張慧，王艷艷，黃莉莉，毛子瑋，李廷利

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

胃炎具有病程長、復(fù)發(fā)性強的特征，給患者帶來了痛苦，其發(fā)病原因與生物、藥物、生理等多種因素相關(guān)。癥狀以惡心、腹痛、胃潰瘍等常見，病理切片可見胃黏膜上皮薄、肌層增生等[1]。吳茱萸-黃連藥對是治療胃腸疾病的經(jīng)典中藥藥對。吳茱萸和黃連藥對配伍，不同比例會形成不同的配方且應(yīng)用功效也不盡相同。吳茱萸與黃連藥對配伍以吳茱萸為君藥，配比6：1時組成反左金丸，以黃連為君藥配比6：1時組成左金丸，左金丸出自《丹溪心法·火六》以瀉熱為主，主要針對胃腸熱癥疾病，肝火犯胃引起的惡心，嘔逆等[2]。后人在左金丸的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良將其比例互換得到反左金丸、甘露散、茱萸丸。反左金丸以吳茱萸作為君藥，用于治療寒凝阻滯引起的胃脘疾病，甘露散以黃連吳茱萸2∶1，主治胃熱型胃腸疾病[3]，茱萸丸以黃連吳茱萸1∶1，主治虛寒型腹瀉下痢等胃腸疾病[4]。這些不同比例的吳茱萸黃連配伍都具有共同的藥理作用：對胃腸疾病可以抑制與胃酸分泌相關(guān)的激素以及中和胃蛋白酶等、促進(jìn)胃腸蠕動還可以抗幽門螺旋桿菌防止胃潰瘍發(fā)生[5-6]。

雖然吳茱萸和黃連在胃癌、胃潰瘍等胃腸疾病中研究較為廣泛[7-9]，臨床報道吳茱萸黃連治療胃炎有顯著的療效[10]，但是系統(tǒng)介紹吳茱萸-黃連藥對治療胃炎的機制研究較少，且研究靶點較為單一，故此本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，對吳茱萸-黃連藥對配伍治療胃炎機制進(jìn)行多靶點、多途徑進(jìn)行探討，為今后更深一步研究提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

數(shù)據(jù)庫TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform)、BankDrug、STITCH(Chemical Association Networks)、 Swiss Target Prediction、Uniprot、 GeneCards、OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)、TTD(Therapeutic Target Database)、HPO (Human Phenotype Ontology)、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫String、數(shù)據(jù)庫DisGeNET、基因本體論數(shù)據(jù)庫Bioconductor、韋恩圖安裝包Venny 2.1.0、繪圖安裝包colorspace、stringi等、R語言軟件R×64 3.6.1、軟件Cytoscape 3.7.2。

1.2 方法

1.2.1 吳茱萸-黃連藥對活性成分的篩選

活性成分的篩選主要為文獻(xiàn)結(jié)合數(shù)據(jù)庫TCMSP和BankDrug中查找獲得。篩選成分的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為OB%≥30，DL≥0.18[11]。TCMSP數(shù)據(jù)庫包含了499 味中草藥以及其化合物約300 000個成分，它的每個化合物都提供了關(guān)于人體吸收、分布、代謝(ADME)、OB、DL等相關(guān)性質(zhì)，為藥物活性成分的篩選和活性成分靶點的篩選提供了較為方便的平臺[7]。

1.2.2 吳茱萸-黃連藥對相關(guān)靶點的篩選

在數(shù)據(jù)庫TCMSP、STITCH、SwissTarget 輸入?yún)擒镙呛忘S連的活性成分，篩選出活性成分的作用靶點整理并導(dǎo)出，去重。然后在Uniprot中的Uniprot KB數(shù)據(jù)庫 Uniprot限定物種為Homo sapiens，然后再使用腳本程序?qū)?yīng)靶點進(jìn)行注釋校正為其官方名稱，收集整理得到藥物成分-靶點文檔，備用。

