李欣悅,李 倩,石桂英,黃藝瀅,雷雪裴,白 琳?

(1.中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心,國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室,北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術研究中心,北京 100021;2.北京師范大學生命科學學院,北京 100875)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種因多種致病因素引起胰島素分泌不足或胰島素抵抗而導致患者出現(xiàn)慢性高血糖為主要特征的代謝性疾病?；疾≡缙诳赏ㄟ^胰島素補充或促進胰島素分泌控制恢復血糖正常,晚期胰島β 細胞損傷嚴重導致功能衰竭,糖、脂類、蛋白質代謝紊亂,累積神經系統(tǒng)、心血管、腎、眼器官,導致糖尿病腦病、糖尿病腎病、視網膜病等繼發(fā)性并發(fā)癥[1]。 根據美國糖尿病學會(ADA)分型方法可為1 型糖尿病、2 型糖尿病、妊娠期糖尿病及特殊類型糖尿病。 2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM) 又稱為非胰島素依賴型糖尿病,由于胰島素抵抗的背景下β 細胞功能障礙,常伴隨胰島素分泌的逐漸減少[2]。 胰島素的低敏感促使葡萄糖在肝中產生增加,肌肉和脂肪組織中吸收減少,引發(fā)高血糖癥。 β 細胞功能缺陷影響了胰島素敏感組織之間的反饋調節(jié),造成葡萄糖穩(wěn)態(tài)失衡[3]。 2 型糖尿病占糖尿病患者總數的90% 以上,其病因多樣,致病機制尚不明確。

目前2 型糖尿病患者血糖控制方式主要為口服降糖藥物、外源性胰島素補充。 2 型糖尿病治療的一線藥物為二甲雙呱,且可在多藥物聯(lián)合治療中作為基礎用藥[4],可有效控制肝葡萄糖增加并改善外周胰島素抵抗。 對于二甲雙胍不適用的治療者,可聯(lián)合不同機制降糖藥物進行二聯(lián)治療或三聯(lián)治療[4]。 外源性胰島素補充主要用于1 型糖尿病的治療。 對于2 型后期患者隨病程進展,對二甲雙呱不適用或聯(lián)合胰島素促泌劑或α-糖苷酶抑制劑治療血糖仍不達標的患者,應加用基礎胰島素或預混胰島素進行多手段聯(lián)合控制,以減少并發(fā)癥的危險。 依賴外源性胰島素長期性注射的治療方式會發(fā)生耐藥性和急性低血糖的風險,對已經出現(xiàn)了廣泛耐藥性2 型重度患者可通過胰島移植治療。 對存在嚴重并發(fā)癥導致器官功能損傷如糖尿病腎病腎衰竭者,需通過透析及胰—腎聯(lián)合移植治療。 成功的同種異體移植可實現(xiàn)胰島功能恢復[5],為機體產生穩(wěn)定的胰島素提供了一種更長久的方法,但是它仍然面臨著供體缺乏和終身免疫抑制的挑戰(zhàn)。

糖尿病現(xiàn)階段治療仍受到終身服藥和低血糖癥風險的限制,近年來隨著干細胞逐漸被用于多種重大疾病的臨床治療,干細胞治療糖尿病的研究也取得較大成果。 通過功能性干細胞移植,修復胰島素抵抗組織,保護和再生胰島β 細胞,以長期穩(wěn)定恢復胰島素獨立性,改善胰島損傷的代謝紊亂[6]?？烧T導分化為胰腺β 細胞用于糖尿病治療的常見干細胞有:胚胎干細胞、成體干細胞及誘導性多能干細胞。 查詢ClinicalTrials.gov 有關干細胞治療2型糖尿病及其并發(fā)癥臨床試驗信息約76 項,在中國、印度、美國等國家已進入1 期/ 2 期臨床試驗階段,其中包括骨髓間充質干細胞、脂肪間充質干細胞、臍帶血間充質干細胞,大多數干細胞對2 型糖尿病治療的研究還處于實驗動物水平。 表1 列舉了幾項具有代表性的干細胞治療2 型糖尿病相關臨床研究項目。

