曾維星, 程 賢, 張笮晦, 畢良武*, 趙振東

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所;生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室;國家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點實驗室;江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室;江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210042; 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院;廣西中藥藥效研究重點實驗室,廣西 南寧 530200; 3.廣西庚源香料有限責(zé)任公司, 廣西 東興 538100)

Waksman和Cordon在1939年第一次利用微生物處理苜蓿(MedicagosativaLinn.)，揭開了生物預(yù)處理研究的序幕[1]。早先對生物預(yù)處理的研究主要包括微生物的篩選、生物預(yù)處理的工藝優(yōu)化[2]、生物預(yù)處理的作用機制研究[3]以及生物預(yù)處理的應(yīng)用。隨著生物預(yù)處理研究的發(fā)展，不斷涌現(xiàn)出微生物發(fā)酵技術(shù)在天然產(chǎn)物提取中的應(yīng)用[4]。以微生物發(fā)酵技術(shù)為預(yù)處理手段應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取主要利用了微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生纖維素酶等多種細(xì)胞壁水解酶，從而提高了天然產(chǎn)物提取率[5-7]。其中，生物酶是微生物發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用于天然產(chǎn)物提取的關(guān)鍵。伴隨著生物酶商業(yè)化生產(chǎn)的實現(xiàn)，生物酶輔助技術(shù)也被廣泛用于天然產(chǎn)物提取領(lǐng)域[8-11]。作者綜述了微生物發(fā)酵技術(shù)和生物酶處理技術(shù)2種生物預(yù)處理技術(shù)在天然產(chǎn)物提取中的作用機制和實際應(yīng)用，旨在顯著提升天然產(chǎn)物開發(fā)利用的技術(shù)水平，為實現(xiàn)肉桂(CinnamomumcassiaPresl)、油樟(Cinnamomumlongipaniculatum(Gamble) N. Chao ex H.W. Li)等具有中國特色的大宗天然資源的高效提取與利用研究提供參考。

1 生物預(yù)處理技術(shù)

1.1 微生物發(fā)酵技術(shù)

1.1.1發(fā)酵類型

1.1.1.1液態(tài)發(fā)酵 液態(tài)發(fā)酵首先是將原料粉碎后制備成液體培養(yǎng)基，然后將微生物菌株接種在培養(yǎng)基中，發(fā)酵液供分離提取。液態(tài)發(fā)酵技術(shù)具有菌體生長快速、生產(chǎn)周期短、宜于工業(yè)化生產(chǎn)、無季節(jié)性等特點。目前液態(tài)發(fā)酵技術(shù)多運用于抗生素、黃酮等天然產(chǎn)物提取的預(yù)處理階段。辛燕花課題組[12-13]以靈芝作為菌株，采用液態(tài)發(fā)酵技術(shù)處理銀杏葉，研究結(jié)果表明靈芝多糖和黃酮分別提高了1.98 倍和2.35倍；以靈芝作為菌株，在30 mL基礎(chǔ)發(fā)酵液、何首烏添加量為0.15 g、添加時間為發(fā)酵第3天、初始pH值8.0、發(fā)酵時間9 d，在此條件下靈芝總黃酮產(chǎn)量為20.74 mg/g，相比對照靈芝菌絲體(未添加何首烏)提高了3.23倍。

1.1.1.2固態(tài)發(fā)酵 固態(tài)發(fā)酵技術(shù)是將待提取原料直接作發(fā)酵基質(zhì)或粉碎后作為發(fā)酵基質(zhì)，利用1種或多種真菌為發(fā)酵菌種進行發(fā)酵。固態(tài)發(fā)酵與液態(tài)發(fā)酵的區(qū)別主要在于固態(tài)發(fā)酵體系含水量低且為自然發(fā)酵。因此固態(tài)發(fā)酵周期較長，過程復(fù)雜，缺乏質(zhì)量控制指標(biāo)，難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，其優(yōu)點在于成本低廉。王吉成等[14]以冠突散囊菌為發(fā)酵菌種，對桑葉進行固態(tài)發(fā)酵，最后使用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇進行提取，研究表明：發(fā)酵后桑葉提取物的總黃酮含量高于未發(fā)酵的桑葉總黃酮含量，對Fe2+的螯合能力顯著升高。李季文等[15]對黃芪-女貞子進行真菌固態(tài)發(fā)酵，成功富集了黃芪多糖。