1.2.3 疾病相關(guān)靶點的篩選

在數(shù)據(jù)庫GeneCards、OMIM、TTD、HPO、Uniprot輸入“gastritis”進(jìn)行相關(guān)疾病的檢索，物種限定為人類，之后將全部相關(guān)基因?qū)С霾⑦x擇相關(guān)度大于等于2的靶點，收集整理成疾病靶點文檔，備用。

1.2.4 藥物-成分-靶點-疾病的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用R語言安裝韋恩圖安裝包Venny 2.1.0將成分-靶點文檔和疾病靶點文檔求交集繪制成韋恩圖，并得到成分-疾病文檔，將藥物-成分-靶點-疾病聯(lián)系建立起來。之后，在軟件Cytoscap 3.7.2輸入相關(guān)文件，繪制藥物-活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

我們檢索string網(wǎng)站，在選項種選擇多個蛋白選項，將上述關(guān)鍵靶點粘貼輸入String數(shù)據(jù)庫，物種限定為Homo sapiens，點擊繼續(xù)后得到蛋白互建PPI網(wǎng)絡(luò)，得到的PPI網(wǎng)絡(luò)圖關(guān)系線適中，故對網(wǎng)站默認(rèn)參數(shù)不進(jìn)行修改，設(shè)置默認(rèn)最低相互作用閥值“medium confidence”為0. 4，之后以將結(jié)果以tsv格式導(dǎo)出，從而得到蛋白相互作用關(guān)系PPI網(wǎng)絡(luò)圖。數(shù)據(jù)庫String 能夠查詢已知約九百六十萬蛋白之間的相互作用關(guān)系，預(yù)測蛋白與蛋白之間約十三億八千萬多種相互作用關(guān)系，為藥物作用靶點的篩選提供了方便[11]，此外，該數(shù)據(jù)庫還總結(jié)了實驗檢測、生物信息學(xué)方法預(yù)測得到的數(shù)據(jù)，為實驗開展提供依據(jù)。

1.2.6 基因本體論生物學(xué)過程分析(gene ontology，GO)、KEGG通路富集分析

先將關(guān)鍵靶點用腳本將symbol轉(zhuǎn)換為ID后，在R中進(jìn)行相關(guān)安裝包(colorspace，stringi)的安裝后，用R語言在Bioconductor平臺對關(guān)鍵靶點基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。導(dǎo)出保存GO富集分析表格、KEGG富集分析表格，KEGG通路圖[11]。

2 結(jié)果

2.1 吳茱萸-黃連藥對活性成分以及靶點的篩選

在數(shù)據(jù)庫TCMSP以及Bankdurg中分別輸入?yún)擒镙呛忘S連，設(shè)置OB≥30%，DL≥0.18對成分進(jìn)行篩選，吳茱萸篩選得29個，黃連篩選得到14個，兩者共同成分有2種，分別為berberine(小檗堿)、quercetin(槲皮素)。其中，去除沒有與胃炎靶點基因相對應(yīng)的成分，共篩選出符合條件的23個成分，吳茱萸是17個，黃連是8個，二者相同成分2個(見表1)。然后，將活性成分在數(shù)據(jù)庫TCMSP中的靶點整合得到一起，再從數(shù)據(jù)庫STITCH、數(shù)據(jù)庫SwissTarget 篩選相關(guān)活性成分的靶點，刪除相同的靶點，共得到79個活性成分靶點。

