陳詩卉,梁現(xiàn)蕊

(浙江工業(yè)大學 藥學院,浙江 杭州 310014)

穿破石即?？畦蠈僦参飿嫾珻udraniacochinchinensis或柘樹Cudraniatricuspidata的根。穿破石無味、稍苦、性涼,具有祛風、清熱利濕、解毒消腫等功效,主治風濕疼痛、瘀傷、黃疸、腮腺炎、肺結核、胃和十二指腸潰瘍等癥狀[1]。一方面,穿破石的藥理活性較豐富,據(jù)已有文獻報道:穿破石的抗炎鎮(zhèn)痛作用顯著[2],其水提取物對肝損傷具有良好的治療作用,有一定的保肝效果[3];另一方面,穿破石具有較高的抑菌活性,而且抑菌譜廣[4]。穿破石在臨床上主要用于治療輸卵管阻塞性不孕、尿結石和肝膽濕熱型黃疸等癥狀[5],臨床應用前景廣闊,但目前關于其聯(lián)合用藥時對體內(nèi)CYP酶是否有影響的研究還較少。

中藥有其獨特的純天然性和相對較小的毒副作用,臨床上常與西藥聯(lián)合用于疾病的治療,但由于許多中藥會對CYP酶產(chǎn)生不同程度的影響,隨著中藥處方使用的增多及其與藥物之間的聯(lián)用,在藥物-藥物之間可能會產(chǎn)生許多相互作用[6],如銀杏葉提取物和桑葉提取物均會對體內(nèi)的代謝酶和轉運蛋白產(chǎn)生一定的抑制作用[7-8]。中藥是多種化合物組成的混合物,成分較為復雜,通常以單味或復方入藥,因此研究提取物比研究單一的活性成分更加準確[9]。CYP450酶是最重要的藥物代謝酶系統(tǒng)之一,在藥物代謝中起到非常重要的作用,是人體異源生物轉化中重要的I相酶[10],參與人體內(nèi)大量化合物的生物轉化,是藥物代謝的主力軍,參與了人體藥物代謝的90%以上,來自CYP1,CYP2和CYP3家族的亞型酶與臨床上大多數(shù)藥物的代謝有關[11]。臨床研究表明:對P450酶的誘導或抑制效應是引起人類不良藥物反應(ADR)的重要原因之一,而抑制效果被認為是CYP450酶涉及的藥物相互作用機制中比例最大的[12]。中藥化學成分較為復雜,其中可能含有一種或多種CYP450亞型酶的有效抑制劑,從而導致不同程度的藥物-藥物相互作用[13]。因此,研究中藥化學成分對CYP酶的作用,對于有效避免不良藥物反應具有重要的意義[14]。穿破石作為傳統(tǒng)中藥,廣泛運用于中藥處方中[15-16],與其他中藥或者西藥結合共同治療疾病。為了評估穿破石的用藥安全性,筆者以超高效液相色譜為檢測手段,通過混合探針底物法,在體外建立了人肝微粒體孵育體系,研究其對CYP450酶的抑制活性,為臨床提供安全、有效、合理的聯(lián)合用藥參考。

1 材 料

1.1 儀 器

Waters Acquity超高效液相色譜儀,美國Waters公司;HHT-5恒溫水浴鍋,常州國華電器有限公司;KQ 5200DE數(shù)控超聲波清洗器,昆山市儀器有限公司;Barnstead TII超純水系統(tǒng),美國Thermo Fisher Scientific公司;XS 205 DualRange分析天平,瑞士Mettler Toledo公司;Miulab MIX-28渦旋振蕩器,杭州MIULAB儀器有限公司;Heraeus Biofuge Stratos離心機,美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 藥品和試劑

混合人肝微粒體,蛋白質(zhì)量濃度20 mg/L,瑞德肝臟疾病研究上海有限公司AKT;六水氯化鎂MgCl2·6H2O,質(zhì)量分數(shù)≥98%,上海Solarbio科技有限公司;氧化型輔酶Ⅱ二鈉NADP+,質(zhì)量分數(shù)≥98%,上海Solarbio科技有限公司;6-磷酸葡萄糖脫氫酶1 000 U,上海Solarbio科技有限公司;6-磷酸葡萄糖二鈉G-6-P,質(zhì)量分數(shù)≥98%,上海Solarbio科技有限公司;磷酸鹽緩沖液PBS 100 mmol/L,pH 7.4,上海Solarbio科技有限公司;非那西丁、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲,北京天威泰達科技有限公司;睪酮、酮康唑,質(zhì)量分數(shù)≥98%,上海Solarbio科技有限公司;α-萘黃酮、磺胺苯吡唑,質(zhì)量分數(shù)≥98%,上海凜恩科技發(fā)展有限公司;氯美噻唑,上海畢得醫(yī)藥科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 試劑配制