1 胚胎干細胞治療

胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)是一類高度未分化的細胞,由早期胚胎或原始性腺中分離得到,可分化可形成體內不同類型細胞,發(fā)育成為內、中、外三個胚層的細胞組織,具有高度全能性,且在體外可長時間維持多能性和自我更新的能力。由于ESCs 在細胞移植治療中,具有低免疫原性,可以在體外經歷多系分化,并產生一系列分化良好的后代[7-8],因此被廣泛應用于多種疾病的治療中,并建立了多種動物的hESCs 細胞系。 研究早期對于ESCs 的異常增殖特性關注較少,將其直接注射到成年小鼠體內會產生畸胎瘤,可被視為條件性腫瘤細胞[9-10]。 近些年來,利用定向誘導ESCs 形成功能性β 細胞團[11]或胰島素分泌細胞(IPCs)已成為恢復胰島功能治療糖尿病的研究熱點。 Lumelsky等[12]通過五個階段誘導完成小鼠ESCs 向胰島β 細胞的分化,并皮下移植到到鏈脲佐菌素(STZ) 糖尿病小鼠測定ESCs 分化的胰島樣細胞團的生存能力及體內功能,移植后的糖尿病小鼠可維持體重的減輕并存活更長的時間,證明了細胞移植的總體效果有益糖尿病動物的恢復,通過對ESCs 的誘導分化可產生與天然胰島相同的生理效果,但這些細胞的胰島素表達量卻遠低于天然胰島的胰島素分泌水平,導致高血糖癥狀恢復不明顯。 Sui 等[13]用小鼠RIP-YFP 質粒構建體穩(wěn)定轉染未分化的ES 細胞系,測定了由ESCs 分化的胰腺內分泌細胞其胰腺特異性基因表達,發(fā)現(xiàn)這些胰島素分泌細胞共表達了INS1、INS2、Islet1、MafA、IA1 等胰島β 細胞的表型標志物,表明ESCs 分化的胰腺內分泌細胞與體內成熟的胰島β 細胞有相似的基因表達模式,建立了從ESCs 到胰腺內分泌細胞系的有效分化策略。同時還證明了鋅作為的介導細胞胰島素分泌上調的誘導劑可顯著促進誘導ESCs 向胰島素分泌細胞的分化,為ESCs 分化功能的調節(jié)提供了新思路。

ESCs 向胰島樣細胞分化用于治療糖尿病還存在多種問題: 細胞轉化效率低, 誘導分化產生的IPCs 數量有限;IPCs 胰島素分泌量少,其胰島素分泌功能僅能達到體內成熟胰島β 細胞的1 / 50;IPCs誘導周期長,從ESCs 分化至IPCs 需經歷向限定內胚層細胞、后部前腸細胞、胰腺內胚層細胞、胰島前體細胞的誘導過程,最終分化成為胰島素分泌細胞,此誘導周期需要約28～32 d。 因此,研究胚胎干細胞向胰島素分泌細胞方向分化調控機制,提高ESCs 來源的IPCs 分化效率,以獲得高濃度高純度的成熟胰島素,成為應用ESCs 治療糖尿病的重點問題。 目前已發(fā)現(xiàn)通過生長因子(如bFGF)及誘導因子激活素A ( Activin A)[14]、 丁酸鈉、 唾液素4(Exendin 4)、尼克酰胺(Nic)、轉錄因子PDX1 等可促進ESCs 向IPCs 的分化及成熟[11]。

ESCs 移植治療糖尿病的研究還處于臨床前階段,ESCs 的體外誘導分化機制尚未闡明,安全性還無法保證,且ESCs 用于臨床試驗的倫理問題還存在爭議,因此建立安全可靠的臨床級ESCs 系,有效解決異種移植排斥等技術問題有待進一步解決。

