周旭波,丁 鼎,劉 帥,王 威,王 健

(江蘇澳創(chuàng)生物科技有限公司,江蘇 無(wú)錫 214100)

L-蘇氨酸是人體和動(dòng)物體內(nèi)的必需氨基酸之一,是構(gòu)成蛋白的重要組成部分,人和動(dòng)物自身不能合成,必須從食物中攝取。L-蘇氨酸具有恢復(fù)疲勞、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育等多種生理功能,在飼料、食品和醫(yī)藥等行業(yè)都具有廣泛的應(yīng)用[1-2]。近幾年,全球蘇氨酸市場(chǎng)以每年20%多的增長(zhǎng)率高速增長(zhǎng),L-蘇氨酸的需求量也在逐年上升,蘇氨酸也成為僅次于谷氨酸、賴氨酸和蛋氨酸的第四大產(chǎn)能的大宗氨基酸產(chǎn)品[3]。L-蘇氨酸的生產(chǎn)方法目前主要采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn),利用發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘇氨酸,比傳統(tǒng)的采用化學(xué)合成法和水解動(dòng)物蛋白質(zhì)提取法,具有生產(chǎn)成本更低、更加綠色環(huán)保等顯著優(yōu)越性[4-5]。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,研究者們利用基因工程技術(shù)成功構(gòu)建了L-蘇氨酸高產(chǎn)菌株,使L-蘇氨酸生產(chǎn)技術(shù)得到不斷進(jìn)步和發(fā)展[6-8]。在蘇氨酸高產(chǎn)菌株里,大腸桿菌由于遺傳學(xué)清晰、基因操作簡(jiǎn)單、易于培養(yǎng)、周期短和培養(yǎng)條件粗放等優(yōu)點(diǎn),已成為直接法發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸的主要菌株[9]。

在大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸的過(guò)程中容易產(chǎn)生乙酸等有機(jī)酸代謝副產(chǎn)物,乙酸作為大腸桿菌主要的有機(jī)酸副產(chǎn)物,會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)、減弱菌體活力、減少目的產(chǎn)物的合成、降低菌株生產(chǎn)能力[10],此外,大腸桿菌碳代謝流的10%～30%可轉(zhuǎn)化為乙酸,造成碳源浪費(fèi),降低了發(fā)酵糖酸轉(zhuǎn)化率,增加了生產(chǎn)成本,進(jìn)而影響大腸桿菌發(fā)酵的生產(chǎn)能力[11]。乙酸的產(chǎn)生與細(xì)胞中的氧化磷酸化和三羧酸循環(huán)(Tricarboxylic acid cycle,TCA)有關(guān),一般在兩種情況下易產(chǎn)生乙酸:一是無(wú)氧條件或是供氧不足;二是供氧充足,但糖酵解碳代謝流與TCA碳代謝流不平衡[12]。為了減少大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的乙酸,降低乙酸對(duì)發(fā)酵菌體產(chǎn)生的抑制作用,提高生產(chǎn)效率,近年來(lái)很多研究人員對(duì)此展開(kāi)了大量研究:一方面利用代謝工程手段對(duì)菌體本身進(jìn)行分子改造以減少乙酸的代謝合成[13];另一方面通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行有效控制,主要包括發(fā)酵條件優(yōu)化和對(duì)培養(yǎng)基的改善,對(duì)菌體培養(yǎng)基和代謝過(guò)程進(jìn)行調(diào)節(jié),使代謝流朝著有利的方向進(jìn)行,降低乙酸生成,提高發(fā)酵水平[14]。以大腸桿菌ACThr1032為蘇氨酸生產(chǎn)菌,利用響應(yīng)面試驗(yàn)探索了不同的補(bǔ)糖量、補(bǔ)氮量及溶氧控制對(duì)大腸桿菌發(fā)酵蘇氨酸產(chǎn)生副產(chǎn)物乙酸的影響,以減少大腸桿菌發(fā)酵副產(chǎn)物乙酸的生成,為大腸桿菌工業(yè)化生產(chǎn)L-蘇氨酸提供一個(gè)可行方案。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