表1 試劑配制

陽性抑制劑的制備:分別稱取適量陽性抑制劑磺胺苯吡唑、α-萘黃酮、氯美噻唑、酮康唑,加入如表1所示的相應溶劑配制成一定濃度的儲備溶液,置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

NADPH再生系統(tǒng)溶液的制備:分別稱取適量的MgCl2·6H2O,NADP+,G-6-P和6-磷酸葡萄糖脫氫酶對照品,加入一定量的PBS溶液溶解稀釋,MgCl2·6H2O,NADP+和G-6-P的最終濃度分別為50,10,50 mmol/L,6-磷酸葡萄糖脫氫酶為40 U/mL,現(xiàn)配現(xiàn)用。

穿破石提取液的制備:準確稱取一定量的穿破石粉末,置于干燥潔凈的具塞錐形瓶中,按照m(穿破石)∶V(體積分數(shù)為60%的甲醇)=1 g∶50 mL的料液比向錐形瓶中加入體積分數(shù)為60%的甲醇溶液,于100 HZ,35 ℃下超聲45 min,提取液冷卻后抽濾得到濾液,經(jīng)旋轉蒸發(fā)濃縮后,于冷凍干燥機中干燥24 h,得到淡黃色穿破石提取物。精密稱取38.89 mg穿破石提取物,用1 mL體積分數(shù)為40%的甲醇溶液溶解配制成38.89 mg/mL的穿破石提取液,置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹17]。

混合探針底物的配制:分別取適量底物對照品非那西丁、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、睪酮儲備溶液,加入一定量的PBS溶液溶解稀釋,非那西丁、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗和睪酮在溶液中的終濃度分別為200,200,200,225 μmol/L。

2.2 體外抑制實驗

穿破石提取液對人肝微粒體的抑制實驗分為實驗組和對照組,對照組又包括陽性對照、陰性對照和空白對照,所有體外抑制實驗均一式3份,取平均值進行分析。孵育體系的體積為200 μL,其組成:pH 7.4的100 mmol/L磷酸鉀緩沖液、NADPH再生系統(tǒng)溶液(包括1 mmol/L NADP+,5 mmol/L G-6-P,4 U/mL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶和5 mmol/L MgCl2)、1 mg/mL(即53.1 pmol/mg)的人肝微粒體蛋白和混合探針底物組成,有機溶劑的體積分數(shù)<1%[18]。

實驗組由孵育體系和穿破石提取液組成,穿破石提取液的質(zhì)量濃度分別為0.005,0.010,0.10,0.50,1.00,2.00,4.00 mg/mL。陽性對照組由孵育體系和單獨的陽性抑制劑組成,陽性抑制劑分別為磺胺苯吡唑0.50,2.00,4.00,16.00,20.00 μmol/L;睪酮0.10,0.50,10.00,20.00,60.00 μmol/L;α-萘黃酮0.10,0.50,1.00,10.00,20.00 μmol/L;氯美噻唑0.50,1.00,2.00,4.00,20.00 μmol/L。陰性對照組由孵育體系和與抑制劑等體積的PBS組成?？瞻讓φ战M除體系中使用滅活人肝微粒體,于95 ℃水浴中加熱5 min外,其余均與陰性對照組相同。

將上述孵育體系分別在37 ℃水浴條件下孵育5 min后,加入混合探針底物啟動反應,于37 ℃水浴條件下再共同孵育60 min;孵育結束,加入冰乙腈200 μL,超聲5 min混勻后,于離心機中在13 000 r/min下離心15 min;取60 μL上清液,與80 μL超純水混勻即得檢測樣品,取該樣品10 μL,按表2中所示條件進行超高效液相色譜分析。分析所用色譜柱為Acquity UPLC BEH C18柱,2.1 mm×100 mm,1.7 μm;流動相由水和乙腈組成,V(水)∶V(乙腈)=S∶Y,柱溫保持在30 ℃,由于探針底物的最大吸收波長不同,分別在245 nm和230 nm下檢測[19-20]。

在第十屆江蘇科技期刊“金馬獎”的評選中，《實用心電學雜志》榮獲“十佳創(chuàng)新團隊獎”。11月21日，在蘇州召開的2018江蘇省科技期刊學會學術年會上，江蘇省科技期刊學會向本刊頒發(fā)了獲獎證書。