2 成體干細胞治療

2.1 胰腺干細胞治療

胰腺干細胞為能夠自我復制增殖的,未達到終末分化狀態(tài)的前體細胞群,能被定向誘導為具有胰島素分泌功能的類胰島細胞,形成胰島組織結構,維持血糖水平恒定[15]。 一直以來胰腺中存在具胰島再生潛能的祖細胞的說法并未得到驗證,2018 年Qadir 等[16]證實了成年人類胰腺中存在祖細胞,提出了導管和腺體網絡中特定的解剖位置,并證實了在特定刺激下其增殖分化為葡萄糖反應β 細胞的潛能。 目前胰腺干細胞的分離獲取主要來源于胰島實質、胰腺導管上皮及胰腺腺泡等組織[17]。 但對于胰腺干細胞的鑒定尚無統(tǒng)一方法,在其增殖分化不同生理階段,其分子標記物隨基因在不同時期的表達呈現(xiàn)一定差異,其細胞形態(tài)也存在改變[18]。 目前的研究中常采用胰腺細胞所表達的蛋白作為標志物對其鑒定,如胰十二指腸同源框基因-1(PDX-1)編碼的PDX1 蛋白、在發(fā)育過程中的胰腺內胚層上皮細胞存在高表達的細胞角蛋白19(CK19)、巢素蛋白(nestin)及神經元素3(NGN3)[19]。

表1 2 型糖尿病干細胞移植治療相關臨床研究Table 1 Clinical study on the treatment of type 2 diabetic stem cells

在胰腺干細胞治療中,移植部位的選擇仍需進一步研究。 劉智偉等[20]分別于門靜脈肝內手術移植胰島細胞和胰腺干細胞,對兩組移植大鼠血糖濃度、胰島素水平、血清C 肽水平進行監(jiān)測,并比較術后移植物數目、純度、活性及存活時間的差異。 實驗結果顯示,胰腺干細胞移植組較胰島細胞降糖作用緩慢,且胰島素分泌量低于胰島細胞移植組,但術后一段時間后隨胰島干細胞分化血糖水平明顯下降,胰島素分泌量持平。 經分離過程,胰腺干細胞與胰島細胞存活率相近但分離純度較低,移植晚期胰腺干細胞移植物仍可保持較長的存活時間,此時胰腺干細胞移植組胰島素分泌量高于胰島細胞移植組。 可推斷糖尿病大鼠胰腺干細胞移植治療效果優(yōu)于胰島細胞,具有持續(xù)降糖能力,且誘導分化后經門靜脈注射移植可更有效地發(fā)揮療效。

2.2 間充質干細胞治療

脂肪間充質干細胞 ( adipose derived mesenchymal stem cells,AD-MSCs) 在體外經多次傳代仍保持其多潛能性,可向脂肪細胞、神經細胞、心肌細胞、成骨細胞、軟骨細胞、胰島細胞等方向誘導分化,具有免疫調劑功能,取材簡單來源豐富,應用潛力巨大。 Cao 等[21]的研究中發(fā)現(xiàn),高脂飲食誘導的肥胖小鼠經靜脈注射脂肪來源的間充質干細胞后,體內葡萄糖水平維持在穩(wěn)態(tài),胰島素抵抗作用明顯降低。 Timper 等[22]將人源脂肪間充質干細胞分化為IPCs,表達出胰島素,生長抑素和胰高血糖素,并發(fā)現(xiàn)增殖的ADMSCs 存在胰島β 細胞發(fā)育轉錄因子PAX6 和IsL-1 的表達。

骨髓間充質干細胞( bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs) 移植排斥反應較弱,具有免疫調節(jié)及抗炎作用,在自身免疫病治療中有著重要地位,因此可能對于1 型糖尿病具有較好的治療作用。 有研究表明,在鏈脲佐菌素糖尿病的動物模型中,采用BMSCs 分化為胰島細胞或胰導管細胞進行治療可以有效降低血糖[23-24]。 Xie等[25]成功將人BM-MSCs 誘導分化為IPCs, 這些IPCs 表達了與胰島β 細胞發(fā)育及功能相關的多個基 因, 包 括Glut2、 PAX6、 巢 蛋 白、 PDX1, NGN3、NKX6.1、ISL-1、Beta2 / Neurod、胰島素和胰高血糖素。 Gabr 等[26]也通過移植成熟骨髓間充質干細胞控制鏈脲佐菌素裸鼠的糖尿病。