1.1.2發(fā)酵原理 微生物發(fā)酵技術(shù)作為天然產(chǎn)物提取的生物預(yù)處理方式之一，其原理是借助微生物在適當(dāng)條件下對提取原料進行發(fā)酵處理，微生物生長代謝過程會產(chǎn)生豐富的生物酶，包括淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等，進而破壞植物原料的細(xì)胞壁。Brunecky等[16]研究表明厭氧真菌可以分泌高活性的纖維素酶、半纖維素酶、纖維小體等，可以協(xié)同分解利用結(jié)構(gòu)復(fù)雜的纖維素、半纖維素和果膠等物質(zhì)。這些高活力的生物酶是導(dǎo)致植物細(xì)胞壁降解、細(xì)胞間隙增加的有力工具。Wang等[17]研究表明厭氧真菌可以通過假根系統(tǒng)破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)使其變疏松，從而易于被其他微生物和水解酶降解。因此，發(fā)酵技術(shù)作為天然產(chǎn)物提取的預(yù)處理手段有助于促進植物有效成分的釋放及其在提取介質(zhì)中的擴散，從而增加了天然產(chǎn)物的提取效率，其作用機制如圖1所示。

圖1 發(fā)酵技術(shù)的作用機制Fig.1 Mechanism of fermentation technology

1.1.3影響因素 在實際應(yīng)用中，由于發(fā)酵菌種種類復(fù)雜，各種菌種代謝利用的物質(zhì)各不相同。為了發(fā)揮發(fā)酵技術(shù)在天然產(chǎn)物提取中的優(yōu)勢，菌種的選擇是關(guān)鍵。選擇菌種時要考慮菌種的遺傳性能可以保持穩(wěn)定；菌種本身無毒，也不會產(chǎn)生有毒物質(zhì)；菌種與天然產(chǎn)物共存時能正常生長。其次，菌種數(shù)量和發(fā)酵溫度、濕度、含氧量等環(huán)境因素對發(fā)酵過程都會產(chǎn)生較大影響。柏倩等[18]在進行銀杏葉發(fā)酵工藝優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，溫度和接種量對發(fā)酵過程的影響極顯著，pH值和發(fā)酵溫度對發(fā)酵過程的影響具有交互作用。同時發(fā)酵技術(shù)能否實現(xiàn)規(guī)范化、工業(yè)化應(yīng)用還依賴于質(zhì)量控制指標(biāo)的科學(xué)性。

1.2 生物酶處理技術(shù)

1.2.1作用機制 生物酶破壞植物細(xì)胞壁的實質(zhì)主要在于對纖維素的水解作用?；赗eese等[19]在1950年提出的C1-Cx假說。Wood等[20]在1986年提出了內(nèi)切和外切葡聚糖酶協(xié)同作用模型(圖2)，將水解過程分成4步：1) 內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶通過協(xié)同作用共同作用于纖維素表面[21]；2) 內(nèi)切葡聚糖酶通過水解β-1,4-葡萄糖苷鍵，截斷纖維素產(chǎn)生新的多糖鏈末端；3) 外切葡聚糖酶在多糖鏈末端水解β-1,4-葡萄糖苷鍵，進一步切割多糖鏈產(chǎn)生纖維二糖；4)β-葡萄糖苷酶作用于纖維二糖等寡聚糖，最終將纖維素降解為葡萄糖[21-23]。然而，成熟的植物細(xì)胞中也有木質(zhì)素，部分生物酶可降解木質(zhì)素，如白腐真菌分泌的胞外木質(zhì)素降解酶結(jié)合白腐真菌自身產(chǎn)生的H2O2觸發(fā)一系列自由基鏈反應(yīng)可以氧化降解木質(zhì)素[24-27]，乙二醛氧化酶、葡萄糖氧化酶和甲醇氧化酶也參與木質(zhì)素降解，但是目前其作用機制尚不明確[28]。

