)L-纈氨酸的微生物最早由Udaka等[21]和Sugisaki[22]報(bào)道。Udaka和Kinoshita篩選了大量的微生物,篩選出的細(xì)菌即Paracolobacterumcoliforme和Brevibacteriumammoniagenes,由葡萄糖生產(chǎn)L-纈氨酸的摩爾產(chǎn)率為23%;Sugisaki分離了Aerobactercloacae和A.aerogenes,由葡萄糖生產(chǎn)L-纈氨酸的摩爾產(chǎn)率為20%,以L-纈氨酸為例,詳細(xì)介紹了“進(jìn)、通、節(jié)、堵、出”[20]育種策略中的“進(jìn)、通、節(jié)、出”。

2.1.1 進(jìn)

在ΔaceE菌株生長(zhǎng)階段,乙酸通過(guò)DeoR型調(diào)控因子SugR抑制磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS),阻止菌株吸收葡萄糖[23-25],因此乙酸的添加能抑制L-纈氨酸的產(chǎn)生。Blombach等[26]刪除了sugR基因以消除對(duì)PTS基因的抑制作用。sugR基因缺失菌株消耗葡萄糖速率比親本菌株快5倍,甚至在生長(zhǎng)階段,在存在乙酸的情況下,依然能產(chǎn)生L-纈氨酸,盡管總體產(chǎn)量降低了40%。用乙醇代替乙酸作為次生碳源還可以避免PTS基因受到抑制。C.glutamicumΔaceEΔpqoΔsugR(pJC4ilvBNCE)在其成長(zhǎng)階段也能產(chǎn)生L-纈氨酸,這些菌株是L-纈氨酸的高效生產(chǎn)菌,積累了14～26 mmol/LL-丙氨酸和丙酮酸,調(diào)節(jié)NADPH的供應(yīng)策略可以減少這些副產(chǎn)物的積累。

在缺氧條件下,大多數(shù)葡萄糖將用于C.glutamicum的產(chǎn)物生成,而不是菌株生長(zhǎng)。Hasegawa等[27]使用了缺失ldhA基因的菌株,發(fā)酵主要在缺氧條件下進(jìn)行,ldhA基因編碼乳酸脫氫酶,用于乳酸的生產(chǎn)。單純過(guò)表達(dá)L-纈氨酸生物合成ilvBNCDE基因,由于氧化還原力失衡導(dǎo)致葡萄糖攝取不良,不能有效生產(chǎn)L-纈氨酸。通過(guò)誘變使AHAIR(ilvCTM)的輔因子由NADPH轉(zhuǎn)化為NADH,并利用質(zhì)粒pCRB-DLD引入NADH依賴型的外源性亮氨酸脫氫酶取代NADPH依賴的內(nèi)源性BCAT,解決了這一問(wèn)題。此外,解除反饋抑制的AHAS(ilvBNGE)突變體也被過(guò)表達(dá)。菌株C.glutamicumRΔldhA(pCRB-BNGECTM,pCRB-DLD)發(fā)酵24 h能生產(chǎn)1 470 mmol/LL-纈氨酸,摩爾產(chǎn)率在63%,48 hL-纈氨酸的產(chǎn)量達(dá)到1 940 mmol/L,該菌株的主要副產(chǎn)物為琥珀酸[27]。為了減少琥珀酸的碳代謝流,敲除了磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc,琥珀酸生產(chǎn)受到抑制,導(dǎo)致NADH/NAD+比值升高。通過(guò)缺失ctfA,pta和ackA3個(gè)基因改善細(xì)胞內(nèi)氧化還原失衡。這3個(gè)基因與乙酸合成有關(guān),乙酸合成會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的NADH。過(guò)表達(dá)5個(gè)EMP基因gapA，pyk，pfkA，pgi和tpi,敲除avtA可以抑制L-丙氨酸的生成。最終菌株C.glutamicumRilvNGECTM，gapA，pyk，pfkA，pgi，tpiΔldhAΔppcΔptaΔackAΔctfAΔavtA(pCRB-BNGECTMpCRB-DLD)以葡萄糖為底物,分批補(bǔ)料發(fā)酵24 h,能生產(chǎn)1 280 mmol/LL-纈氨酸,摩爾產(chǎn)率達(dá)到88%。