大腸桿菌(Escherichiacoli)ACThr1032,江蘇澳創(chuàng)生物科技有限公司保藏菌種。

1.1.2 培 養(yǎng) 基

1) 活化斜面培養(yǎng)基:葡萄糖1 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母浸出粉5 g/L,NaCl 2.5 g/L,瓊脂20 g/L,pH 7.0～7.2,121 ℃滅菌20 min。

2) 種子培養(yǎng)基:葡萄糖40 g/L,(NH4)2SO42 g/L,KH2PO42 g/L,MgSO4·7H2O 1 g/L,酵母粉10 g/L,玉米漿干粉0.5 g/L,FeSO4·7H2O 2.8 mg/L,MnSO4·H2O 2.8 mg/L,pH 7.0～7.2,115 ℃滅菌20 min。

3) 發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖40 g/L,(NH4)2SO41.8 g/L,KH2PO43 g/L,MgSO4·7H2O 2 g/L,酵母粉1 g/L,玉米漿干粉1 g/L,FeSO4·7H2O 80 mg/L,MnSO4·H2O 80 mg/L,pH 7.0～7.2,115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 儀 器

30 L自動(dòng)發(fā)酵罐,上海百侖生物科技有限公司;高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司;SBA-40C生物傳感分析儀,山東科學(xué)院生物研究所。

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1) 斜面活化培養(yǎng):取保藏菌種劃線接種于活化斜面,37 ℃培養(yǎng)15～18 h。

2) 搖瓶培養(yǎng):從新鮮活化斜面上挑取2環(huán)大腸桿菌于種子培養(yǎng)基中,500 mL三角瓶裝液量30 mL,置于旋轉(zhuǎn)式搖床上,200 r/min,37 ℃振蕩培養(yǎng)至光密度OD為12～14。

3) 30 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng):將培養(yǎng)結(jié)束的搖瓶種子按10%體積分?jǐn)?shù)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。初始通氣量10 L/min,攪拌轉(zhuǎn)速為300 r/min,通過(guò)自動(dòng)流加氨水控制pH在7.0左右,培養(yǎng)溫度36.5 ℃。培養(yǎng)過(guò)程中,流加5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的有機(jī)氮源補(bǔ)充培養(yǎng)基,當(dāng)溶氧降低至一定值時(shí)交替提高轉(zhuǎn)速和通氣量,當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度降至一定值時(shí),流加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的葡萄糖溶液。

1.2.2 分析檢測(cè)方法

1) 菌體生長(zhǎng)測(cè)定:發(fā)酵液用蒸餾水稀釋20倍后,測(cè)定600 nm波長(zhǎng)下的OD值。

2) 葡萄糖質(zhì)量濃度測(cè)定:采用SBA-40C生物傳感分析儀測(cè)定。

3) 蘇氨酸質(zhì)量濃度測(cè)定:高效液相色譜法[15]。

4) 乙酸質(zhì)量濃度測(cè)定:高效液相色譜法[15]。

1.2.3 試驗(yàn)方法

通過(guò)控制葡萄糖的流加速率可以調(diào)節(jié)大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中副產(chǎn)物乙酸的產(chǎn)生量[10];在發(fā)酵過(guò)程中流加精氨酸、琥珀酸和甲硫氨酸等氨基酸或富含氨基酸的酵母粉等有機(jī)氮源,可以降低大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中乙酸的積累量[16-19];發(fā)酵過(guò)程控制中溶氧控制對(duì)乙酸的生成也具有顯著影響,供氧不足或缺氧可迫使糖進(jìn)入混合酸發(fā)酵途徑,使副產(chǎn)物乙酸大量積累。此外,溶氧控制與菌體生長(zhǎng)和補(bǔ)料控制相互關(guān)聯(lián)反饋,廣泛用于控制大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中乙酸的生成[20-21]。