2.2 胃炎疾病靶點的篩選

在數(shù)據(jù)庫GeneCard、OMIM、TTD、HPO中輸入“gastritis”，得到胃炎疾病相關(guān)靶點后，去重，選取其中相關(guān)度大于等于2的靶點，共獲得233個疾病靶點。利用 R 語言安裝韋恩圖繪制包繪制韋恩圖，獲得共同基因18 個，分別為CASP3、VEGFA、EGFR、IL6、MYC、CCND1、ERBB2、PPARG、CASP8、ICAM1、PTGS1、BCL2、NFKBIA、BIRC5、GSTP1、PARP1、RASSF1、GSTM1。在數(shù)據(jù)庫DisGeNET中依次輸入這18個關(guān)鍵靶點得到關(guān)于這些靶點的相關(guān)信息(見表2)。這些靶點中CASP3、CCND1、CASP8、PTGS1、BIRC5、RASSF1，6個是屬于酶類；MYC、PPARG，2個屬于轉(zhuǎn)錄因子，其中PPARG還是一種受體；EGFR、BCL2，2個屬于受體類型；VEGFA屬于血管內(nèi)皮生長因子；IL6屬于細(xì)胞介素；以及ERBB2、ICAM1、NFKBIA、GSTP1、PARP1、GSTM1，6個未知類型的靶點基因。這些多類型的靶點基因說明吳茱萸-黃連藥對在治療胃炎疾病時不是單一途徑，這可能與中藥配伍相互作用的多成分，多靶點治療疾病的機制有關(guān)，符合中醫(yī)理論中的“整體觀念”，即人是一個有機的整體, 不僅包含了生理上、病理上的整體性還包括了診治上的整體性[12]。診斷疾病的處方更加要求各藥味協(xié)同發(fā)揮作用，以達(dá)到最好的治療效果。

表1 吳茱萸黃連活性成分篩選(OB≥30%，DL≥0.18)

表2 胃炎疾病關(guān)鍵靶點及類型

2.3 藥物-活性成分-關(guān)鍵作用靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

黃連與胃炎相關(guān)的作用靶點的活性成分有8個，分別為 berberine、berberrubine、(R)-canadine、berlambine、palmatine、coptisine、worenine、quercetin；吳茱萸與胃炎相關(guān)的作用靶點活性成分有17個，分別為rutaecarpine、isorhamnetin、beta-sitosterol、Rutalinidine、dihydrorutaecarpine、Evodiamine、1-(5,7,8-trimethoxy-2,2-dimethylchromen-6-yl)ethanone、hydroxyevodiamine、6-OH-Luteolin、Evodiamide、Goshuyuamide I、Goshuyuamide II、Gossypetin、Gravacridoneshlirine、N-(2-Methylaminobenzoyl)tryptamine、quercetin、berberine。其對胃炎作用靶點對應(yīng)的共同活性成分為 berberine、quercetin，將吳茱萸-黃連藥對藥味名稱、活性成分mol ID 號、疾病名稱、與胃炎相關(guān)的關(guān)鍵靶點名稱，輸入Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化(見圖1)。平行四邊形代表胃炎疾病，長方形代表吳茱萸-黃連藥對藥味黃連和吳茱萸，三角形代表活性成分，橢圓形代表靶點，相關(guān)連線代表二者之間的相互作用關(guān)系。如圖2所示，結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)中有75個節(jié)點和89條邊，連線代表二者之間相關(guān)，其中PTGS1與多種活性成分相關(guān)，推測為胃炎關(guān)鍵靶點。

圖1 吳茱萸-黃連藥對活性成分及胃炎關(guān)鍵作用靶點網(wǎng)絡(luò)

2.4 關(guān)鍵靶點基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

將吳茱萸-黃連藥對治療胃炎的18個潛在的關(guān)鍵靶點基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫平臺，設(shè)置物種為人類，獲取蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，得到各蛋白相互作用圖(見圖2)。網(wǎng)絡(luò)中包含了18個節(jié)點以及86條邊，其中前五個連線最大的基因為MYC、CASP3、CCND1、EGFR、CASP8。平均節(jié)點度為9.56，推測這些靶點基因為吳茱萸-黃連藥對治療胃炎的關(guān)鍵靶點。

圖2 吳茱萸-黃連藥對抗胃炎相關(guān)基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 吳茱萸-黃連藥對治療胃炎的關(guān)鍵靶點基因GO分析

GO富集分析顯示，吳茱萸-黃連藥對中的18個關(guān)鍵靶點基因選取錯誤率P<0.05的前20個功能信息(見表3)發(fā)現(xiàn)，吳茱萸-黃連藥對活性成分治療胃炎所涉及到的功能主要有對不同蛋白的結(jié)合,其中有蛋白磷酸酶、谷胱甘肽結(jié)合、細(xì)胞因子受體、凋亡受體、生長因子受體以及與過氧化氫受體有關(guān)的受體，腫瘤壞死因子家族受體等。其次還有與激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合功能、跨膜轉(zhuǎn)運蛋白酶的功能、磷脂酶激活功能、 依賴于細(xì)胞周期蛋白的絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑功能、NAD+ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶功能等。