2.1.2 通

Radmacher等[13]構(gòu)建了C.glutamicumΔilvAΔpanB,通過(guò)質(zhì)粒過(guò)表達(dá)ilvBNCD/ilvBNCE增強(qiáng)L-纈氨酸的合成,其中菌株C.glutamicumΔilvAΔpanB(pJC1ilvBNCD)發(fā)酵48 h能積累92 mmol/L的L-纈氨酸以及少量的L-丙氨酸,約1.3 mmol/L。盡管此菌株的AHAS不能解除L-纈氨酸的反饋抑制,但它產(chǎn)生L-纈氨酸的效率已經(jīng)得到提升。這是因?yàn)長(zhǎng)-纈氨酸對(duì)C.glutamicum的AHAS的反饋抑制作用不強(qiáng),對(duì)酶活性的最大抑制作用不超過(guò)50%[9]。研究者進(jìn)一步探究了對(duì)AHAS解反饋抑制,將AHAS調(diào)控亞基(ilvN)原基因替換為具有反饋抗性的突變體ilvNM13,該突變體是基于對(duì)E.coli和Streptomycescinnamonensis具有反饋抗性的同源基因結(jié)構(gòu)信息而設(shè)計(jì)的。無(wú)質(zhì)粒的菌株發(fā)酵48 h,能生產(chǎn)90 mmol/LL-纈氨酸,而出發(fā)菌株C.glutamicumΔilvAΔpanB只能生產(chǎn)不到40 mmol/L的L-纈氨酸。該株菌通過(guò)質(zhì)粒過(guò)表達(dá)ilvBNC增強(qiáng)L-纈氨酸合成,由此而來(lái)的菌株C.glutamicumΔilvAΔpanBilvNM13(pECKAilvBNC)生產(chǎn)L-纈氨酸能達(dá)到130 mmol/L?；騣lvN的突變對(duì)L-纈氨酸的產(chǎn)量影響不大,其親本菌株C.glutamicumΔilvAΔpanB(pECKAilvBNC)能積累高達(dá)120 mmol/L的L-纈氨酸。

可以通過(guò)調(diào)節(jié)啟動(dòng)子強(qiáng)弱來(lái)調(diào)節(jié)代謝途徑基因表達(dá)的策略,代替完全缺失側(cè)通路基因或強(qiáng)過(guò)表達(dá)合成目標(biāo)產(chǎn)物的限速酶。Holátko等[28]構(gòu)建了C.glutamicumilvNM13 ΔpanBP-ilvAM1CG P-ilvDM7 P-ilvEM6,ilvA通過(guò)變異的啟動(dòng)子表達(dá)下調(diào),ilvD和ilvE表達(dá)上調(diào)。該菌株經(jīng)過(guò)48 h搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生136 mmol/L的L-纈氨酸。啟動(dòng)子強(qiáng)度的調(diào)節(jié)可以不通過(guò)外源質(zhì)粒而過(guò)表達(dá)基因,這確保了基因的穩(wěn)定性,也不需要抗生素標(biāo)記。由于菌株不需要額外的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充,因此緩養(yǎng)性是有利的。

Blombach等報(bào)道了一種以缺失基因ilvA和panB生產(chǎn)L-纈氨酸的替代策略。編碼PDHC E1p亞基的aceE的缺失導(dǎo)致菌體無(wú)法僅依靠葡萄糖生長(zhǎng),額外補(bǔ)充乙酸可以使菌體生長(zhǎng)[29]。Blombach等[30]研究了該菌株發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸和氨基酸的積累,發(fā)現(xiàn)在乙酸耗盡后,該菌株開(kāi)始產(chǎn)生丙酮酸(30～35 mmol/L)、L-丙氨酸(25～30 mmol/L)和L-纈氨酸(30～35 mmol/L)。丙酮酸的積累是PDHC失活的直接結(jié)果,丙酮酸是L-丙氨酸和L-纈氨酸的前體物。通過(guò)質(zhì)粒過(guò)表達(dá)ilvBNCE,工程菌C.glutamicumΔaceE(pJC4ilvBNCE)以葡萄糖及5 mmol/L丙酮酸為底物,補(bǔ)料發(fā)酵，能生產(chǎn)210 mmol/L的L-纈氨酸,摩爾產(chǎn)率為50%,該菌株不需要補(bǔ)充L-異亮氨酸或D-泛酸,優(yōu)于上述ΔilvAΔpanB菌株。