依據(jù)參考文獻(xiàn)報(bào)道以及對(duì)前期大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)和生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)的基礎(chǔ)上,選取大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中控制乙酸生成的3個(gè)關(guān)鍵因素,即平均補(bǔ)糖流量A、平均補(bǔ)氮流量B和溶氧控制值C,以發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物乙酸的質(zhì)量濃度R(g/L)為指標(biāo),進(jìn)行單因素試驗(yàn),確定響應(yīng)面優(yōu)化范圍,然后根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn),采用Box-Behnken Design(BBD)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法[22],所有試驗(yàn)均做3個(gè)重復(fù)取平均值,采用Design-Expert(Version 8.0.5)軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸和方差分析,模型及因素的顯著性均通過(guò)P值進(jìn)行考察,其中P<0.05時(shí)影響顯著,以*表示;P<0.001時(shí)影響極其顯著,以**表示。以響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)試驗(yàn)方案為基礎(chǔ),探索最佳的補(bǔ)糖、補(bǔ)氮、溶氧控制策略,獲得最佳的試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 平均補(bǔ)糖流量對(duì)蘇氨酸發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生乙酸的影響

發(fā)酵控制過(guò)程中,補(bǔ)糖控制一般是根據(jù)發(fā)酵液中殘?zhí)琴|(zhì)量濃度及耗糖速率來(lái)計(jì)算補(bǔ)糖流量來(lái)進(jìn)行控制,經(jīng)過(guò)試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)驗(yàn)積累,可以確定一個(gè)平均補(bǔ)糖流量,然后根據(jù)發(fā)酵液中殘?zhí)堑馁|(zhì)量濃度及耗糖速率圍繞平均補(bǔ)糖流量進(jìn)行調(diào)節(jié)控制,不同平均補(bǔ)糖流量對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生乙酸的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知:平均補(bǔ)糖流量為0.3 L/h時(shí)大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的副產(chǎn)物乙酸最低,因此確定平均補(bǔ)糖流量為0.3 L/h。

圖1 不同平均補(bǔ)糖流量對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生乙酸的影響

2.2 平均補(bǔ)氮流量對(duì)蘇氨酸發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生乙酸的影響

蘇氨酸發(fā)酵過(guò)程中,發(fā)酵起始培養(yǎng)基都會(huì)有一定量的有機(jī)氮源,有機(jī)氮源在菌種生長(zhǎng)代謝過(guò)程中會(huì)逐漸消耗掉,補(bǔ)氮操作就是為了彌補(bǔ)發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)氮源不足而進(jìn)行的操作,通過(guò)發(fā)酵過(guò)程中的補(bǔ)氮操作可以避免發(fā)酵起始培養(yǎng)基中含有過(guò)高質(zhì)量濃度的有機(jī)氮源,同時(shí)還能滿足菌種持續(xù)生長(zhǎng)代謝對(duì)有機(jī)氮源的需求,補(bǔ)氮控制一般是勻速流加或根據(jù)生長(zhǎng)不同周期階梯勻速流加,不同平均補(bǔ)氮流量對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生乙酸的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知:平均補(bǔ)氮流量為20 mL/h時(shí)大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的副產(chǎn)物乙酸最低,因此確定平均補(bǔ)氮流量為20 mL/h。

圖2 不同平均補(bǔ)氮流量對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生乙酸的影響

2.3 溶氧控制對(duì)蘇氨酸發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生乙酸的影響

發(fā)酵過(guò)程中的溶氧控制一般通過(guò)設(shè)定溶氧DO電極測(cè)定的DO值在某一目標(biāo)值范圍內(nèi),通過(guò)調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)數(shù)或通風(fēng)量來(lái)進(jìn)行控制,不同溶氧控制值對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生乙酸的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知:溶氧控制值設(shè)定為30%時(shí)大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的副產(chǎn)物乙酸最低,因此確定溶氧控制值的設(shè)定為30%。