圖2 內(nèi)切和外切葡萄糖酶協(xié)同作用模型Fig.2 In-line and exo-glucose synergy model

1.2.2協(xié)同預(yù)處理 生物酶預(yù)處理技術(shù)同其他物理化學(xué)預(yù)處理技術(shù)組合成協(xié)同體系，可以達(dá)到高效率降解纖維素的效果。通常情況下，物理化學(xué)預(yù)處理先于生物酶預(yù)處理，先將纖維素的致密物理結(jié)構(gòu)損壞，伴隨著纖維出現(xiàn)斷裂或孔洞，其剛性及有序性降低，有助于生物酶在后期處理中占據(jù)位點。高大維等[29]采用冷凍預(yù)處理協(xié)同酶法提取靈芝中的多糖成分，提取液中多糖為1.05%，顯著優(yōu)于酶法提取(0.87%)。組合預(yù)處理協(xié)同技術(shù)具有良好的應(yīng)用前景，其組合多樣性有很大的開發(fā)空間，但其作用條件有待進一步研究和優(yōu)化。

2 生物預(yù)處理技術(shù)在天然產(chǎn)物提取中的應(yīng)用

2.1 微生物發(fā)酵技術(shù)在天然產(chǎn)物提取中的應(yīng)用

2.1.1揮發(fā)性成分的提取 魏文浩等[30]對番石榴葉進行固態(tài)發(fā)酵處理的研究表明：紅曲霉菌發(fā)酵番石榴葉促進了植物細(xì)胞中結(jié)合性多酚的釋放以及黃酮糖苷的水解，大大提高了總黃酮和總酚含量，同時使得有刺激性氣味的植物醇和β-石竹烯含量下降。李軍集等[31]以桂葉渣為原料進行液態(tài)發(fā)酵的研究顯示：發(fā)酵后桂葉渣的化學(xué)成分發(fā)生明顯變化，產(chǎn)生了其他具有揮發(fā)性芳香氣味的化學(xué)成分，如乙酸乙酯、己酸丁酯、δ-蓽澄茄烯等，使無味的桂葉渣具有了芳香氣味，并且發(fā)酵作用能夠有效地降解桂葉渣中的粗纖維。梁開朝等[32]利用微生物菌株M-5對K326煙葉進行發(fā)酵處理后，煙葉提取物中苯乙醇、丁酸乙酯等天然香精、精油成分顯著提高。該研究表明M-5菌株不僅可以進一步用于煙葉純化，還具有生產(chǎn)香精香料的能力。張笮晦等[33]利用微生物菌株XJ26的發(fā)酵液處理肉桂葉成功提取了肉桂醛等桂葉精油成分，并且在最優(yōu)工藝條件下，肉桂醛、香豆素和鄰甲氧基肉桂醛的得率分別為1.40%、0.73% 和0.92%，其中甲氧基肉桂醛的含量得率高于常規(guī)水蒸氣蒸餾法(0.11%)[34]。

2.1.2非揮發(fā)性成分的提取 天然產(chǎn)物中的非揮發(fā)性成分往往存在結(jié)構(gòu)復(fù)雜、含量低的特點，因此傳統(tǒng)提取方式無法滿足天然產(chǎn)物開發(fā)的需求。隨著生物技術(shù)的日益發(fā)展，發(fā)酵技術(shù)為解決這一問題提供了幫助。蘇貴龍等[35]采用非解乳糖鏈球菌FGM對黃芪的根、莖和葉進行發(fā)酵處理，研究表明該發(fā)酵技術(shù)可顯著提高黃芪根和莖中活性多糖、皂苷和黃酮的提取率?；檐遊36]用紅曲霉等對刺五加葉進行固態(tài)發(fā)酵配合超聲波輔助提取技術(shù)從刺五加葉中提取黃酮，研究表明黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)較發(fā)酵前提高32.37%。劉超等[37]使用酵母菌發(fā)酵黃芪后進行提取，發(fā)現(xiàn)酵母菌發(fā)酵處理后提取液中總黃酮的質(zhì)量濃度為0.89 g/L，相對于傳統(tǒng)水煎法有一定程度的提高。孫海等[38]利用復(fù)合酶解-酵母發(fā)酵對毛木耳進行預(yù)處理，回流提取毛木耳多糖得率為3.43%。