Blombach等[31]對(duì)aceE缺失菌株C.glutamicumΔaceE(pJC4ilvBNCE)進(jìn)行了進(jìn)一步的改造,敲除了編碼丙酮酸醌氧化還原酶(PQO)的pqo基因,該菌株的摩爾產(chǎn)率增加了30%。當(dāng)細(xì)胞密度較高時(shí),PQO與乙酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶結(jié)合可能繞過(guò)PDHC反應(yīng),提供乙酰CoA,因此,PQO失活,切斷了生長(zhǎng)碳代謝流供應(yīng),促使L-纈氨酸產(chǎn)量增加。研究者持續(xù)檢測(cè)C.glutamicumΔaceEΔpqo(pJC4ilvBNCE)培養(yǎng)基中丙酮酸含量,結(jié)果表明L-纈氨酸生產(chǎn)受到丙酮酸—L-纈氨酸下游反應(yīng)限制。在從葡萄糖到L-纈氨酸的總反應(yīng)中,下游反應(yīng)(丙酮酸—L-纈氨酸)需要兩分子NADPH,同時(shí)BCAT需要消耗L-谷氨酸,而EMP途徑只提供NADH不提供NADPH。為了彌補(bǔ)L-纈氨酸生產(chǎn)中NADPH供應(yīng)不足,刪除基因pgi,使葡萄糖中的碳代謝流直接進(jìn)入磷酸戊糖途徑,由1 mol葡萄糖生成2 mol NADPH。最終,C.glutamicumΔaceEΔpqoΔpgi(pJC4ilvBNCE)以葡萄糖為底物生產(chǎn)超過(guò)400 mmol/L的L-纈氨酸,摩爾產(chǎn)率為75%,未檢測(cè)到丙酮酸殘留。從碳代謝流角度來(lái)看,刪除pyc編碼的丙酮酸羧化酶也是有益的,C.glutamicumΔaceEΔpqoΔpgiΔpyc(pJC4ilvBNCE)的摩爾產(chǎn)率達(dá)到了86%,L-纈氨酸濃度約為240 mmol/L。

2.1.3 節(jié)

在L-纈氨酸生產(chǎn)菌株中,副產(chǎn)物L(fēng)-丙氨酸的形成是一個(gè)普遍存在的問(wèn)題[32],因此抑制L-丙氨酸的合成有利于L-纈氨酸的生產(chǎn)。alaT和avtA兩個(gè)基因編碼丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶,分別以L-谷氨酸或L-纈氨酸作為氨基供體,將丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙氨酸[30]。在菌株C.glutamicumΔilvAΔpanBC(pJC1ilvBNCD)中敲除alaT和avtA中任意一個(gè)基因,基本不會(huì)影響L-纈氨酸的生產(chǎn)。avtA缺失突變體僅表現(xiàn)為L(zhǎng)-丙氨酸積累的微弱下降,而alaT缺失突變體則有了較大的改善,與親本菌株相比,L-丙氨酸的生成從1.2 mmol/L下降到0.16 mmol/L。

在以E.coliATCC4157為出發(fā)菌分離產(chǎn)氨基酸微生物時(shí),發(fā)現(xiàn)了一個(gè)氨基酸類似物耐受型突變菌株可以積累L-纈氨酸[33]。該L-纈氨酸生產(chǎn)菌源于一株纈氨酸耐藥菌,該菌株經(jīng)過(guò)進(jìn)一步突變獲得L-亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷,最終這一突變菌能產(chǎn)生超過(guò)2 g/L的L-纈氨酸。誘變Serratiamarcescens也獲得了一個(gè)氨基酸類似物耐藥性突變菌[34]。通過(guò)幾種支鏈氨基酸結(jié)構(gòu)類似物篩選測(cè)試,得到的α-氨基丁酸(α-AB)耐受突變菌能夠積累超過(guò)8 g/L的L-纈氨酸。酶分析表明:在這些突變體中,AHAS僅受到微弱的反饋抑制。3個(gè)L-谷氨酸生產(chǎn)菌,即B.lactofermentum,C.acetoacidphilum和Arthrobactercitreus,誘變后經(jīng)組氨酸類似物2-噻唑丙氨酸篩選,獲得生產(chǎn)菌[35]。產(chǎn)量最高的菌株為B.lactofermentum突變株,72 h的L-纈氨酸產(chǎn)量為31 g/L,該菌株的AHAS解除了由L-纈氨酸、L-異亮氨酸和L-亮氨酸引起的反饋抑制,此外,該酶的表達(dá)部分解除了反饋?zhàn)瓒鬧36]。一個(gè)有趣的例子是生物素缺陷型B.flavumMJ-233的α-氨基丁酸耐受突變株,當(dāng)培養(yǎng)基中缺乏生物素且細(xì)菌停止生長(zhǎng)時(shí),碳代謝流轉(zhuǎn)向L-纈氨酸的產(chǎn)生[37]。以葡萄糖為底物,使用該菌株發(fā)酵,能積累300 mmol/L的L-纈氨酸,其摩爾產(chǎn)率為80%,純度為總氨基酸的96%。