圖3 不同溶氧控制對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生乙酸的影響

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

設(shè)定平均補(bǔ)糖流量A為0.2～0.4 L/h,平均補(bǔ)氮流量B為10～30 mL/h,溶氧控制值C為20%～40%,采用Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)試驗(yàn),以乙酸質(zhì)量濃度R為考察指標(biāo)(g/L)。試驗(yàn)因素編碼和水平如表1所示,試驗(yàn)安排及結(jié)果如表2所示。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平和編碼

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4.1 二次回歸擬合和方差分析

利用Design Expert軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合,響應(yīng)值乙酸質(zhì)量濃度R(g/L)與因素編碼值(Coded factors)之間的函數(shù)關(guān)系為

(1)

響應(yīng)值乙酸質(zhì)量濃度R(g/L)預(yù)測(cè)值與各因素實(shí)際值(Actual Factors)之間的函數(shù)關(guān)系為

(2)

利用Design Expert軟件對(duì)響應(yīng)面二次模型進(jìn)行方差分析及可信度分析,結(jié)果詳見(jiàn)表3,4。由表3可知：該回歸模型高度顯著(P=0.000 3),失擬項(xiàng)不顯著(P=0.167 7),說(shuō)明模型擬合得較好。由表4可知:復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.963 72,說(shuō)明模型擬合程度較好,模型的預(yù)測(cè)值和真實(shí)值高度相關(guān),可以用其代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。從表3中可以看出:各因素對(duì)目標(biāo)值影響的顯著性為A>C>B,尤其是因素A,其不同水平對(duì)乙酸質(zhì)量濃度具有較明顯的影響。

表3 回歸模型的方差分析

表4 模型可信度分析

2.4.2 響應(yīng)因子水平的優(yōu)化

根據(jù)模型做出相應(yīng)的響應(yīng)曲面和等高線見(jiàn)圖4。通過(guò)該組動(dòng)態(tài)圖對(duì)任何兩因素交互影響乙酸產(chǎn)生的效應(yīng)進(jìn)行分析與評(píng)價(jià),從而確定最佳因素水平。從圖4中可以看出:平均補(bǔ)糖流量與平均補(bǔ)氮流量、平均補(bǔ)糖流量與溶氧控制、平均補(bǔ)氮流量與溶氧控制值兩兩交互作用,其中,平均補(bǔ)糖流量與平均補(bǔ)氮流量交互作用的等高線圖形近乎圓形,表明平均補(bǔ)糖流量與平均補(bǔ)氮流量?jī)梢蛩刂g的交互效應(yīng)較弱,而平均補(bǔ)糖流量與溶氧控制值、平均補(bǔ)氮流量與溶氧控制值兩兩因素交互作用的等高線圖形狀近乎橢圓形,說(shuō)明平均補(bǔ)糖流量與溶氧控制值、平均補(bǔ)氮流量與溶氧控制值兩兩因素之間存在著較為復(fù)雜的交互作用。從圖4可以看出:實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響變化趨勢(shì)以及回歸模型確實(shí)具有最優(yōu)響應(yīng)值。利用設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行嶺脊分析,可以得到最優(yōu)控制條件為:平均補(bǔ)糖流量為0.23 L/h,平均補(bǔ)氮流量為15.47 mL/h,溶氧控制值為33.78%,此時(shí)乙酸質(zhì)量濃度最小預(yù)測(cè)值為0.468 g/L。為驗(yàn)證回歸模型的可靠性,以響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)培養(yǎng)方案進(jìn)行了3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),試驗(yàn)得到的乙酸質(zhì)量濃度的平均值為0.462 g/L,與預(yù)測(cè)值0.468 g/L吻合度較高,說(shuō)明模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵產(chǎn)生乙酸情況。