自體骨髓源性干細胞移植已進入臨床試驗階段。 2007 年,Bhansali 等[27]篩選10 名對三種口服抗糖尿病藥物(磺酰脲、二甲雙胍和TZD)均產生抵抗且病情持續(xù)時間達到5 年的T2DM 患者,通過股動脈途徑在十二指腸動脈處對其進行骨髓間充質干細胞移植治療。 治療6 個月后,胰島素需求減少了50%以上,HbA1c 降低,胰高血糖素刺激的C 肽水平有所改善,且沒有發(fā)現(xiàn)嚴重的不良反應。 表明自體骨髓源性干細胞移植有望作為改善T2DM 患者β 細胞功能的一種安全有效的治療方法。

臍帶血間充質干細胞( umbilical cord bloodderived mesenchymal stem cells,UCB-MSCs) 為中胚層發(fā)育而來的原始間充質細胞群,其具有與骨髓間充質細胞相似的生物學特征,但其增殖能力比骨髓來源的間充質細胞快數倍。 因其易快速增殖、具有多向分化潛能,且多來源于生產廢物,無倫理限制,具有重要臨床應用價值。 Gao 等[28]團隊在高葡萄糖,視黃酸,煙酰胺,表皮生長因子和exendin-4 的條件下,經15 d 將人臍帶血間充質干細胞體外分化為胰島樣細胞簇,分化后約9 d 開始表達相關胰腺細胞標志物,包括胰島素,胰高血糖素,Glut-2,PDX1,PAX4 和NGN3。 Sun 等[29]通過缺氧治療從臍帶血來源的間充質干細胞成功獲得了功能性IPCs,并闡明了缺氧誘導β 細胞的發(fā)育途徑,即低氧誘導時c-Met 啟動了MSCs 向IPCs 的早期分化,HGF 通過誘導NGN3 的表達調控IPCs 的完全分化,證明了c-Met 與HGF 之間的相互作用可增強MSCs 分化為IPCs 的功能,提高IPCs 的生存能力。

3 誘導性多能干細胞治療

誘導性多能干細胞( induced pluripotent stem cells,iPSCs)是一種細胞類型及表觀遺傳學同胚胎干細胞相似,具有自我更新和多向分化潛能的一類細胞類型,來源于普通體細胞,利用病毒載體導入特定轉錄因子誘導其發(fā)生轉化,重編程為具有多能性的細胞系。 目前研究中誘導iPSCs 定向分化為IPCs 的形式主要有兩種:一是于體外壞境下加入特定誘導因子誘導iPSCs 的定向分化;二是通過基因工程轉入調控胰島β 細胞的轉錄因子,促使iPSCs的分化形成。 Kunisada 等[30]結合五個hiPSCs 細胞系的研究發(fā)現(xiàn),激活素A 和GSK3β 抑制劑處理可有效增強內胚層分化,與視黃酸,骨形態(tài)發(fā)生蛋白抑制劑以及TGF-β 抑制劑聯(lián)合使用可誘導內胚層向胰腺干細胞的分化。 在此過程中,胰腺干細胞標記物PDX1 和NGN3 的表達顯著增加,大部分細胞抗PDX1 抗體呈陽性。 同時該團隊發(fā)現(xiàn)了幾種化合物,包括毛喉素,地塞米松和TGF-β 抑制劑,可誘導胰島素產生細胞從胰腺干細胞分化。 Gupta 等[31]在hiPSCs 細胞系的內源性NKX6.1 基因座中插入GFP報告基因,NKX6.1-GFPiPSC 報告了NKX6.1 在胰腺分化中的表達。 通過RNA 測序對基因表達譜分析并對細胞進行分選,結果表明來自分化的NKX6.1 陽性細胞與人自然β 細胞轉錄組圖譜極為相似。 王雷[32]采用PDX1、NeuroD 和MafA 修飾的iPSCs 對糖尿病小鼠進行移植治療,證明了移植后的鼠源iPSCs 基因胰島素表達上調。 而占小波[33]通過實驗證明了,Pdx1 通過激活其下游基因Ngn3 和Pax6 促進iPSCs向胰島素分泌性細胞分化。

iPSCs 相比較于胚胎干細胞應用于臨床治療更避免了倫理和移植問題。 有研究顯示,到2015 年對人類誘導多能干細胞(hPSCs)的研究就超過了人類胚胎干細胞(hESC) 的研究,并在此后逐年迅速增長,針對于特異性疾病臨床級別hESC 系也不斷被建立和維持[34]。 目前沒有針對T2DM 的hPSCs 臨床治療,而4 項有關hPSCs 制品VC-01 和VC-02 對T1DM 患者的安全性、耐受性和療效的臨床試驗已在美國和加拿大進入1 期/ 2 期臨床階段。 表2 列舉了以上幾種干細胞治療T2DM 的對比。4 總結與展望