Hou報(bào)道了一株混合策略的菌株[38],其ilvA的表達(dá)受到突變?nèi)鯁?dòng)子的調(diào)控,缺失avtA抑制了L-丙氨酸的產(chǎn)生。過(guò)表達(dá)解除反饋抑制的L-纈氨酸合成基因的菌株C.glutamicumMPilvAΔavtA(pDXW-8-ilvEBNrC),能生產(chǎn)266 mmol/L的L-纈氨酸,摩爾收率在27%。副產(chǎn)物如L-乳酸和L-谷氨酸是通過(guò)保持15%飽和度溶氧(DO)來(lái)控制的。將相同的策略應(yīng)用于B.flavumJV16,這是一個(gè)由B.flavumDSM20411隨機(jī)誘變產(chǎn)生的α-ABr,Leu-Ile-Met-菌株。B.flavumJV16avtA::Cm(pDXW-8-ilvEBNrC)以葡萄糖為原料,能生產(chǎn)331 mmol/L的L-纈氨酸,摩爾產(chǎn)率為39%。還有另一個(gè)使用C.glutamicum亞種生產(chǎn)L-纈氨酸的例子[39],B.flavumATCC14067pDXW-8-ilvEBNrC,以葡萄糖為原料,在高達(dá)37 ℃的培養(yǎng)溫度下,經(jīng)48 h補(bǔ)料分批發(fā)酵,能生產(chǎn)325 mmol/L的L-纈氨酸,摩爾產(chǎn)率為37%。

Westbrook等[40]報(bào)道了利用CRISPR-Cas9改造Bacillussubtilis以生產(chǎn)L-纈氨酸。通過(guò)解除轉(zhuǎn)錄和變構(gòu)調(diào)節(jié),與野生菌株相比,L-纈氨酸濃度增加14倍。隨后研究者確定并消除了限制L-纈氨酸過(guò)量生產(chǎn)的因素,增加丙酮酸的供應(yīng)和阻斷L-亮氨酸和L-異亮氨酸生物合成途徑。通過(guò)失活編碼E1α丙酮酸脫氫酶復(fù)合體亞基的pdhA基因,增加細(xì)胞內(nèi)丙酮酸濃度;失活分別編碼IPMS和TDH的leuA和ilvA基因,廢除另外兩種支鏈氨基酸合成途徑,經(jīng)搖瓶培養(yǎng)L-纈氨酸達(dá)到4.61 g/L。L-纈氨酸生產(chǎn)菌B.subtilis不含質(zhì)粒,失活了編碼特異性芽孢轉(zhuǎn)錄因子σF的基因sigF使其不能形成芽孢,使該菌能用于大規(guī)模生產(chǎn)L-纈氨酸。

2.1.4 出

Chen等[41]從C.glutamicumATCC13869中制備了一株ilvA,aceE和alaT均缺失的菌株,以盡可能多地由丙酮酸得到L-纈氨酸。過(guò)度表達(dá)了編碼BCAA輸出蛋白的brnF和brnE基因,以及編碼整體調(diào)控因子Lrp的lrp基因,Lrp除了激活L-纈氨酸生物合成基因(ilvBNC)外,還激活了brnFE的表達(dá)。工程菌株C.glutamicumATCC13869ΔaceEΔalaTΔilvA(pJYW-4-ilvBNC1-lrp1-brnFE)在分批補(bǔ)料發(fā)酵96 h能生產(chǎn)435 mmol/L的L-纈氨酸。