表3 吳茱萸-黃連藥對治療胃炎基因具有的GO功能信息

續(xù)表3

2.6 吳茱萸-黃連藥對治療胃炎的關(guān)鍵靶點KEGG分析

通路富集選取發(fā)生錯誤率P<0.05的前20相關(guān)通路(見表4)發(fā)現(xiàn)，與吳茱萸-黃連藥對治療胃炎相關(guān)的通路主要有HIF-1信號通路、腫瘤壞死因子TNF信號通路。此外，吳茱萸-黃連藥對治療胃炎還和結(jié)腸直腸癌、膀胱癌、小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、艾巴氏病毒感染、人類巨細(xì)胞病毒感染、癌癥微型病毒、乙型肝炎、丙型肝炎、多種細(xì)胞凋亡通路、酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路、癌癥的蛋白聚糖通路、軍團菌病通路有關(guān)。說明吳茱萸-黃連藥對在治療胃炎過程中不止依賴于單一通路，而且還從不同疾病的通路著手，對胃炎進(jìn)行多方面治療，這為吳茱萸-黃連藥對預(yù)防和治療胃炎提供了新的方案。

表4 吳茱萸-黃連藥對治療胃炎疾病的關(guān)鍵靶點KEGG通路分析

3 討論

2015版《中國藥典》記載吳茱萸味辛、苦，熱；有小毒。歸肝、脾、胃、腎經(jīng)。功能與主治有散寒止痛，降逆止嘔，助陽止瀉。用于厥陰頭痛，寒疝腹痛，寒濕腳氣，經(jīng)行腹痛，脘腹脹痛，嘔吐吞酸，五更泄瀉。吳茱萸主要生物活性成分為生物堿類，包括吳茱萸堿、去氫吳茱萸堿、小檗堿等，其主要藥理作用是可以增強心肌收縮力，抗再灌注引起的心肌缺血性心率失常，對胃腸產(chǎn)生抗炎鎮(zhèn)痛影響[13-15]。黃連味苦，寒。歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng)。功能與主治有清熱燥濕，瀉火解毒。用于濕熱痞滿，嘔吐吞酸，瀉痢，黃疸，高熱神昏，心火亢盛，心煩不寐，心悸不寧，血熱吐衄，目赤，牙痛，消渴，癰腫疔瘡；外治濕疹，濕瘡，耳道流膿。黃連的主要生物活性成分也是生物堿，如小檗堿、黃連堿、掌葉防己堿等。黃連的藥理作用主要以抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗病毒為主[16-17]。本文對吳茱萸-黃連藥對治療胃炎成分篩選后發(fā)現(xiàn)，從吳茱萸中篩選出吲哚類生物堿8個(rutaecarpine、Evodiamine、Goshuyuamide I、Goshuyuamide II、N-(2-Methylaminobenzoyl)tryptamine 、hydroxyevodiamine、dihydrorutaecarpine、berberine)，酰胺類1個(Evodiamide)，黃酮類成分4個(isorhamnetin、quercetin、6-OH-Luteolin、Gossypetin)，揮發(fā)油2個(beta-sitosterol、Rutalinidine)，其他類2個(1-(5,7,8-trimethoxy-2,2-dimethylchromen-6-yl)ethanone、Gravacridoneshlirine)。從黃連中篩選的活性成分除槲皮素屬于黃酮類(quercetin)成分，其他7個成分(berberine、berberrubine、(R)-canadine、berlambine、palmatine、coptisine、worenine)均為生物堿。研究證實，吳茱萸與黃連二者配伍后水煎液中吳茱萸生物堿含量溶出減少，而吳茱萸酰胺、次吳茱萸堿等成分則溶出增強，部分揮發(fā)油含量也有所增加，且檢測出了二者單煎液中未有成分[18]。在二者配伍對胃腸疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，吳茱萸-黃連藥對水煎液及生物堿成分均具有抗胃潰瘍作用，可以減少胃黏膜的充血、出血和糜爛, 減少黏膜層和黏膜下層的炎性細(xì)胞浸潤，但是生物堿組則優(yōu)于水煎液組，其胃黏膜損傷抑制率達(dá)到81.14%。在建立的寒熱大鼠胃黏膜損傷模型中，吳茱萸-黃連藥對均可以抑制幽門螺旋桿菌、促進(jìn)胃黏膜修復(fù)、炎癥因子IL-8，腫瘤壞死因子TNF-α含量也明顯降低[19]，因此，推斷吳茱萸-黃連藥對治療胃炎的主要有效成分是生物堿，對不同證候的胃炎均有作用[20]。