表2 不同來源干細胞移植治療T2DM 的研究對比Table 2 Comparison of different sources of stem cell transplantation in the treatment of T2DM

糖尿病作為多因素導致的慢性代謝性疾病,伴隨著多種并發(fā)癥發(fā)生,治療藥物價格高昂、依賴性大且無法從根本上恢復胰島素獨立性。 2 型糖尿病為進展性疾病,隨自然病程發(fā)展對外源性血糖控制的依賴逐漸增大[4],且無法有效避免多組織病變的并發(fā)癥發(fā)生,存在著較大局限性。 隨著近年來干細胞研究的深入,通過干細胞移植療法恢復胰島功能給糖尿病的治療提供了全新思路。 干細胞具有高度全能性或多能性,可向著多種組織細胞分化,在體外可自我復制增殖,并維持與親代細胞相同的種群特征,利用其定向誘導分化為具有產生胰島素功能的胰島素分泌細胞可減輕甚至擺脫患者對胰島素的長期依賴。 現(xiàn)已研究發(fā)現(xiàn)多種誘導蛋白(Activin A,Exendin 4 等)轉錄因子(PDX1、PAX6 和IsL-1 等)對胰島細胞的成熟和誘導分化起到調控作用,但大部分干細胞分化、胰島細胞發(fā)育及其調控機制尚未得到解答,仍需進一步研究。

目前多種干細胞已在治療2 型糖尿病的相關研究中取得進展,包括了ESCs、PSCs、MSCs 及iPSCs。PSCs 分離困難;ESCs 和iPSCs 具有較強的增殖分化潛能,但ESCs 存在較大倫理限制,而iPSCs 由重編程得到,存在一定安全問題;MSCs 具有較高安全性,且作為成體干細胞避免了倫理爭議,但其細胞分離率、增殖效率較低并伴隨代次衰老。 干細胞用于T2DM 及并發(fā)癥治療的研究大部分還停留在臨床前階段,這些不同類型干細胞在作用機制上有所區(qū)別,如骨髓間充質干細胞側重于提高β 細胞的再生能力,通過細胞輸注刺激局部組織細胞再生,提供多種再生信號,增強修復作用,并改善炎癥誘發(fā)病變的恢復[37];而脂肪間充質干細胞側重于改善胰島素抵抗,提高胰島素敏感性,增加葡萄糖輸注率,降低肝臟葡萄糖的釋放[40]。

干細胞治療T2DM 的研究涉及多種方向,如優(yōu)化細胞分化方案、發(fā)現(xiàn)新的免疫調節(jié)方法、對間充質干細胞預處理促進巨噬細胞極化和自噬修復以改善代謝控制[37,41],及與基因編輯技術相結合,有望為患者帶來革命性的治療方法。

2 型糖尿病干細胞治療研究中,不同類型干細胞到IPCs 的分化仍缺少標準化的鑒定、誘導方法,且針對不同年齡段、不同臨床表現(xiàn)的患者,其移植細胞種類及移植方式的選擇仍需經大量長期的實驗觀察進行綜合判斷。 此外,對于2 型糖尿病移植治療過程中,還存在遷移并功能整合于受損組織的干細胞數量較少,輸注干細胞轉化為功能性細胞效率過低的問題,如何提高細胞胰島素分泌量、調節(jié)宿主免疫應答、保證遠期療效穩(wěn)定性及安全性問題也需更深入研究。 本文從不同類型的干細胞治療2型糖尿病的方法、優(yōu)缺點和研究進展等方面進行綜述,期望對2 型糖尿病及其并發(fā)癥致病機理研究、應用干細胞移植技術恢復胰島功能以及建立干細胞安全性和有效性的評價提供一定參考。