與C.glutamicum相比,產(chǎn)L-纈氨酸E.coli菌株的開(kāi)發(fā)相對(duì)滯后,這可能是由L-纈氨酸的生物合成調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜所致。以E.coli為基礎(chǔ)菌株具有生長(zhǎng)速度快、遺傳信息豐富等優(yōu)點(diǎn)。早期的菌株包括獲得解除反饋抑制的AHASIII菌株[42]或過(guò)表達(dá)編碼L-纈氨酸輸出蛋白的ygaZH的菌株[43]。Ile-tRNA合成酶突變株[44]和硫辛酸缺陷型H+-ATP合酶失活突變株[45]可以積累L-纈氨酸。這些菌株是通過(guò)經(jīng)典的隨機(jī)突變篩選得到的,它們的基因型無(wú)法確定。

2.2 L-異亮氨酸

Hayashibe等[46]最先報(bào)道L-異亮氨酸生產(chǎn)菌,在研究蘇氨酸代謝時(shí),分離的耐受α-AB的B.subtilisNo.14能生產(chǎn)4.3 g/L的L-異亮氨酸。通過(guò)α-AB篩選的產(chǎn)L-異亮氨酸的菌株,有A.aerogenesIAM1019(2.4 g/L),PseudomonasaureofaciensIAM1001(3.0 g/L),S.marcescens(2.7 g/L),ErwiniacarotovoraE30(1.3 g/L)。另外,D-蘇氨酸作為天然氨基酸對(duì)映體用于篩選Serratia和Pseudomonas屬微生物[47],其中效果最好的菌株S.marcescensNo.1培養(yǎng)40 h能產(chǎn)生8 g/L以上的L-異亮氨酸。大多數(shù)的L-異亮氨酸生產(chǎn)菌通過(guò)BCAA結(jié)構(gòu)類似物篩選得到[48],通過(guò)硫代異亮氨酸篩選的有E.coli[49-50],Salmonellatyphimurium[48,51],Saccharomycescerevisiae[52],五亞甲基甘氨酸篩選的有S.typhimurium[51],甘氨酰異亮氨酸篩選的有E.coli[48],異亮氨酸氧肟酸篩選的有S.marcescens[53],酮毒素篩選的有Bacillussubtilis[54]。

通過(guò)理性的代謝工程來(lái)提高L-異亮氨酸的產(chǎn)量,必須解決L-異亮氨酸的生物合成途徑與L-纈氨酸和L-亮氨酸合成途徑共同基因和酶的問(wèn)題,將前體物都轉(zhuǎn)向到L-異亮氨酸的合成上。蘇氨酸是L-異亮氨酸生物合成的前體物之一,消除TDH的反饋抑制是高效生產(chǎn)L-異亮氨酸的關(guān)鍵。

生產(chǎn)L-異亮氨酸需要供應(yīng)L-蘇氨酸。因此,筆者將簡(jiǎn)要概述L-蘇氨酸的生物合成途徑及其調(diào)控。L-蘇氨酸的生物合成始于L-天冬氨酸,該途徑由5個(gè)酶反應(yīng)組成[55],分別由天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合成酶催化。E.coli的天冬氨酸激酶同工酶Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ分別由thrA,metL和lysC編碼,而C.glutamicum只有一個(gè)天冬氨酸激酶由lysC編碼。E.coli天冬氨酸激酶I和III分別受L-蘇氨酸和L-賴氨酸反饋抑制,而天冬氨酸激酶II不受反饋抑制的影響。E.coli的天冬氨酸激酶II是由L-蛋氨酸通過(guò)metBL操縱子來(lái)調(diào)控的[56],C.glutamicum天冬氨酸激酶同時(shí)受到L-賴氨酸和L-蘇氨酸反饋抑制[7]。

由于L-蘇氨酸的生物合成途徑與L-賴氨酸的生物合成途徑有重要的共同之處,因此在生產(chǎn)L-異亮氨酸時(shí),利用產(chǎn)L-賴氨酸菌株選育產(chǎn)L-蘇氨酸菌株是可行的。Colon等[57]報(bào)道了使用L-賴氨酸生產(chǎn)菌株ATCC21799過(guò)表達(dá)野生型ilvA,積累了114 mmol/LL-異亮氨酸。Morbach等[7,58]對(duì)另外一個(gè)L-賴氨酸生產(chǎn)菌株C.glutamicum進(jìn)行隨機(jī)突變,同時(shí)在染色體中引入了多個(gè)解反饋抑制的hom和thrB的拷貝,或者用反饋抑制脫敏基因替換了染色體本身的lysC和hom基因,同時(shí)過(guò)表達(dá)ilvA,前者在補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)生96 mmol/LL-異亮氨酸,后者在補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)生138 mmol/LL-異亮氨酸。hom的過(guò)表達(dá)只有在ilvA過(guò)表達(dá)后才可能有效,否則L-蘇氨酸和L-高絲氨酸的積累會(huì)導(dǎo)致菌株不穩(wěn)定[59]。Yin等[60]從L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株C.glutamicumJHI3-156中鑒定了TDH和AHAS的反饋抗性突變體。當(dāng)這兩種反饋抗性酶在同一菌株中過(guò)表達(dá)時(shí),該菌株在補(bǔ)料分批條件下能產(chǎn)生234 mmol/LL-異亮氨酸,對(duì)該菌株進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析進(jìn)一步確定了表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的蛋白,這些蛋白與細(xì)胞生長(zhǎng)、L-異亮氨酸生物合成和應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[61]。