2.1.3毒性成分的降解 天然產(chǎn)物提取過程中伴隨著毒性成分的產(chǎn)生，包括毒性生物堿、毒性內(nèi)酯、刺激性芳香羧酸等。微生物發(fā)酵過程會將部分有毒成分分解轉(zhuǎn)化，從而降低天然產(chǎn)物的毒副作用。王身艷[39]研究表明扇菇菌液態(tài)發(fā)酵草烏，促使劇毒的烏頭堿、中烏頭堿以及次烏頭堿含量明顯降低，從而降低提取物毒性。邱海龍[40]使用扇番菌發(fā)酵番荔枝子，使提取液中鄰雙四氫呋喃內(nèi)酯的含量降低，間雙四氫呋喃內(nèi)酯的含量升高，從而降低整體毒性。

2.1.4高活性成分的產(chǎn)生 在發(fā)酵預(yù)處理過程中，微生物自身代謝產(chǎn)物會直接作用于部分天然產(chǎn)物，將其分解或修飾從而產(chǎn)生新的高活性化合物。因此，發(fā)酵技術(shù)能起到提高天然產(chǎn)物生物活性的效果。潘揚等[41]研究了馬錢子經(jīng)朱紅栓菌固態(tài)發(fā)酵后提取所得主要生物堿的化學(xué)成分，研究發(fā)現(xiàn)：相較于未經(jīng)發(fā)酵提取液，經(jīng)發(fā)酵預(yù)處理的提取液中新增了4種成分，利用化學(xué)結(jié)構(gòu)可以推斷新增成分為原有吲哚生物堿衍生而來；新增成分不僅保持了原型化合物的抗炎活性，且使其毒性明顯降低。

2.2 生物酶預(yù)處理技術(shù)在天然產(chǎn)物提取中的應(yīng)用

潘映橋等[42]以響應(yīng)面法優(yōu)化了酶輔助水蒸氣蒸餾法提取千層金精油的工藝。該研究通過果膠酶和纖維素酶的協(xié)同作用，分解千層金的細(xì)胞壁而釋放出植物精油，將千層金精油得率從0.91%(水蒸氣蒸餾法)提高至3.96%，解決了千層金精油水蒸氣蒸餾提取法產(chǎn)率低的弊端。張雪松等[43]采用β-葡萄糖苷酶-果膠酶復(fù)配對桂花進行酶處理，然后采用溶劑法提取桂花精油。該方法使精油得率相比未加酶的1.77%提高了55.37%，所得桂花精油的有效成分種類也同步增加，解決了水蒸氣蒸餾法高溫破壞植物細(xì)胞熱敏感成分的問題。叢贏[44]利用酶輔助提取油樟精油的研究表明混合酶預(yù)處理的油樟葉片下表皮表面損傷嚴(yán)重，氣孔幾乎不可見，因此減少了有效成分溶出阻力，對細(xì)胞壁的破壞更加徹底，使得酶輔助-水蒸氣蒸餾法提取油樟精油的得率(4.33%)是未經(jīng)酶預(yù)處理組的1.5倍。徐興堂等[45]分別采用半纖維素酶、纖維素外切酶、纖維素內(nèi)切酶及混合酶對興安落葉松針葉預(yù)處理后提取其精油，研究表明混合酶組預(yù)處理長安落葉松針葉后精油得率最高，為1.70%，相比未經(jīng)酶預(yù)處理組提高了38.20%。