表2 超高效液相色譜洗脫條件

2.3 數(shù)據(jù)處理及分析

以底物作為參考,根據(jù)剩余底物的相對峰面積,得到抑制率公式為

(1)

式中:K為抑制率;A0,A1和A2分別為空白組、實驗組和陰性組剩余底物的相對峰面積。將穿破石提取液、標準抑制劑的濃度轉換成對數(shù)值,然后用GraphPad Prism 8.0.1軟件繪制抑制率-濃度對數(shù)值的曲線,計算對CYP450酶活性抑制一半時所需的藥物或者抑制劑的濃度IC50。

2.4 方法學驗證

2.4.1 專 屬 性

為探究抑制實驗的專屬性,將實驗分為A,B,C 3組進行研究。A組為空白肝微粒體,以PBS替代,不加混合探針底物與抑制劑,其余操作按2.2節(jié)進行;B組向于95 ℃水浴中加熱5 min滅活的人肝微粒體中加入一定濃度的混合探針底物標準溶液,不加抑制劑,其余操作按2.2節(jié)進行;C組將一定濃度的混合探針底物標準溶液加入空白人肝微粒體中,不加抑制劑,其余操作按2.2節(jié)正常孵育。將所得樣品進行UPLC檢測后,專屬性結果如圖1色譜圖所示。由圖1(a)可知:在底物的出峰時間段里,空白肝微粒體中并沒有干擾性雜質(zhì)出現(xiàn)。圖1(b,c)中1號峰為非那西丁,2號峰為氯唑沙宗,3號峰為甲苯磺丁脲,4號峰為睪酮,對比可知:底物的出峰時間沒有太大的變化,說明肝微粒體并不會對底物的出峰時間產(chǎn)生干擾,專屬性良好。

圖1 專屬性實驗的UPLC譜圖

2.4.2 標準曲線、檢測限和定量限

將人肝微粒體進行滅活處理后,向其中加入不同濃度的混合探針底物標準溶液,按2.2節(jié)條件操作,并以底物的相對峰面積和濃度為坐標,制成標準曲線,回歸計算后得到4種底物的線性回歸方程,以信噪比S/N=10為定量限,S/N=3為檢測限,通過線性相關系數(shù)R2可以發(fā)現(xiàn)4種底物的線性關系良好,結果如表3所示。

表3 線性回歸方程

2.4.3 提取回收率和基質(zhì)效應

提取回收率的測定:按照標準曲線中的濃度范圍,選擇高、中、低3個濃度配制混合底物探針樣品,每個濃度平行3份,加入到于95 ℃水浴中加熱5 min滅活后的人肝微粒體中,按2.2節(jié)條件進行孵育后得到T1樣品,即正常孵育樣品;滅活處理人肝微粒體按2.2節(jié)條件孵育后,加入同樣配制的高、中、低3個濃度樣品,每個濃度平行3份,得到T2樣品,即不經(jīng)孵育樣品,將T1樣品與T2樣品濃度相除即可得到提取回收率。

基質(zhì)效應的測定:按照標準曲線中的濃度范圍,選擇高、中、低3個濃度配制混合底物探針樣品,每個濃度平行3份,加入到滅活后的人肝微粒體中,按2.2節(jié)樣品前處理條件操作后得到J1樣品,即基質(zhì)樣品;同樣配制高、中、低3個濃度的樣品,每個濃度平行3份,不加人肝微粒體,按2.2節(jié)樣品前處理條件操作后,得到J2樣品,即無基質(zhì)樣品,將J1樣品與J2樣品濃度相除即可得到基質(zhì)效應。

各底物的提取回收率良好,沒有明顯的基質(zhì)效應,且相對標準偏差值RSD均較低,結果如表4所示。

表4 回收率和基質(zhì)效應

2.4.4 日內(nèi)精密度和日間精密度

按照標準曲線中的濃度范圍,選擇高、中、低3個濃度配制混合底物探針樣品,每個濃度平行6份,加入到滅活后的人肝微粒體中,按2.2節(jié)條件操作后進樣,根據(jù)結果得到日內(nèi)精密度;連續(xù)測定3 d后,根據(jù)結果計算得到日間精密度。各底物的日內(nèi)精密度和日間精密度相對標準偏差值RSD均較低,結合相對準確度RE,說明該實驗方法可靠準確,重現(xiàn)性較好,結果如表5所示。