引入外源基因也是一種有效的策略。例如,將源于大腸桿菌的ilvA基因引入生產(chǎn)L-蘇氨酸的B.flavum菌株中,產(chǎn)生153 mmol/LL-異亮氨酸[62]。Wang等[63]將來(lái)源于E.colik-12的thrABC基因?qū)?敲除alaT,得到的菌株產(chǎn)生了100 mmol/LL-異亮氨酸和低濃度的L-賴氨酸、L-丙氨酸和L-纈氨酸。Guillouet等[64]報(bào)道了編碼E.coli代謝途徑TDH的tdcB基因較有反饋抗性的ilvA更具優(yōu)勢(shì)。表達(dá)了tdcB基因的菌株積累的L-異亮氨酸是ilvA基因的4倍,在分批發(fā)酵中產(chǎn)生了30 mmol/L的L-異亮氨酸[65]。

與L-纈氨酸一樣,輸出蛋白對(duì)于L-異亮氨酸的高效生產(chǎn)也很重要。因此,在C.glutamicumJHI3-156中過(guò)表達(dá)整體調(diào)控因子Lrp和BCAA輸出蛋白BrnFE,生產(chǎn)205 mmol/LL-異亮氨酸[66]。Zhao等[67]通過(guò)對(duì)C.glutamicumIWJ001改造提高L-異亮氨酸產(chǎn)量,該菌株經(jīng)隨機(jī)誘變篩選的產(chǎn)生L-異亮氨酸的菌株。研究表明:分別過(guò)表達(dá)編碼核糖體延伸因子G和核糖體循環(huán)因子的fusA和frr基因時(shí),L-異亮氨酸生物合成的酶顯著上調(diào)。同時(shí)過(guò)表達(dá)ilvA,ilvB,ilvN和ppnk(一種多磷酸/依賴于ATP的NAD激酶),該菌株在72 h的補(bǔ)料分批發(fā)酵中產(chǎn)生了217 mmol/LL-異亮氨酸。

發(fā)酵條件的優(yōu)化也是一個(gè)需要解決的問(wèn)題。Peng等[68]利用C.glutamicumJHI3-156優(yōu)化了發(fā)酵條件的DO和pH,最終在分批培養(yǎng)中獲得203 mML-異亮氨酸;Hashiguchi等[69]通過(guò)將帶有ilvA,ilvGM,ilvD和ilvE基因的質(zhì)粒引入產(chǎn)生L-蘇氨酸的K-12突變體,加強(qiáng)了下游反應(yīng),得到的菌株能生產(chǎn)78 mmol/LL-異亮氨酸,該菌株也能產(chǎn)少量L-纈氨酸,但通過(guò)引入反饋抗性的天冬氨酸激酶III基因,成功地降低了L-纈氨酸的產(chǎn)量,并將L-異亮氨酸的最終濃度提高到94 mmol/L[70]。

2.3 L-亮氨酸

在經(jīng)典的例子中,通過(guò)α-AB篩選的S.marcescens回復(fù)突變株,能積累L-亮氨酸[71]。研究[71-72]表明,耐受α-AB能解除L-異亮氨酸,L-纈氨酸和L-亮氨酸生物合成的酶反饋抑制。L-異亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷的回復(fù)突變體的TDH未解除反饋抑制,對(duì)IPMS反饋抑制脫敏,使得L-亮氨酸的過(guò)量生產(chǎn)。