對于天然產(chǎn)物中的非揮發(fā)性成分，傳統(tǒng)的溶劑提取法普遍存在耗時長、提取效率低的缺點。為了提高提取效率，生物酶預(yù)處理技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物中的非揮發(fā)性成分的提取。李佳妮等[46]將酶解輔助超聲波提取法應(yīng)用于藜麥多糖的提取，研究表明：纖維素酶能夠酶解藜麥細(xì)胞壁，超聲波的空化作用進一步促進細(xì)胞破碎，最終促使多糖的提取率(68.08%)比單一采用超聲波提取增加1.5倍。孟永海等[47]使用果膠酶預(yù)處理白術(shù)藥材后再進行超聲波提取，使白術(shù)總黃酮提取得率(3.485 mg/g)是無酶預(yù)處理的1.7倍。穆易君等[48]用纖維素酶預(yù)處理菠菜后再進行超聲波提取，研究表明：該方法對菠菜中總黃酮的提取得率(15.56%)比超聲波輔助提取的得率高出2.51%。楊紅艷等[49]用果膠酶酶解預(yù)處理加超聲波促進提取的方法從黃連中提取鹽酸小檗堿，提取率為96.30%，與傳統(tǒng)提取方法相比，有效提高了鹽酸小檗堿的提取率，節(jié)約了提取時間。生物酶預(yù)處理技術(shù)在醇、酯、黃酮等多類天然產(chǎn)物的提取中都有應(yīng)用，具體見表1(按提取物化學(xué)成分分類)。同時，該技術(shù)與多種提取手段結(jié)合后都有助于提取率的提高。

表1 生物酶預(yù)處理技術(shù)在天然產(chǎn)物提取中的應(yīng)用Table 1 Application of biological enzyme pretreatment technology in natural product extraction

續(xù)表1

綜上所述，生物酶輔助技術(shù)的主要優(yōu)勢為：1)生物酶輔助技術(shù)促進后續(xù)提取過程中提取效率的提高，對比直接提取，可以極大地縮短提取時間；2)生物酶預(yù)處理過程條件溫和、不存在或極少存在逆反應(yīng)；3)生物酶用量可以準(zhǔn)確控制，并且反應(yīng)過程專一性強，因此可以有序地控制整個預(yù)處理過程；4)商業(yè)化生產(chǎn)的生物酶種類明確，作用機制清晰，可根據(jù)實際需求進行篩選、組合。

生物酶輔助技術(shù)相較于發(fā)酵技術(shù)，能夠?qū)I(yè)、科學(xué)地控制生物酶用量，避免了菌株被抑制生長的問題，彌補了微生物發(fā)酵技術(shù)的不足。但是，目前已經(jīng)實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)的生物酶種類有限，因此生物酶輔助技術(shù)不能完全取代發(fā)酵技術(shù)。

3 展 望

近幾年天然產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、日用品等方面的應(yīng)用越來越受認(rèn)可。天然產(chǎn)物的提取分離是天然產(chǎn)物開發(fā)利用的前提，也是保證天然產(chǎn)物得率和品質(zhì)的關(guān)鍵步驟。隨著多學(xué)科的相互滲透和交叉，生物技術(shù)研究與天然產(chǎn)物研究的結(jié)合日益密切，微生物發(fā)酵技術(shù)和酶輔助技術(shù)已經(jīng)開始作為生物預(yù)處理手段，應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取分離。生物預(yù)處理技術(shù)能影響到天然產(chǎn)物利用率、化學(xué)成分和生物活性。目前存在的問題在于缺少先進的技術(shù)支持與規(guī)范的操作標(biāo)準(zhǔn)，這也是生物預(yù)處理重點研究和發(fā)展的方向。隨著天然產(chǎn)物應(yīng)用范圍的不斷擴大，天然產(chǎn)物開發(fā)的產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展，生物預(yù)處理技術(shù)在肉桂、油樟等大宗植物資源及其產(chǎn)物研究中將占有越來越重要的地位。