表5 精密度和準確度

2.4.5 穩(wěn)定性考察

按照標準曲線中的濃度范圍,選擇高、中、低3個濃度配制混合底物探針樣品,每個濃度平行操作6份,加入到滅活處理后的人肝微粒體中,分別置于自動進樣器中24 h,-4 ℃條件下冷藏24 h,凍融循環(huán)3次等條件下,均能保持穩(wěn)定[21]。采用UPLC對4種探針底物藥物進行檢測的方法穩(wěn)定、可靠,并具有較好的重現(xiàn)性,可用于評價本研究中的穿破石提取液質(zhì)量濃度對CYP450酶的影響,對臨床前的用藥狀況進行預測,確保用藥的安全性。

2.5 穿破石對人肝微粒體CYP450酶的抑制作用

根據(jù)抑制效果,可將化合物分為有效抑制化合物,即IC50≤10 μmol/L或≤20 μg/mL;中等抑制化合物,即10 μmol/L≤IC50≤50 μmol/L或20 μg/mL≤IC50≤100 μg/mL;弱抑制化合物,即IC50≥50 μmol/L或≥100 μg/mL[22-23]。根據(jù)統(tǒng)計學軟件GraphPad Prism 8.0.1對剩余底物峰面積的擬合計算結果,可以得到穿破石提取液質(zhì)量濃度對CYP450各亞型酶的抑制效果,如圖2所示。穿破石提取液對CYP1A2的IC50值為0.356 1 mg/mL,對CYP3A4的IC50值為0.332 4 mg/mL,對CYP2C9的IC50值為0.404 9 mg/mL,對CYP2E1的IC50值為0.861 5 mg/mL。

圖2 穿破石提取液對人肝微粒體細胞色素P450酶4種亞型的抑制曲線

通過擬合計算,可得陽性抑制劑對4種CYP亞型酶的抑制曲線,如圖3所示。α-萘黃酮對CYP1A2的IC50值為2.57×10-4mg/mL,酮康唑對CYP3A4的IC50值為9.21×10-3mg/mL,磺胺苯吡唑對CYP2C9的IC50值為1.95×10-3mg/mL,氯美噻唑對CYP2E1的IC50值為4.30×10-4mg/mL。4種陽性抑制劑的IC50均為參考值的正常范圍內(nèi),該孵育體系符合肝微粒體抑制活性實驗的要求。與陽性抑制劑對比,對4種人肝微粒體CYP450亞型酶來說,穿破石提取液均具有弱抑制性。

圖3 陽性抑制劑對4種CYP亞型酶的抑制效果

以穿破石在處方中一天的總用量為30 g,以一天兩次為例[16],則每次穿破石用量為15 g,按穿破石提取液制備時的提取率計算,水煎后最多能得到988.58 mg穿破石粗提物,按人體中的血液為5 L進行估算,可得血液中穿破石的質(zhì)量濃度為0.197 7 mg/mL,與計算得到的IC50值相比,其質(zhì)量濃度低于4種亞型酶的IC50值。從體外實驗的數(shù)據(jù)來看,一方面,說明穿破石提取液并不會對CYP450酶產(chǎn)生較大的抑制效果;另一方面,說明當其與這4種亞型酶的底物藥物聯(lián)用時,不會對底物藥物在肝中的代謝產(chǎn)生影響,底物藥物用藥治療時,同時服用穿破石,仍然可以正常地清除底物藥物,不會由于穿破石對CYP450酶的抑制活性而使底物藥物在體內(nèi)積累引起細胞毒性。

3 結 論

選擇CYP1A2,CYP3A4,CYP2C9,CYP2E1 4種亞型酶為研究對象,研究穿破石提取液對CYP450酶的酶活性抑制效果。通過混合底物探針法,建立人肝微粒體體外孵育體系,采用超高效液相色譜作為檢測手段,以剩余底物峰面積為指標進行計算,得到穿破石提取液對CYP450酶的抑制IC50值,并對含量測定方法進行方法學驗證,證明該方法靈敏度較高,穩(wěn)定性良好。與陽性抑制劑對比,可以看出:對這4種亞型酶來說,穿破石提取液均屬于弱抑制化合物。當穿破石與4種亞型酶的底物藥物進行聯(lián)用時,不會因為影響到底物藥物在體內(nèi)的代謝,導致藥物在體內(nèi)積累產(chǎn)生毒性,而產(chǎn)生明顯的藥物-藥物相互作用。本研究為穿破石在臨床上的用藥及藥物聯(lián)用安全提供了參考依據(jù),同時,研究所采用的方法,也可用于其他藥物臨床前用藥的評估,對于預測潛在的藥物相互作用,規(guī)避用藥風險,具有重要的意義。