另一個(gè)產(chǎn)生L-亮氨酸的突變菌株是從谷氨酸生產(chǎn)菌B.lactofermentum中獲得的[73]。以2-噻唑丙氨酸為篩選標(biāo)記,得到L-蛋氨酸/L-異亮氨酸雙缺陷型的B.lactofermentum2256,優(yōu)化培養(yǎng)條件,可生產(chǎn)30 g/LL-亮氨酸[74-75]。在該菌株中,IPMS解除了反饋抑制和反饋?zhàn)瓒?AHAS未發(fā)生變化[34]。使用β-羥基亮氨酸進(jìn)行篩選,獲得了AHAS對(duì)所有的BCAAs都脫敏[76]。這些菌株L-亮氨酸的產(chǎn)量為34 g/L。進(jìn)一步使用高濃度的D-α-氨基丁酸篩選,分離得到活性較高的AHAS和IPMS突變菌株[77]。該突變株產(chǎn)生更多的L-亮氨酸,并且L-亮氨酸/L-纈氨酸比例比親本菌株更高。

E.coli的突變菌株已被開(kāi)發(fā)用于L-亮氨酸生產(chǎn)。篩選4-硫唑嘌呤亮氨酸耐藥性的E.coliK-12菌株,解除亮氨酸對(duì)IPMS反饋抑制,其中產(chǎn)量最高的菌株可產(chǎn)生5.2 g/L亮氨酸[17]。對(duì)ilvE突變,分離得到L-異亮氨酸/L-纈氨酸雙缺陷型的突變菌[78],通過(guò)外源質(zhì)粒使其過(guò)表達(dá)tyrB,tyrB只作用于L-亮氨酸的生物合成。結(jié)果菌株產(chǎn)生2.7 g/LL-亮氨酸,沒(méi)有檢測(cè)到L-纈氨酸/L-異亮氨酸。降低編碼α-酮戊二酸脫氫酶sucAB基因的啟動(dòng)子活性可以減少碳代謝流進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA),降低乙酰CoA的消耗[79],將該菌株與反饋抑制脫敏的IPMS和失活BCAT相結(jié)合,最終L-亮氨酸達(dá)到11.4 g/L。

從氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中也能獲得L-亮氨酸生產(chǎn)菌株。其中以L-苯丙氨酸和L-組氨酸雙缺陷型菌株產(chǎn)量最高,其L-亮氨酸累積量為16.0 g/L,耐受S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸的C.glutamicum突變菌株可用于生產(chǎn)L-亮氨酸[80],但該菌株遺傳性狀不穩(wěn)定。

稀有密碼子的翻譯依賴于其相應(yīng)的稀有tRNA,在氨基酸缺乏的情況下,這些tRNA不能被完全結(jié)合。理論上,由于缺乏攜帶氨基酸的稀有tRNA而導(dǎo)致的翻譯中斷或延遲,可以通過(guò)喂養(yǎng)或細(xì)胞內(nèi)合成相應(yīng)的氨基酸來(lái)部分恢復(fù)。受這一假設(shè)的啟發(fā),Zheng等[81]開(kāi)發(fā)了一個(gè)篩選或選擇系統(tǒng),通過(guò)在選定的報(bào)告蛋白或耐藥標(biāo)記的編碼序列中用相應(yīng)的稀有密碼子替換目標(biāo)氨基酸的普通密碼子,獲得目標(biāo)氨基酸的過(guò)量生產(chǎn)者。結(jié)果表明:隨機(jī)突變庫(kù)中成功地選擇了高產(chǎn)L-亮氨酸菌株LP-4,L-亮氨酸達(dá)到18.55 mg/g生物量,是野生型菌種的2.91倍,該策略為獲得和了解氨基酸生產(chǎn)過(guò)剩菌株提供了新的思路。

Vogt等[82]報(bào)道了一株基因型明確L-亮氨酸生產(chǎn)菌株。該菌株的染色體中含有3份Ptuf-leuAB018模塊拷貝?；騦euAB018,編碼IPMS,解除L-亮氨酸的反饋抑制。在本模塊中,天然啟動(dòng)子被強(qiáng)啟動(dòng)子tuf取代,不受轉(zhuǎn)錄弱化的影響,通過(guò)將gltA(編碼檸檬酸合酶)的天然啟動(dòng)子替換為較弱勢(shì)啟動(dòng)子PdapA-L1,增加了IPMS酶反應(yīng)的另一個(gè)底物乙酰CoA的供應(yīng)。為了提高L-亮氨酸生物合成的下游基因leuBCD的表達(dá),敲除轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白編碼基因ltbR。AHAS調(diào)控位點(diǎn)(ilvN編碼)引入突變,使其解除反饋抑制,增加碳代謝流向L-亮氨酸生產(chǎn)。IolT1受IolR調(diào)控,通過(guò)獨(dú)立的PTS催化葡萄糖的攝取,因此,iolR基因也被刪除,以增強(qiáng)葡萄糖的攝取,該菌株補(bǔ)料分批發(fā)酵72 h能生產(chǎn)高達(dá)181 mmol/LL-亮氨酸。