圖4 等高線圖及響應(yīng)面立體圖

2.5 蘇氨酸發(fā)酵控制方案優(yōu)化

在響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步考察補(bǔ)糖流量和溶氧控制值之間交互作用對(duì)所產(chǎn)生副產(chǎn)物乙酸質(zhì)量濃度的影響。在響應(yīng)面試驗(yàn)水平的基礎(chǔ)上進(jìn)一步降低平均補(bǔ)糖流量的水平值,發(fā)現(xiàn)在平均補(bǔ)糖流量小于0.2 L/h時(shí),DO值出現(xiàn)上升趨勢(shì),同時(shí)伴隨著最大菌體OD值的下降,發(fā)酵液中產(chǎn)生的副產(chǎn)物乙酸的質(zhì)量濃度進(jìn)一步下降至0.4 g/L以下,意味著平均補(bǔ)糖流量進(jìn)一步減少至影響菌體生長(zhǎng)的程度,可以進(jìn)一步降低產(chǎn)生的副產(chǎn)物乙酸的質(zhì)量濃度,同時(shí)還提高了發(fā)酵液中的DO值,說(shuō)明在溶氧充足的情況下,減少補(bǔ)糖的量可以有效降低發(fā)酵副產(chǎn)物乙酸的質(zhì)量濃度。同時(shí),在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)補(bǔ)糖的量與發(fā)酵液中的DO值及菌體OD值存在一定的關(guān)聯(lián),在發(fā)酵一定時(shí)期后,補(bǔ)糖的量與菌體OD值正相關(guān),與發(fā)酵液中的DO值負(fù)相關(guān)。為了降低發(fā)酵過(guò)程中副產(chǎn)物乙酸的質(zhì)量濃度,一方面需要保持充足的溶氧,另一方面還需要保持一定的菌體OD值。因此,采用補(bǔ)糖與溶氧連鎖控制:一方面根據(jù)發(fā)酵液中的殘?zhí)琴|(zhì)量濃度,利用溶氧反饋進(jìn)行補(bǔ)糖;另一方面還要保證菌體的生長(zhǎng)OD值達(dá)到一定范圍,使補(bǔ)糖的量稍低于菌體生長(zhǎng)需求的補(bǔ)糖量。采用優(yōu)化后的補(bǔ)糖控制策略,在30 L發(fā)酵罐中進(jìn)行蘇氨酸發(fā)酵培養(yǎng)30 h,經(jīng)過(guò)3次平行發(fā)酵試驗(yàn)驗(yàn)證,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5,蘇氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸3次試驗(yàn)結(jié)果的均值比優(yōu)化前提高了23.15%。

表5 優(yōu)化前后的發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果比較

3 結(jié) 論

在使用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)蘇氨酸的過(guò)程中,副產(chǎn)物乙酸的產(chǎn)生,對(duì)菌體的生長(zhǎng)和目標(biāo)產(chǎn)物的合成都會(huì)造成較大影響,甚至?xí)?yán)重抑制發(fā)酵過(guò)程和產(chǎn)物合成。乙酸的產(chǎn)生與發(fā)酵培養(yǎng)基組分和菌體代謝密切相關(guān)。筆者選取大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖流加、有機(jī)氮流加、溶氧控制值3個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析,通過(guò)試驗(yàn)考察補(bǔ)糖、補(bǔ)氮及溶氧控制條件對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生副產(chǎn)物乙酸的影響,研究補(bǔ)糖、補(bǔ)氮和溶氧控制條件對(duì)蘇氨酸發(fā)酵菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的影響。在響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究了平均補(bǔ)糖流量與溶氧控制值的交互作用,采用溶氧反饋的亞適量補(bǔ)糖控制策略,在此控制條件下,30 L發(fā)酵罐培養(yǎng)30 h,蘇氨酸產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了23.15%。研究對(duì)蘇氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。在試驗(yàn)過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)補(bǔ)糖控制與溶氧控制、補(bǔ)糖控制與補(bǔ)氮控制、菌體生長(zhǎng)的控制同副產(chǎn)物乙酸的富集、蘇氨酸產(chǎn)酸和轉(zhuǎn)化率之間具有較為復(fù)雜的交互作用,需要通過(guò)試驗(yàn)進(jìn)一步研究。