通過預(yù)測吳茱萸-黃連藥對與胃炎疾病共有靶點基因是CASP3、EGFR、IL-6、MYC、CCND1等共18個。CASP3參與caspase的激活級聯(lián),負(fù)責(zé)凋亡的執(zhí)行[21]。EGFR 是表皮生長因子受體，IL-6是細(xì)胞介素，研究發(fā)現(xiàn)，在辣椒煎液復(fù)制的胃熱型大鼠模型中，給藥左金丸組明顯減低IL-2、IL-6、IL-1β含量，顯著增加血清中谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、還原型谷胱甘肽、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等抗氧化相關(guān)的酶含量[22]。而本文在對吳茱萸-黃連藥對治療胃炎基于 GO 功能富集化分析中發(fā)現(xiàn)，吳茱萸-黃連藥對活性成分治療胃炎所涉及到的功能主要有對不同蛋白的結(jié)合,其中有蛋白磷酸酶、谷胱甘肽、細(xì)胞因子受體、凋亡受體、血管內(nèi)皮生長因子受體以及與過氧化氫受體有關(guān)的受體，腫瘤壞死因子家族受體等，說明吳茱萸-黃連藥對在治療胃炎疾病時主要功能是抗胃黏膜氧化損傷，抑制炎癥因子的產(chǎn)生，修復(fù)胃黏膜表皮細(xì)胞。

關(guān)鍵靶點基因通路(KEGG)分析發(fā)現(xiàn)吳茱萸-黃連藥對治療胃炎還和結(jié)腸直腸癌、膀胱癌、小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、艾巴氏病毒感染、人類巨細(xì)胞病毒感染、癌癥微型病毒、乙型肝炎、丙型肝炎、多種細(xì)胞凋亡通路、酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路、癌癥的蛋白聚糖通路、軍團菌病通路、HIF-1信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等相關(guān)。尤其以HIF-1信號通路最為重要，HIF-1信號通路參與生物發(fā)育、代謝、貧血、損傷修復(fù)等生理和病理生理過程，HIF-1(低氧誘導(dǎo)因子-1)是感知低氧的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，其在神經(jīng)干細(xì)胞增值中有著重要作用[23]，這為胃炎發(fā)病過程中胃黏膜損傷的治療提供了可能性。此外，在基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討吳茱萸-黃連藥對治療胃癌、高血壓、胃潰瘍等胃腸疾病時[11，24-26]涉及到很多相類似的信號通路及功能。這使得吳茱萸-黃連藥對作用不同疾病時會通過相同的作用機制，其基本功能主要從抗氧化、抗損傷、增強機體自身修復(fù)、啟動相關(guān)凋亡程序及凋亡因子清除機體障礙，這也使得吳茱萸-黃連藥對成為治療癌癥的潛在藥物。但是這些推測的作用通路還有待于后期實驗更進(jìn)一步驗證。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從理論上初步分析了吳茱萸-黃連藥對治療胃炎的主要活性成分為生物堿類，通過HIF-1信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等發(fā)揮抗氧化、抗損傷、抑制炎癥因子產(chǎn)生等作用。結(jié)果提示吳茱萸-黃連藥對在胃炎治療過程中運用多通路聯(lián)合協(xié)同方式，為胃炎的防治和治療提供了可行性理論指導(dǎo)以及對今后的胃炎研究提供了新思路。