Feng等[83]理性設(shè)計(jì)了C.glutamicumFA-1,通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)氨酶來(lái)提高L-亮氨酸的產(chǎn)量。菌株C.glutamicumFA-1ΔilvE在不添加亮氨酸的情況下仍表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng),C.glutamicumFA-1ΔilvEΔaspB則不能。C.glutamicumFA-1ΔilvEpEC-XK99E-aspB,L-亮氨酸能積累(20.81±0.02) g/L,L-纈氨酸濃度顯著降低,說(shuō)明aspB也參與了L-亮氨酸的生物合成。隨后,克隆了芳香氨基轉(zhuǎn)移酶TyrB和推測(cè)的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶aspC,yhdR,ywfG基因產(chǎn)物,通過(guò)外源質(zhì)粒在C.glutamicumFA-1ΔilvEΔaspB表達(dá),只有C.glutamicumFA-1ΔilvEΔaspBpEC-XK99E-tyrB能夠合成L-亮氨酸,L-亮氨酸產(chǎn)量為(18.55±0.42) g/L?？寺〔⒈磉_(dá)了兩個(gè)推測(cè)的支鏈轉(zhuǎn)氨酶基因ybgE和CaIlvE,這兩種基因在BCAAs生物合成中都發(fā)揮著高效的作用。

Wang等[84]通過(guò)提高氧化還原通量來(lái)提高L-亮氨酸的產(chǎn)量。為改變細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài),對(duì)ilvC編碼的AHAIR突變,插入來(lái)源于Lysinibacillussphaericus的leuDH基因編碼的依賴于NAD的亮氨酸脫氫酶,來(lái)源于Bacillussubtilis的rocG基因編碼的谷氨酸脫氫酶,分別代替天然的BCAT和谷氨酸脫氫酶。菌株C.glutamicumXQ-9ΔLtbR-AHAIRM/ABNCME與菌株C.glutamicumXQ-9ΔLtbR-AHAIRMLeuDH/ABNCMLDH相比,L-亮氨酸積累量相近,但后者L-纈氨酸積累降低,從8.06 g/L降低到2.72 g/L,說(shuō)明LeuDH對(duì)L-亮氨酸的合成具有較強(qiáng)的特異性,但對(duì)L-纈氨酸的合成無(wú)特異性。最終菌株C.glutamicumXQ-9ΔLtbR-AHAIRMLeuDH RocG/ABNCMLDH累積了(23.31±0.24) g/LL-亮氨酸,糖酸轉(zhuǎn)化效率為19.1%。

目前,基于生物信息學(xué)的碳通量模擬研究,正逐漸成為理性設(shè)計(jì)的有力工具,以最大化提升生產(chǎn)目標(biāo)化合物的生物合成途徑的效率[85-86],這些技術(shù)的應(yīng)用將是人們創(chuàng)造更復(fù)雜更有價(jià)值微生物菌株的重要手段。

3 結(jié) 論

我國(guó)采用發(fā)酵法生產(chǎn)支鏈氨基酸已有多年歷史,但遺憾的是,與國(guó)際先進(jìn)水平相比,我國(guó)支鏈氨基酸生產(chǎn)存在產(chǎn)酸低、周期長(zhǎng)、副產(chǎn)物多、純度低、提取困難、經(jīng)濟(jì)性差和生產(chǎn)過(guò)程污染嚴(yán)重等問(wèn)題。解決上述問(wèn)題對(duì)我國(guó)支鏈氨基酸產(chǎn)業(yè)化與藥品、輕工化妝品、食品添加劑和飼料添加劑等行業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。對(duì)BCAAs的生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了概括,并對(duì)用于BCAAs生產(chǎn)的微生物菌株進(jìn)行了綜述,對(duì)利用先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)合理設(shè)計(jì)產(chǎn)生BCAAs的菌株具有指導(dǎo)意義。